一种苦石莲中含二萜的提取物及其提取方法与应用与流程

本发明属于天然药物化学领域，特别涉及一种以苦石莲为原料得到的预防和治疗慢性前列腺炎的含二萜的提取物及提取方法与应用。

背景技术：

(一)前列腺炎研究进展

慢性前列腺炎(chronic prostatitis，CP)是男性泌尿外科最常见的一种疾病，据报道在我国的发病率为6.0％～32.9％，远远高于国外2.0％～16.0％的发病率。CP病因复杂、病程迁延、症状多变，严重影响患者的身心健康。美国国立卫生研究院(National institute of health,NIH)将其列为影响居民生活质量最为严重的慢性疾病之一。1995年，NIH将前列腺炎分为4种类型，分别为：I型：急性细菌性前列腺炎(acute bacterial prostatitis,ABP)；Ⅱ型：慢性细菌性前列腺炎(chronic bacterial prostatitis,CBP)；Ⅲ型：慢性非细菌性前列腺炎(chronic antibacterial prostatitis，CABP)/慢性骨盆疼痛综合征(chronic pelvic pain syndrome，CPPS)；Ⅳ型，无症状炎症性前列腺炎(asymptomatic inflammatory prostatitis,AIP)。其中Ⅲ型前列腺炎(CABP/CPPS)，即占CP总发病率的90％以上。

CABP/CPPS的病因及发病机制复杂，其发生和发展是由多因素共同作用的结果。近年来认为，CABP/CPPS与自身免疫因素密切相关。在机体的免疫过程中，各种炎性细胞因子和炎性介质共同作用的网络和级联反应，诱导了CABP/CPPS的发病与发展。研究表明在CABP/CPPS患者的前列腺组织、精浆和血清中，促炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α等)、抗炎性因子(IL-10等)以及COX-2、iNOS、PGE₂等炎症介质都发生明显变化。炎症因子和炎症介质水平的检测可以作为CABP/CPPS诊断或治疗的重要指标。此外，微生物感染、氧化应激、神经生长因子、前列腺内尿液返流、基因缺陷、锌水平降低以及一些物理和化学等因素都有可能导致CABP/CPPS的发病。

环氧合酶(cyclooxygenase,COX)是一种限速酶，主要包括COX-1和COX-2两种同工酶，可以调控花生四烯酸合成前列腺素和血栓素的速度。COX-1为人体内的固有酶，维持前列腺素的基础水平，在许多组织细胞的正常生理过程中发挥重要作用；而COX-2为诱生酶，在炎性应答反应中，受到炎症细胞因子、生长因子和细胞内毒素等诱导后迅速表达，在炎症病灶的前列腺素E2(PGE₂)的上升中起着非常关键的作用。

近年的研究发现，COX-2在CABP/CPPS患者的前列腺组织和血清中高度表达。一些典型的COX-2抑制剂如尼美舒利(nimesulide，主要用来治疗慢性关节炎疼痛和原发性痛经)和罗非昔布(rofecoxib,主要用来治疗关节炎)等药物在临床上常被用来治疗CABP/CPPS，但这些药物对胃肠道和心血管方面有不可忽视的副作用，且它们对CABP/CPPS的治疗作用仍处在研究阶段^[22,23]。因此，寻找和开发安全有效的基于COX-2抑制作用的预防治疗CABP/CPPS的药物仍具有重要的临床意义。

目前临床上用于治疗CABP/CPPS的主要为化学药物，包括抗生素类药物、α-还原酶抑制药，α-受体阻断药，非甾体类抗炎药，神经调节类药物、免疫抑制剂、维生素和一些微量元素等，但这些药物都有一定的副作用，临床作用效果也难以令人满意。近年来的一些研究表明，一些植物制剂，如舍尼通(纯裸麦花粉提取物)、诺伯特(沙巴棕果提取物)和前列康(花粉制剂)等药物治疗CABP/CPPS有明显的效果，并能很好的缓解排尿困难等症状，提示在植物中寻找治疗效果显著、毒性低和不良反应少的天然药物应用于该疾病的治疗中，将有广阔的发展前景。

