本发明属于中药技术领域，尤其涉及总酚酸及其低聚果糖为主要活性成分的牛蒡根提取物在制备抗帕金森药物或保健食品中的用途。
背景技术：
牛蒡(Arctium Lappa L .)系菊科2年生草本植物，又名白肌人参、蒡翁菜。原产我国,公元940 年前后传入日本, 被培育出多个优良品种, 成为日本人喜食的蔬菜。近年来,我国从日本引进了牛蒡的新品种，并迅速在北京、上海、江苏、山东等地种植, 成为这些地区重要的出口农产品。目前，牛蒡在国内已大面积栽培,主要在山东苍山和江苏徐州等地，以牛蒡根作为蔬菜生产为主，出口韩国和日本，并且近几年在我国的食用销量也大幅增加。
牛蒡是我国传统中药, 早在南北朝的《名医别录》中就有关于牛蒡入药的记载, 其主要的药用部分是牛蒡子(牛蒡的瘦果)。牛蒡子中主要有效成分为牛蒡苷，其发挥作用的形式是牛蒡苷在体内代谢成牛蒡苷元而发挥其药理作用。有报道牛蒡苷元具有较好的抗帕金森作用（申请号201210402024.0，牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的应用）。目前牛蒡根化学成分研究较少，我国民间将其作为抗衰老、降血糖和补肾壮阳的特种保健蔬菜；牛蒡根在《名医别录》、《药性论》、《本草拾遗》等典籍中多有记载, 但没有形成中草药类的商品,《中国药典》也未收入。研究表明，牛蒡根中主要含有酚酸类（如咖啡酸、绿原酸等）、菊糖等成分，其具有调节胃肠道、抗菌、抗癌及抗病毒作用（牛蒡根的药用研究进展，中医药学报，2006，34（1）：24-25）。我们和文献报道都表明牛蒡根中未发现牛蒡苷和苷元等木脂素类成分。
帕金森病（PD），是以中脑黑质多巴胺能神经元渐进性死亡为病理特征的中枢神经系统退行性疾病。目前，对帕金森病药物治疗，以西药为主，但只能改善症状，不能控制病症的进程，长期应用疗效减弱且毒性增大；而中药治疗具有毒副作用小、协同作用强等优势而更具有开发治疗药物的前景。因此，亟需研究开发一种针对性强，副作用低，并且适用于制备抗帕金森病药物的中药提取物。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种牛蒡根提取物，该提取物可以用于制备抗帕金森病药物，该药物对帕金森疾病具有显著的治疗效果。
为了实现上述目的，本发明提供的牛蒡根提取物用于制备抗帕金森药物和保健食品。
所述的牛蒡根提取物中总酚酸的含量为8-15%，低聚果糖含量为20-35%。
所述的牛蒡根提取物可与药学或食品方面可接受的载体或赋形剂制成颗粒剂、胶囊和片剂等剂型。
为了实现上述目的，本发明还提供所述牛蒡根提取物的制备方法，包括以下步骤。
步骤1、牛蒡根预处理：精选生鲜牛蒡根置于冷库三个月以上后，取出清洗、切片，切片厚度3-4mm，备用。
步骤2、牛蒡根提取物的提取：将步骤1中的牛蒡根切片放入提取罐中， 100℃条件下，加水提取2次，每次处理4小时，纱布滤过，合并两次提取液，减压浓缩，得浓缩液；将浓缩液干燥处理，即得牛蒡根提取物。
所述步骤2中每次水提取中水的用量为牛蒡根切片重量的3-5倍。
所述步骤2中干燥的处理方式为减压干燥、喷雾干燥或冻干。
本发明的有益效果。
本发明中，对抗帕金森病中药有效成分筛选过程中，发现牛蒡根提取物具有较好的抗帕金森病的药理作用；牛蒡子中具有抗帕金森作用的化合物为牛蒡苷元，牛蒡苷元为单体化合物，制备成本较高，而且其生物利用度不高（Fan He, De-Qiang Dou, Qiang Hou, Yu Sun & Ting-Guo Kang.Pharmacokinetic study of arctigenin in rat plasma and organ tissue by RP-HPLC method Natural Product Research 2013，27(10)：903-906.），服用量大，成本高，毒副作用较大。在对牛蒡根的成分分析过程中，未发现有牛蒡苷及苷元等木脂素类成分，因此其抗帕金森作用与牛蒡子中抗帕金森作用的成分和机制不同。并且通过药理试验证明，该牛蒡根提取物具有较强的抗帕金森活性，可单独或与其它药物组合作为原料药应用于抗帕金森药物的制剂中。本发明提供的方法制备的牛蒡根提取物制备方法简便实用，成本低，适合工业化生产。
