索拉菲尼联合CCR4拮抗剂在抑制癌生长及转移中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及索拉菲尼与CCR4拮抗剂联合治疗在抑制癌生长及转移中的应用。

背景技术：

索拉非尼(sorafenib)是一种口服的多激酶抑制剂，可以有效抑制肿瘤细胞增殖和新生血管生成，对肝癌、肾癌的治疗效果显著，在非小细胞肺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症的治疗研究中亦有报道。

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，具有恶性度高、进展快、预后差的特点，严重威胁着人类健康和生命安全。中国是全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家，肝癌患者约占全球的55％。近年来，肝癌在全球的发病率都呈上升趋势，而中国新增癌症病例高居世界第一位，其中肝癌的新增病例和死亡人数均居世界首位。由于肝脏具有丰富的血流供应，因此，血管转移是最重要的肝癌转移途径。有报道称，90％以上的癌症患者死于癌转移。目前国内外应用于治疗肝癌血管转移的有效药物很少，因此，深入开展肝癌血管转移的药物防治研究具有重要意义。

索拉菲尼是FDA批准的第一个也是目前唯一一个用于治疗晚期肝癌的一线靶向药物。SHARP研究显示，索拉菲尼治疗组相比对照组可有效延长总生存时间(OS，10.7个月vs7.9个月，P＜0.001)和疾病进展时间(TTP，5.5个月vs2.8个月，P＜0.001)。但随着临床治疗与研究的深入，索拉菲尼耐药性的问题变得尤为突出。有报道称，索拉菲尼对于HBV阳性肝癌的应答率极低，且大部分临床患者在服用索拉菲尼3-6个月后会出现索拉菲尼抵抗的效应，但关于索拉菲尼的耐药机制目前尚不明确。

CC趋化因子受体4(CC chemokine receptor 4，CCR4)又称CKR4、CMKBR4、ChemR13、K5-5等，属于CC趋化因子受体家族，含360个氨基酸残基，定位于3号染色体p24-p21.3区域，为7次跨膜G蛋白偶联受体，主要表达于各淋巴细胞和组织，CCR4的高表达与多种血液系统肿瘤以及恶性实体瘤的浸润、转移和预后相关。已知的CCR4高亲和力配体有两个，分别为胸腺活化调节趋化因子(Thymus and activation regulated chemokine，TARC/CCL17)和巨噬细胞衍生趋化因子(macrophage-derived chemokine，MDC/CCL22)。CCR4主要通过调节性T细胞(Treg)发挥免疫效应，如Treg细胞表面的CCR4通过与其配体CCL22/CCL17的结合趋化Treg细胞，引起免疫逃逸，从而导致不良临床后果。

CCR4拮抗剂根据其化学结构可分为：噻唑烷酮类、内酰胺类、2-氨基噻唑类、芳基磺酰胺类、二氮基嘧啶类、2，4-二氨基喹唑啉类及环胺类化合物等。在哮喘、鼻炎、皮炎、血栓性疾病、自身免疫性疾病等疾病的研究中均有良好的治疗效果，具有较大的临床应用价值。

迄今为止，尚未见索拉菲尼与CCR4拮抗剂联合用于治疗肝癌、肾癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌等肿瘤生长及转移的报道。

技术实现要素：

本发明人研究发现，索拉菲尼可刺激肿瘤细胞高分泌CCL22和CCL17，趋化Treg细胞浸润导致索拉菲尼治疗耐药。利用索拉菲尼与CCR4拮抗剂，尤其是小分子化合物C-021或ST45177901联合治疗，可有效抑制CCL22/CCL17-CCR4信号通路趋化Treg细胞，从而显著抑制肿瘤细胞的生长及转移。

本发明提供的索拉菲尼与CCR4拮抗剂联合治疗方案在治疗肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、前列腺癌等肿瘤生长及转移中具有良好的临床应用前景。

因此，本发明涉及以下各项：

1.一种药物组合物，其包含索拉菲尼和CCR4拮抗剂。

2.根据1所述的药物组合物，其中所述CCR4拮抗剂包括可以拮抗CCR4的化合物，优选选自以下类型的化合物：噻唑烷酮类、内酰胺类、2-氨基噻唑类、芳基磺酰胺类、二氮基嘧啶类、2，4-二氨基喹唑啉类及环胺类化合物。

3.根据1所述的药物组合物，其中所述CCR4拮抗剂选自小分子化合物C-021、小分子化合物ST45177901、其结构类似物或其任意组合，

其中所述小分子化合物C-021的结构式为：

所述小分子化合物ST45177901结构式为：

4.索拉菲尼与CCR4拮抗剂用于联合制备药物的用途，所述药物用于治疗癌症。

5.根据4所述的用途，所述治疗包括抑制癌生长及抑制癌症转移。

6.根据4所述的用途，其中所述CCR4拮抗剂包括可以拮抗CCR4的化合物，优选选自以下类型的化合物：噻唑烷酮类、内酰胺类、2-氨基噻唑类、芳基磺酰胺类、二氮基嘧啶类、2，4-二氨基喹唑啉类及环胺类化合物。