(二)苦石莲的研究概况

1、概述

苦石莲(CaesalpiniaminaxHance)，又名石莲子、广石莲子、猫儿核等，系豆科(Leguminosae)云实属植物(Caesalpinia L.)啄荚云实种仁，分布较广泛,主要生长于广西、广东、福建、贵州、云南、四川等地，在民间为治疗肝炎和流感的常用药。本品性苦寒，有止痛、散瘀、清热、解毒、祛湿的功效，主治风热感冒、跌打损伤、痢疾、疖肿、淋浊等症，并被四川、广西、贵州等省区的中药材标准收录。

2、化学成分研究

对本属植物的研究可以追溯到1930年，当时Tummin KMC^[5]等人就对本属植物的化学成分进行研究，至今已有80多年的历史。据国内外的报道^[6]，云实属植物中主要含有以下几种类型化合物：呋喃二萜类、黄酮类、三萜类、倍半萜类以及其他类(甾醇、脂肪酸类等)化合物，其中二萜类化合物为其主要成分。

3、药理作用研究

本属植物在温热带分布较广，在世界上许多地方和地区都具有广泛的应用。在我国西南广东、广西、贵州、云南和四川等地，本属植物苦石莲常被用来治疗感冒发烧，痢疾，肺炎，肾炎，前列腺炎等症。现代药理研究表明云实属植物具有抗炎止痛，抗虐、抗微生物、抗癌、抗过敏、DNA修复以及植物生长调节等活性。呋喃二萜类化合物为其主要活性成分，目前有关该属植物的活性报道主要集中在对二萜类化合物的研究。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供一种预防和治疗慢性前列腺炎的含二萜提取物的提取方法。该提取方法以苦石莲为原料。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种苦石莲含二萜提取物的提取方法，包含以下步骤：

所述的苦石莲含二萜提取物的制备方法，优选包含如下步骤：将苦石莲粉碎过筛，用醇溶液提取，过滤，得到醇总提取液，浓缩，得到苦石莲含二萜提取物；所述得苦石莲含二萜提取物至少含有化合物1-6。

所述的醇溶液优选为乙醇溶液或甲醇溶液。

所述的乙醇溶液优选的浓度为体积百分比为50％～100％。

所述的甲醇溶液优选的浓度为体积百分比为50％～100％。

所述的提取的方式为超声、渗漉或加热回流中的一种。

所述加热回流的条件优选为在70～80℃进行。

所述的提取优选至少提取3次，每次提取1～2h。

所述的苦石莲含二萜提取物的制备方法中浓缩步骤：将醇总提取液依次用环己烷、乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯提取液浓缩。

本发明还提供一种上述方法获得的苦石莲含二萜提取物，所述得苦石莲含二萜提取物至少含有化合物1-6。

本发明还提供一种所述的苦石莲含二萜提取物在预防和治疗慢性前列腺炎药物中的应用；所述苦石莲二萜提取物具有抑制大鼠慢性非细菌性前列腺炎的活性。

本发明还提供一种苦石莲含二萜提取物的提取方法，具体为将苦石莲原药材干燥、粉碎、过100目筛，用体积百分比为95％的乙醇于室温下进行渗漉提取3次，每次2小时，过滤，得到总提取液：将总提取液减压蒸馏至干燥得到总提物，将此总提物混悬于去离子水中，依次用环己烷、乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯提取液，然后将乙酸乙酯提取液减压浓缩至恒重，得到浆状物，即乙酸乙酯提取物。

所述的苦石莲含二萜提取物具有抑制大鼠慢性非细菌性前列腺炎的活性，可用于制备预防和治疗慢性前列腺的药物。

本发明相对于现有技术相比的有益效果：

(1)苦石莲(CaesalpiniaminaxHance)，主要生长于广西、广东、福建、贵州、云南、四川等地，分布较广泛，易于得到；

(2)发明人发现苦石莲提取物具有较好的抗炎作用，特别是含二萜的乙酸乙酯提取部位具有强大的抗慢性非细菌性前列腺炎的作用。本发明所述的苦石莲含二萜提取物制备方法简单，成本较低；

