本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种抗菌性脱细胞真皮基质敷料的制备方法。
背景技术：
表皮、真皮、皮下组织共同构成了人体的皮肤结构，皮肤作为人体中最重要的器官之一，覆盖在人体表面，具有防御功能、感知功能、免疫功能、吸收功能、调节体温功能、排泄功能和分泌等功能。当人体皮肤受到损伤，特别是皮肤烧伤，烧伤后容易引起机体各种损害，比如免疫系统失调、水分和蛋白质及其他细胞成分过度散失、新陈代谢加剧等，烧伤严重的还会危及生命。因此，伤后必须用创伤敷料将创面覆盖，临时起到皮肤屏障保护作用，并能促进创面愈合，这对大面积烧伤尤其重要。
脱细胞真皮基质敷料就是一种可以用于全层皮肤缺损的真皮替代物以及用于烧伤等皮肤损伤创面愈合的医用敷料，它是天然皮肤经过一系列处理去除了表皮和真皮中的细胞成分，但保留了真皮细胞外基质成分和其三维空间结构，这样的结构可以为皮肤再生提供“真皮模板”，诱导移植后宿主细胞成分如成纤维细胞、内皮细胞等在支架结构中分化、生长。但传统方法制得的脱细胞真皮基质（ADM）敷料存在渗透性差、抗菌性能低、生物相容性差等缺点，这严重限制了脱细胞真皮基质敷料在临床上的广泛应用。
技术实现要素：
本发明针对现有技术中存在的上述缺点，提出一种制备具有抗菌性的脱细胞真皮基质敷料的制备方法，其特点在于采用健康哺乳动物皮肤为原料，依次经过剔除毛发、制备断层皮片、激光制孔、消毒灭菌、低温冻融、超声波振荡、脱脂处理、脱细胞处理、浸泡水溶性壳聚糖、冷冻干燥、包装和辐照灭菌后得到抗菌性脱细胞真皮基质敷料。具有胶原三维结构完整，脱细胞彻底，制作周期短并且具有抗菌功能的特点。
本发明所提供的上述一种抗菌性脱细胞真皮基质敷料的制备方法，包括以下步骤：
对剥离的哺乳动物皮肤进行剔除毛发的处理；
利用取皮器将处理好的动物皮肤制成厚度为0.5mm~1.5mm断层皮片；
采用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，所得孔均匀分布，其中孔径0.1mm~0.5mm，孔距1.5mm~2.5mm；
采用辐照灭菌技术对含孔的真皮基质进行消毒灭菌，其中钴60辐照剂量为25kGy~50kGy，辐照时间为10h~15h；
将消毒灭菌后的真皮基质置于-30℃~-50℃的超低温冰箱中预冷冻2~3h，再在-70℃~-80℃的超低温冰箱中预冷冻2~3h后取出，置于37℃水浴中解冻1h，反复2~4次；
将冻融处理的真皮基质加入缓冲液中并用超声波进行震荡清洗，其中超声波震荡处理的频次为3~7次，每次30分钟；
用质量浓度为0.8%~2.0% NaOH溶液和质量浓度为0.1%~0.6%表面活性剂混合液对清洗后的真皮基质进行脱脂处理；
用浓度为0.2%~3.0% TritonX-100对脱脂后的真皮基质进行脱细胞处理；
将脱细胞真皮基质浸泡于浓度为0.5mg/ml~2.5mg/ml的水溶性壳聚糖溶液中；
将上述浸泡过壳聚糖溶液的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，成型包装、再经辐照消毒灭菌，即成抗菌性脱细胞真皮基质敷料成品。
本发明的优点在于：
所制得的抗菌性脱细胞真皮基质敷料脱细胞彻底，抗原性低；
利用激光制孔技术所获得的均匀分布微孔真皮基质利于脱细胞、脱脂以及浸泡水溶性壳聚糖后续处理；
制备过程中未使用固定剂、交联剂等，使得制得的脱细胞真皮基质保留完整的网络空间结构；
冷冻干燥过程中采取的梯度预冷冻程序保证得到的脱细胞真皮基质力学性能好且可以很好的维持网络空间结构；
脱脂处理使用的是阴离子表面活性剂，可以更好的达到脱去脂肪的目的；
在脱细胞真皮基质中复合具有抗菌功能的壳聚糖，不仅增加了脱细胞真皮基质敷料的抗菌性而且可以增强脱细胞真皮基质的止血性能以及促进伤口愈合性能。
具体实施方式
实施例一