本发明的牛蒡根提取物中总酚酸和低聚果糖含量测定参照下列文献：1.魏旭，冉小库，李德伟，窦德强，董锋. 亚贡叶提取物中总酚酸的含量测定方法研究. 辽宁中医杂志2015,42(4):811-8；2.柴元武.间苯二酚分光光度法测定果葡糖浆中的果糖[J].河南城建高等专科学校学报, 2001,(10)1:54-56。我们研究发现牛蒡根中具有菊糖水解酶，在一定温度下放置三个月以上，牛蒡根中菊糖（多糖）转化为低聚果糖（2-18聚糖），因此本发明所采用的牛蒡根需要在低温下储藏三个月以上。
附图说明
图1 牛蒡根提取物中低聚果糖分析色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做详细的说明。
实施例1
牛蒡根提取物的制备方法如下：精选生鲜牛蒡根20kg，置于冷库（温度为4℃）储存三个月；然后取出牛蒡根，用毛刷处理根部表面，并用水清洗干净；用切片机（YQC-600/1000型）将牛蒡根切成片状，厚度3mm；取牛蒡根切片10kg，放入提取罐中，加入水30kg，100℃条件下提取4小时，纱布滤过，收集提取液，将沉淀物重复提取操作一次，合并两次提取液；将合并后的提取液进行减压浓缩，得到浓缩液5升，在温度为130 ℃(进口温度)/65 ℃(出口温度)喷雾干燥4h，得到牛蒡根提取物0.29kg，收率为2.9%，其中总酚酸的含量为9.2%，低聚果糖含量为28.9%。
1.牛蒡根中具有菊糖水解酶，在一定温度下放置三个月以上，牛蒡根中菊糖（多糖）转化为低聚果糖（2-18聚糖），其色谱分析条件如下：Waters 2695高效液相色谱系统，检测器为Waters 2424蒸发光散射检测器（ELSD）；色谱柱为华谱XAmide（4.6×250 mm，10m）；以乙腈（B）-水（C）为流动相梯度洗脱，0-100 min（35%C-50%C），100-120 min（50%C-60%C）；流速0.5mL/min；柱温30℃；进样量10 μL；蒸发光检测条件：雾化温度80℃，压力30psi（2.0685 bar），gain值为10，增益值为1，结果见图1。
2.低聚果糖的测定方法，具体操作过程如下。
（1）显色剂的制备:精密称取间苯二酚0.500g，溶于100mL蒸馏水中，过滤；取上述溶液20mL，加蒸馏水50mL、浓HCl 50mL，混匀即可。
（2）果糖对照品的制备:精密称取55℃真空条件下干燥至恒重的果糖1.000g，溶于10mL蒸馏水后，加6mol/L的HCl 2mL，转移至1000 mL容量瓶中定容，使用时再稀释成0.5 mg/mL即可。
（3）果糖标准曲线：在6支10mL具塞比色管中，依次加入0.500mg/mL果糖溶液0mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL，0.8mL，再分别加入1.0mL，0.2 mL，0.3mL，0.4mL，0.5mL，0.6mL，0.7mL的蒸馏水，然后均加入显色剂9.0mL，置于水浴锅中，水浴加热至100℃并恒温8min；取出后，将具塞比色管通过自来水流水冷却10min，用1cm比色皿，以试剂空白为参比，在473nm处测其吸光度A，标准曲线回归方程为：Y=13.949X+0.0552，r = 0.998，其中Y为吸光度，X为果糖对照品溶液浓度（单位为mg/mL）。结果表明：果糖在0.015 - 0.040mg/mL的范围内呈良好的线性关系。
（4）供试品低聚果糖含量测定: 称取牛蒡根提取物10mg，置于25mL的容量瓶中，用蒸馏水定容，混匀静置15min后，精密吸取该溶液1mL于10mL容量瓶中，蒸馏水定容，混匀后静置15min后，于具塞比色管中，加入显色剂9mL。置于水浴锅中，水浴加热至100℃并恒温8 min；取出后，将具塞比色管通过自来水流水冷却10 min，用1cm比色皿，以试剂空白为参比，在473nm处测其吸光度，根据果糖标准曲线：Y=13.949X+0.0552，r = 0.998，其中Y为吸光度，X为果糖对照品溶液浓度（单位为mg/mL）。计算提取物有低聚果糖含量。
3.采用比色法对牛蒡根提取物中的总酚酸进行含量测定（石玉媛，何凡，李莹莹，窦德强，康廷国，董锋.不同产地亚贡叶中总酚酸的含量测定.中华中医药学刊，2010，28（7）：1475-1477），具体操作过程如下。