(3)将苦石莲含二萜提取物应用于制备预防和治疗慢性前列腺炎药物，高效低毒，符合药物发展的要求。

附图说明

图1是实施例1得到的苦石莲含二萜提取物的HPLC色谱图。

图2是化合物1-6的结构图。

图3是乙酸乙酯提取物(含二萜提取物)抑制大鼠慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型前列腺组织中COX-2表达的示意图，其中

a为空白组大鼠前列腺组织中COX-2表达的示意图；

b为模型组大鼠前列腺组织中COX-2表达的示意图；

c为前列康组大鼠前列腺组织中COX-2表达的示意图；

d为高剂量给药组大鼠前列腺组织中COX-2表达的示意图；

e为高剂量给药组大鼠前列腺组织中COX-2表达的示意图；

f为低剂量给药组大鼠前列腺组织中COX-2表达的示意图。

图4是对比实施例1得到的苦石莲甲醇总提取物和乙醇总提取物的HPLC谱图。其中：

A为苦石莲乙醇总提取物的HPLC谱图；

B为苦石莲甲醇总提取物的HPLC谱图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)苦石莲含二萜提取物的制备

将苦石莲原药材(5kg，市售)干燥，粉碎，过100目筛，用体积百分比为95％的乙醇于室温下进行渗漉提取3次，每次2小时，过滤，得到总提取液：将总提取液减压蒸馏至干燥得到总提物(664g)，将此总提物混悬于去离子水中，依次用环己烷、乙酸乙酯萃取，最终得到乙酸乙酯提取液。然后将乙酸乙酯提取液减压浓缩至恒重，得到浆状物，即乙酸乙酯提取物(含二萜提取物，67.5g)。先用环己烷进行萃取的目的是减少总提取物中的小极性杂质。

(2)对步骤(1)得到的含二萜提取物进行分析

将步骤(1)得到的含二萜提取物溶于甲醇，配成20mg/ml的溶液，用HPLC进行色谱分析，分析条件是：C18反相半制备柱(5μm,9.4×250mm)，紫外检测波长为235nm，流速为1ml/min，梯度系统为：A:水，B:乙腈；0～10min：10％(v/v)的乙腈溶液；10～50min：10％(v/v)→100％(v/v)的乙腈溶液；50～55min：100％(v/v)的乙腈溶液；55～60min:100％(v/v)→10％(v/v)的乙腈溶液，得到乙酸乙酯部位的指纹图谱(见图1)。用波谱分析法对苦石莲总二萜的主要成分进行分析和鉴定，确定其二萜主要为：caesalmin I(化合物1)，caesalmin O(化合物2)，caesalmin P(化合物3)，caesalmin B(化合物4)，caesalpinin B(化合物5)，norcaesalpinin MC(化合物6)。化合物1～6的结构如式1～6所示，波谱数据如下：

化合物1：无色晶体，[α]_30D+23.5°(c 0.1,CHCl₃)；浓硫酸-香草醛反应显红色；IR(KBr)ν_max:3567,1739cm^-1；ESI-MS:m/z 457.5[M+Na]⁺；891.3[2M+Na]⁺，HR-ESI-MS:m/z 435.2017[M+H]⁺(calcd for C₂₃H₃₁O₈:435.2013)。

化合物2：白色粉末，[α]_30D+57.3°(c 0.1,CHCl₃)；浓硫酸-香草醛反应显红色；IR(KBr)ν_max:3575,1733cm^-1；ESI-MS:m/z 441.4[M+Na]⁺,859.3[2M+Na]⁺；HR-ESI-MS:m/z 419.2073[M+H]⁺(calcd for C₂₃H₃₁O₇:419.2064。

化合物3：无定形粉末，[α]_30D+17.8°(c 0.05,CHCl₃)；浓硫酸-香草醛反应显红色；IR(KBr)ν_max:3575,1725cm^-1；ESI-MS:m/z 473.5[M+Na]⁺,923.5[2M+Na]⁺；HR-ESI-MS:m/z 473.2152[M+Na]⁺(calcd for C₂₄H₃₄O₈Na:473.2146)。