剥离健康新生猪皮肤，剔除毛发；用取皮器将处理好的新鲜猪皮制成厚度为0.8mm断层皮片；用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，孔径0.3mm，孔距2mm；再用钴60对断层皮片进行辐照消毒灭菌，剂量为30kGy，辐照时间为12h；将消毒灭菌后的真皮基质置于-40℃的超低温冰箱中预冷冻3h，再在-75℃的超低温冰箱中预冷冻3h后取出，置于37℃水浴中解冻1h，反复冻融3次；将冻融处理的真皮基质加入缓冲液中并用超声波进行震荡清洗，其中超声波震荡处理的频次为5次，每次30分钟；再用质量浓度为1.0% NaOH溶液和质量浓度为0.4%十二烷基硫酸铵阴离子表面活性剂混合液对清洗后的真皮基质进行脱脂处理；再用浓度为1.0% TritonX-100对脱脂后的真皮基质进行脱细胞处理；再将脱细胞真皮基质浸泡于浓度为1.5mg/ml的水溶性壳聚糖溶液中；最后将上述浸泡过壳聚糖溶液的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，成型包装、再经辐照消毒灭菌，即成抗菌性脱细胞真皮基质敷料成品。
实施例二
剥离健康新生猪皮肤，剔除毛发；用取皮器将处理好的新鲜猪皮制成厚度为0.5mm断层皮片；用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，孔径0.1mm，孔距1.5mm；再用钴60对断层皮片进行辐照消毒灭菌，剂量为25kGy，辐照时间为10h；将消毒灭菌后的真皮基质置于-30℃的超低温冰箱中预冷冻2h，再在-70℃的超低温冰箱中预冷冻2h后取出，置于37℃水浴中解冻1h，反复冻融2次；将冻融处理的真皮基质加入缓冲液中并用超声波进行震荡清洗，其中超声波震荡处理的频次为3次，每次30分钟；再用质量浓度为1.0% NaOH溶液和质量浓度为0.1%脂肪醇羟乙基磺酸钠阴离子表面活性剂混合液对清洗后的真皮基质进行脱脂处理；再用浓度为0.2% TritonX-100对脱脂后的真皮基质进行脱细胞处理；再将脱细胞真皮基质浸泡于浓度为0.5mg/ml的水溶性壳聚糖溶液中；最后将上述浸泡过壳聚糖溶液的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，成型包装、再经辐照消毒灭菌，即成抗菌性脱细胞真皮基质敷料成品。
实施例三
剥离健康新生猪皮肤，剔除毛发；用取皮器将处理好的新鲜猪皮制成厚度为1.5mm断层皮片；用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，孔径0.5mm，孔距2.5mm；再用钴60对断层皮片进行辐照消毒灭菌，剂量为50kGy，辐照时间为15h；将消毒灭菌后的真皮基质置于-50℃的超低温冰箱中预冷冻3h，再在-80℃的超低温冰箱中预冷冻3h后取出，置于37℃水浴中解冻1h，反复冻融4次；将冻融处理的真皮基质加入缓冲液中并用超声波进行震荡清洗，其中超声波震荡处理的频次为7次，每次30分钟；再用质量浓度为2.0% NaOH溶液和质量浓度为0.6%十二烷基磷酸酯阴离子表面活性剂混合液对清洗后的真皮基质进行脱脂处理；再用浓度为3.0% TritonX-100对脱脂后的真皮基质进行脱细胞处理；再将脱细胞真皮基质浸泡于浓度为2.5mg/ml的水溶性壳聚糖溶液中；最后将上述浸泡过壳聚糖溶液的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，成型包装、再经辐照消毒灭菌，即成抗菌性脱细胞真皮基质敷料成品。
对照例一
剥离健康新生猪皮肤，剔除毛发；用取皮器将处理好的新鲜猪皮制成厚度为0.8mm断层皮片；用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，孔径0.3mm，孔距2mm；再用钴60对断层皮片进行辐照消毒灭菌，剂量为30kGy，辐照时间为12h；将消毒灭菌后的真皮基质置于-75℃的超低温冰箱中预冷冻3h后取出，置于37℃水浴中解冻1h，反复冻融3次；将冻融处理的真皮基质加入缓冲液中并用超声波进行震荡清洗，其中超声波震荡处理的频次为5次，每次30分钟；再用质量浓度为1.0% NaOH溶液和质量浓度为0.4%十二烷基硫酸铵阴离子表面活性剂混合液对清洗后的真皮基质进行脱脂处理；再用浓度为1.0% TritonX-100对脱脂后的真皮基质进行脱细胞处理；再将脱细胞真皮基质浸泡于浓度为1.5mg/ml的水溶性壳聚糖溶液中；最后将上述浸泡过壳聚糖溶液的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，成型包装、再经辐照消毒灭菌，即成抗菌性脱细胞真皮基质敷料成品。