精密称取牛蒡根提取物30毫克于10毫升容量瓶中，加50%甲醇超声溶解，50%甲醇定容，制备供试品溶液；精密量取1ml供试品溶液，置于25ml量瓶中，先加甲醇5ml，再加0.3%十二烷基硫酸钠2ml后，然后加0.6% FeCl3.6H2O和0.9%K3[Fe(CN)6](体积比1：1)混合溶液2ml；在暗处放置5min，加0.1mol/l HCl溶液至刻度，在暗处放置20min；以显色剂为空白，以绿原酸为对照品，在746nm处测定吸光度，根据绿原酸的标准曲线方程Y=143.7X+0.0403(r=0.9997，线性范围0.002 -0.005 mg/mL。其中Y为吸光度,X为对照品溶液浓度(mg/mL ))，进行定量分析。
4.牛蒡根提取物的抗帕金森作用研究。
4.1实验材料。
C57BL/6小鼠购自购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。试验中采用实施例1制备的牛蒡根提取物。
4.2动物分组。
将50只C57BL/6小鼠随机分为5组：空白组、模型组、阳性药组（多巴丝肼片（美多芭），上海罗氏制药有限公司）和牛蒡根提取物高、低剂量组，每组10只。
4.3造模及给药方法。
模型组和高、低剂量组皮下注射MPTP（购于Sigma公司）25 mg/kg，每天一次，连续3天，第四天开始，继续皮下注射MPTP，同时高、低剂量组灌胃给予牛蒡根提取物，其高、低剂量组分别给药60mg/kg、30mg/kg，每天给药一次，连续给药9天；空白组以腹腔注射等量生理盐水代替MPTP，每天一次；阳性药组每天给予50的多巴丝肼片。每天进行动物行为学实验考查。
4.4行为学考查。
4.4.1悬挂实验（Traction test）。
实验目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。将受试小鼠悬挂于一水平电线上，电线直径约为0.2mm；从小鼠双前爪抓住电线开始计时，小鼠掉落则计时结束：25秒以上的记6分；20-25秒记5分；15-20秒记4分；10-15秒记3分；5-10s记2分；0-5s记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析，分值越高，小鼠抓住电线越牢固，说明小鼠肢体运动协调情况越好；反之，则说明小鼠震颤、肌强直等情况严重。悬挂实验结果，见表1。
表1悬挂实验得分结果（±s）。
注：△与空白组比较，有差异（p<0.05）；△△与空白组比较，差异显著（p<0.01）；▲与模型组比较，有差异（p<0.05），▲▲与模型组比较，有显著差异（p<0.01）。
4.4.2 爬杆实验（Pole test）。
实验目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。将一直径为2.5 cm的软木球固定于一根长50 cm，直径1 cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录小鼠爬完杆子所需要的时间；然后按以下标准记分：0-3 秒内完成上述动作，记6分；3-6 秒内完成上述动作，记5分；6-9秒内完成上述动作，记4分；9-12秒内上述动作，记3分；12-15秒内上述动作，记2分；15秒以上完成上述动作，记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析，分值越高，小鼠爬完杆子的全程所用的时间越少，说明小鼠肢体运动协调情况越好，也说明小鼠对爬杆实验越来越熟练，结果见表2。
表2 爬杆实验得分结果 （±s）。
注：△与空白组比较，有差异（p<0.05）；△△与空白组比较，差异显著（p<0.01）；▲与模型组比较，有差异（p<0.05）。
5.牛蒡根提取物的抗帕金森的血清药理学试验。
5.1实验材料。
采用SD大鼠，雌雄各半，体重200±20g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。所用牛蒡根提取物为采用实施例1制备，称取提取物适量，配制成5 mg/mL的水溶液，待用。
5.2实验方法。