7.根据4所述的用途，其中所述CCR4拮抗剂选自小分子化合物C-021、小分子化合物ST45177901、其结构类似物或其任意组合，

其中所述小分子化合物C-021的结构式为：

所述小分子化合物ST45177901结构式为：

8.根据4所述的用途，其中所述癌症选自肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、前列腺癌。

9.根据1所述的药物组合物，其中所述CCR4拮抗剂与索拉菲尼分开或同时施用。

10.根据1所述的药物组合物，其中所述CCR4拮抗剂为注射剂、片剂或胶囊剂。

附图说明

图1.索拉菲尼处理肝癌细胞系趋化因子、细胞因子变化检测

图2.索拉菲尼和CCR4拮抗剂联合治疗效果检测

具体实施方式

实施例1：化合物

1.索拉菲尼原料药购于药渡公司。

2.小分子化合物c-021购于Tocris公司(货号：3581，纯度＞99％)，该化合物分子式为C₂₇H₄₁N₅O₂·2HCl，结构如下：

3.小分子化合物ST45177901购于Timtec公司(货号：MFCD04147999，纯度＞99％)，该化合物分子式为C₂₆H₁₆ClN₃O₄S₃，结构如下：

实施例2：索拉菲尼处理肝癌细胞系趋化因子、细胞因子变化检测

实时荧光定量PCR检测经不同浓度索拉菲尼刺激肝癌细胞系后趋化因子、细胞因子等分泌水平变化，筛选出索拉菲尼诱导产生的高分泌因子。

1、细胞

小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞购自ATCC细胞库(货号：CRL-1830)。

2、药物

用不同浓度索拉菲尼处理Hepa1-6细胞48h：

实验组1：细胞培养基中加入4μM索拉菲尼，培养48小时；

实验组2：细胞培养基中加入2μM索拉菲尼，培养48小时；

对照组：加入等体积DMSO，培养48h。

3、实验仪器

仪器名称：ViiA^TM7荧光定量PCR仪，型号：ViiA^TM7，出产厂家：美国ABI。

4、实验方法

将细胞培养基中分别加入2μM、4μM索拉菲尼或DMSO，培养48h后，提取细胞RNA，逆转录为cDNA，real-time PCR检测趋化因子、细胞因子变化。

结果表明，索拉菲尼处理后，CCL22和CCL17表达水平较对照组显著增加(图1)，表明索拉菲尼耐药性的产生与CCL22/CCL17-CCR4信号通路活化有关，趋化Treg促使肿瘤免疫逃逸所致。

实施例3：索拉菲尼联合CCR4拮抗剂用于治疗肝癌生长及转移的动物实验

小鼠皮下荷瘤模型是常规观测肿瘤生长、转移的模型，因此用其验证索拉菲尼与CCR4拮抗剂联合治疗肝癌生长及转移的作用。

1、动物

C57BL/6小鼠(均为雄性，体重20～24g，每组6只/笼群养)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房。共分6组进行实验。

2、细胞

小鼠肝癌细胞系Hepa1-6细胞购自ATCC细胞库(货号：CRL-1830)，每只小鼠接种3*10⁶细胞，获得实验小鼠。

3、药物

将实验小鼠进行分组：

实验组1：每两天灌胃索拉菲尼，40mg/kg，同时腹腔注射PBS

实验组2：每两天灌胃索拉菲尼，40mg/kg，同时腹腔注射CCR4拮抗剂(以小分子化合物c-021为例，10μmol/kg)

实验组3：每两天灌胃索拉菲尼，10mg/kg，同时腹腔注射PBS

实验组4：每两天灌胃索拉菲尼，10mg/kg，同时腹腔注射CCR4拮抗剂(以小分子化合物c-021为例，10μmol/kg)

实验组5：每两天灌胃PBS，同时腹腔注射CCR4拮抗剂(以小分子化合物c-021为例，10μmol/kg)

对照组：每两天灌胃PBS，同时腹腔注射PBS

4、实验方法

将C57BL/6小鼠皮下接种3*10⁶Hepa1-6细胞，7天后分别灌胃不同剂量索拉菲尼及腹腔注射CCR4拮抗剂(以小分子化合物c-021为例)治疗，每两天记录肿瘤的大小，计算肿瘤体积(长*宽*宽/2)，绘制肿瘤生长曲线。14天后，剥离皮下肿瘤，记录大小并称重。

结果表明，40mg/kg索拉菲尼联合CCR4拮抗剂可有效抑制肿瘤的生长，单独给予CCR4治疗也有一定的效果，单独给予10mg/kg索拉菲尼一定程度上更利于肿瘤生长(图2)。

利用小分子化合物ST45177901也得到与上述类似的结果。

这些结果说明，索拉菲尼刺激肿瘤细胞高分泌CCL22和CCL17，趋化Treg细胞浸润促使肿瘤免疫逃逸，诱发索拉菲尼耐药，因此单独给予索拉菲尼治疗效果并不理想。而索拉菲尼与CCR4拮抗剂联合治疗可有效抑制CCL22/CCL17-CCR4信号通路活化，从而抑制肿瘤免疫逃逸，因此可以显著抑制肿瘤细胞的生长及转移。在治疗肝癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、前列腺癌等肿瘤生长及转移中具有良好的临床应用前景。