对照例二
剥离健康新生猪皮肤，剔除毛发；用取皮器将处理好的新鲜猪皮制成厚度为0.8mm断层皮片；用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，孔径0.3mm，孔距2mm；再用钴60对断层皮片进行辐照消毒灭菌，剂量为30kGy，辐照时间为12h；将消毒灭菌后的真皮基质置于-40℃的超低温冰箱中预冷冻3h，再在-75℃的超低温冰箱中预冷冻3h后取出，置于37℃水浴中解冻1h，反复冻融3次；将冻融处理的真皮基质加入缓冲液中并用超声波进行震荡清洗，其中超声波震荡处理的频次为5次，每次30分钟；再用质量浓度为1.0% NaOH溶液和质量浓度为0.4%季铵盐阳离子表面活性剂混合液对清洗后的真皮基质进行脱脂处理；再用浓度为1.0% TritonX-100对脱脂后的真皮基质进行脱细胞处理；再将脱细胞真皮基质浸泡于浓度为1.5mg/ml的水溶性壳聚糖溶液中；最后将上述浸泡过壳聚糖溶液的脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，成型包装、再经辐照消毒灭菌，即成抗菌性脱细胞真皮基质敷料成品。
对照例三
剥离健康新生猪皮肤，剔除毛发；用取皮器将处理好的新鲜猪皮制成厚度为0.8mm断层皮片；用激光打孔技术对断层皮片进行制孔，孔径0.3mm，孔距2mm；再用钴60对断层皮片进行辐照消毒灭菌，剂量为30kGy，辐照时间为12h；将消毒灭菌后的真皮基质置于-40℃的超低温冰箱中预冷冻3h，再在-75℃的超低温冰箱中预冷冻3h后取出，置于37℃水浴中解冻1h，反复冻融3次；将冻融处理的真皮基质加入缓冲液中并用超声波进行震荡清洗，其中超声波震荡处理的频次为5次，每次30分钟；再用质量浓度为1.0% NaOH溶液和质量浓度为0.4%十二烷基硫酸铵阴离子表面活性剂混合液对清洗后的真皮基质进行脱脂处理；再用浓度为1.0% TritonX-100对脱脂后的真皮基质进行脱细胞处理；再将脱细胞真皮基质放入冷冻干燥机进行冷冻干燥，成型包装、再经辐照消毒灭菌，即成脱细胞真皮基质敷料成品。
实施例四：力学性能测试
取实施例一和对照例一得到的抗菌性脱细胞真皮基质敷料进行力学性能测试，按QB/T 2710-2005 《皮革 物理和机械试验 抗张强度和伸长率的测定》进行检测，将拉力试验机上下夹具之间的距离调整为50mm（标准试样）或100mm（大号试样），用夹具夹住试样，确保试样粒面在同一平面上，并测量上下夹具之间的距离L0（准确至0.5mm），开动拉力试验机，直至试样断裂，并记录断裂时的最大力值作为断裂力F以及试样断裂时夹具间的距离，作为试样断裂时的长度L1。试样的拉伸强度，其中为试样的宽度，为试样的厚度。试样的断裂伸长率。
结果如下表：
实施例五：脂肪含量测试
取实施例二和对照例二得到的抗菌性脱细胞真皮基质敷料进行脂肪含量测试，按GB/T 9695.7-2008《肉与肉制品 总脂肪含量测定》规定的方法进行检测，结果如下表：
实施例六：抗菌性测试
取实施例三和对照例三得到的脱细胞真皮基质敷料进行抗菌性测试，具体方法如下：
将实施例三得到的抗菌性脱细胞真皮基质敷料剪成2.0cm×2.0cm大小，置于无菌锥形瓶中作为样片组，并按上述方法将对照例三得到的基质敷料作为对照样片组。将2组分别加入70mL磷酸盐缓冲液（0.03mol·L-1）和5mL金黄色葡萄球菌（或白色念球菌或大肠杆菌）的菌液，待液体渗入培养基中后，37℃培养12-24小时，进行菌落计数。
抑菌率计算公式：,其中X为抑菌率，A为试样品振荡前平均菌落数，B为试样品振荡后平均菌落数。结果如下表：
从实施例4~6的测试结果分析可知，本发明抗菌性脱细胞真皮基质敷料与对照组相比，其力学性能好、脂肪脱去彻底且具有优异的抗菌性。
应当指出的是，具体实施方式只是本发明比较有代表性的例子，显然本发明的技术方案不限于上述实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员，以本发明所明确公开的或根据文件的书面描述毫无异议的得到的，均应认为是本专利所要保护的范围。