5.2.1 药物血清的制备。
大鼠适应性饲养3天，自由饮水进食。随机分为空白组和牛蒡根提取物高、低剂量组，每组6只；高、低剂量组分别给牛蒡根提取物60mg/kg、30mg/kg，每天灌胃给药2次，连续给药7天；空白组给予等量生理盐水。于末次给药后0.5 h各组动物摘眼球取血，静置0.5 h后，3000 rpm/min离心10 min，分离得血清，在56℃条件下灭活处理30 min，以除去可能存在的生物活性物质，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存，备用。
5.2.2细胞分组与处理。
人母神经细胞瘤系细胞（SH-SY5Y细胞，购于中科院上海细胞库），用含10％灭活胎牛血清、青霉素100U·mL-1、链霉素100 μg·mL-1的 DMEM F-12培养液培养SH-SY5Y细胞，隔天更换培养液，培养至单层细胞约80%汇合时，传代培养，用对数生长期的细胞进行实验。调整细胞密度为1×105接种于96孔板中，每孔100 μL，置于37℃、5％CO2的培养箱中，培养16 h待细胞贴壁。将细胞随机分为3组：模型组、实验组和空白血清对照组，每组设3个复孔。牛蒡根提取物高、低剂量组只加入含体积分数5%、10%和20%相应的含药血清完全培养基，模型组和空白血清对照组只加相应体积分数的空白血清。各组于37℃、5％CO2的培养箱中培养24 h后，实验组和模型组同时加入1mM的MPP+（购于sigma公司），继续培养48 h。3组细胞每孔加5 mg/mL MTT 10 μL，培养4 h，吸去孔内培养基，每孔加DMSO 100 μL，待结晶充分溶解，酶标仪检测 492 nm处各孔的吸收值（OD值）（参考波长620 nm），计算细胞存活率。
细胞存活率％=实验组OD值／空白血清对照组OD值×100％。
统计学处理数据以均数±标准差（±s）表示，用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学处理。
5.2.3. 实验结果。
与空白血清组相比，模型组细胞存活率显著降低；加入高、低剂量的牛蒡根提取物含药血清组的存活率显著增加，与模型组有显著统计学意义，结果见表3，结果表明，一定体积分数的牛蒡根提取物含药血清对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞有明显的保护作用。
表3 不同体积分数的含药血清对抗MPP+细胞毒性后的SH-SY5Y细胞存活率(±s)。
注：*与模型组比较，有差异（p<0.05）；**与模型组比较，有显著差异（p<0.01），***与模型组比较，有极显著差异（p<0.001）。
6．牛蒡根提取物制剂的研究。
6.1 仪器和试剂：仪器有TDP-5T单冲压片机（上海冠联制药装备有限公司）；FA-1004型电子天平（上海精科天平厂）；水浴锅（巩义市予化仪器有限责任公司）；DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥箱。试验中所用试剂均为分析纯，购于禹王试剂公司。
6.1.1片剂制备：取实施例1所得牛蒡根提取物10 g，可压淀粉30g，用7mL 80%乙醇制成软材，以捏之成团，搓之即散做为成型标准成型，将制好的颗粒于60℃烘干处理12 h，过10目筛，筛选出颗粒，备用；将制好的颗粒称重，按照颗粒重量0.5%的量加入硬脂酸镁，以不同规格的压片机压片，分别制备片重为400毫克/片、200毫克/片和100毫克/片的片剂，压力在16-18kg/片；片剂中每400毫克含牛蒡根提取物100毫克。结合患者具体症状给药，建议每次3片（400毫克/片），每日2次。
6.1.2胶囊剂的制备：以上述5.1.1制备好的颗粒，采用胶囊机装胶囊，制备400毫克/囊的胶囊剂。结合患者具体症状给药，建议服用剂量为每次3粒，每日2次。
6.1.3口服液的制备：取实施例1所得的牛蒡根提取物20克，加水 300毫升溶解，加橙皮苷4毫升，加单糖浆至1000毫升得糖浆剂。结合患者具体症状给药，建议服用剂量每次15 毫升，每日2 次。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。