化合物4：白色粉末，[α]_30D+18.7°(c 0.1,CHCl₃)；浓硫酸-香草醛反应显红色；IR(KBr)ν_max:3597,1719cm^-1；ESI-MS:m/z 389.1[M+H]⁺,411.3[M+Na]⁺,799.2[2M+Na]⁺。

化合物5：白色粉末，[α]_30D+31.7°(c 0.05,CHCl₃)；浓硫酸-香草醛反应显红色；IR(KBr)ν_max:3492,1735cm^-1；ESI-MS:m/z 447.2[M+H]⁺,469.3[M+Na]⁺,915.2[2M+Na]⁺。

化合物6：白色粉末，[α]_30D+28.7°(c 0.1,CHCl₃)；浓硫酸-香草醛反应显红色；IR(KBr)ν_max:3600,1740cm^-1；ESI-MS:m/z 477.2[M+H]⁺,499.3[M+Na]⁺,975.1[2M+Na]⁺。

化合物1-6的结构图如图2。

(3)对步骤(1)得到的含二萜提取物对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的影响

建立大鼠CABP/CPPS模型：取170-210g雄性SD大鼠，随机分组，10只为假手术组，其余为模型组。以2.5％戊巴比妥钠腹腔注射(0.3ml/100g)麻醉后，无菌条件下做去势手术，缝合皮肤，消毒包扎，自由饮食。模型组第二天于背部皮肤下注射苯甲酸雌二醇(0.25g/kg)，连续30天，假手术组大鼠皮下注射蒸馏水0.125mg/kg，连续30天。

分组和给药方法：将模型组大鼠随机分为5组，每组10只，分别为给药组(高、中、低剂量)、阳性对照组、空白对照组。给药组分别按照高、中、低剂量(0.8g/kg，0.4g/kg、0.1g/kg)给予不同浓度的含二萜提取物；阳性对照组给予前列康溶液0.2g/kg；假手术组和空白组给予等量PBS。灌胃每天1次，连续30天。

动物取材：末次给药结束2h后，摘眼球取血，4℃低温3000r/min离心20min后取血清，分装于EP管中，-20℃保存。取血后立即脱臼处死大鼠，无菌条件下解剖，切开腹部，剪开趾骨联合，取出前列腺组织，将其分为左右两部分，称重。将左侧前列腺组织在冰水浴上用玻璃匀浆器使之匀浆，3000r/min离心20min后，取出上清液，分装于EP管中，-20℃保存，沉淀细胞用于流式检测COX-2的表达。

检测方法：取组织研磨后的细胞沉淀，制成单细胞悬液，经PBS洗2次，加入抗鼠Cox-2的一抗，4℃孵育40min，PBS洗涤二次，沉淀加FITC标记二抗20μl混匀，4℃暗盒孵育60min，PBS洗涤一次，沉淀加PBS 400μL混匀后上样。流式细胞仪检测荧光标记细胞的荧光。

实验结果：如图3所示，高、中、低剂量的苦石莲乙酸乙酯部位(含二萜提取物)对CABP/CPPS前列腺组织中COX-2的表达均有明显的抑制作用，并且其抑制作用具有剂量依赖性。

对比实施例1

苦石莲乙醇提取物和甲醇提取物的比较

(1)样品制备

取2份苦石莲原药材各5g，粉碎，过100目筛，分别用10ml甲醇和乙醇超声提取1小时，提取液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液取20μL注入HPLC进行分析。

(2)分析条件

采用HP1100仪器系统，反相色谱柱(150×4.6mm，3μm；Al ltech，USA)，流动相：水(A)和乙腈(B)。梯度洗脱系统：0～20min：10％→30％B；20～50min：30％→100％B；50～55min：100％B；55～60min:100％→10％B。流速：1ml/min，检测波长：254nm。

(3)分析结果

结果如图4所示，苦石莲甲醇提取物和乙醇提取物的主要色谱峰保留时间基本一致，说明它们的化学成分非常接近。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。