一种利用短肽超分子水凝胶复合石菖蒲中有效成分的方法与流程

本发明涉及一种复合超分子水凝胶因子、水凝胶及其制备方法。特别地，涉及一种利通过化学修饰连接具有芳香性的苯丙氨酸，通过芳香堆积和氢键自组装制备多响应、多功能超分子水凝胶的方法。

背景技术：

阿尔兹海默症（ad）多发于老年人，故俗称老年痴呆，是一种渐进的、慢性的、致命的神经退行性疾病，症状主要表现为记忆缺失，认知障碍以及语言能力的下降。而目前，ad依然是一种无法治愈的严重的疾病，因此，有效地ad的预防和治疗引起了全世界的关注。多肽aβ异常聚集自组装形成的淀粉样纤维被认为是ad的主要致病因素。这种异常聚集的aβ是β折叠的强疏水性结构，从而形成难溶性的淀粉样蛋白斑块和神经原纤维缠结，aβ单体的毒性较低，最终的成熟纤维毒性也不高，然而聚集过程中中间体是一种可溶性的寡聚体，其对大脑神经元细胞产生较强的毒性，并诱导其凋亡。因此阻断抑制aβ单体的聚集，或者促进aβ成熟纤维的生成都能够较好地抑制其生理毒性，是治疗和预防ad的关键。

目前报道的药物大多是以抑制aβ聚集为主，也有少量的药物是以促进成熟纤维的生成为目标，但是这些潜在的药物分子水溶性都比较差。很难通过简单的药物溶解注射的方法进行给药。而且，药物的稳定性也是一个关键难点。我们此前发现石菖蒲中几种主要的成分：α-细辛醚（α-asarone）、β-细辛醚（β-asarone）、丁香酚甲醚、异丁香酚甲醚都有比较好的抑制aβ毒性的作用，但是这些潜在药物成分水溶性不好，而且在空气中容易被氧化，造成药效的大幅下降。改变这些天然产物的剂型对开发治疗和预防ad的药物至关重要。

水凝胶（hydrogel）是以水为分散介质的凝胶。传统的水凝胶是由交联的高分子网状结构束缚水分子制备而成。最近十几年，随着小分子有机凝胶的兴起(chem.rev.1997,97,3133)，小分子水凝胶(chem.rev.2004,104,1201)逐渐进入人们的视野。小分子水凝胶即超分子水凝胶（supramolecularhydrogel），它是由小分子在水中利用非共价键作用通过自组装形成具有网状的超分子结构，以此束缚水分子形成半固体状的水凝胶。非共价键作用也称弱化学键作用，它们是分子组装的驱动力，包括氢键、离子键、π-π键、范德华力、疏水作用等作用力。在超分子水凝胶中，组装的小分子称为凝胶因子（hydrogelator）。

基于9-芴甲氧羰基（fmoc）的氨基酸或短肽水凝胶具备生物相容好、生物易降解、化学可修饰及廉价易制备等诸多优良性质，现已被广泛用于细胞培养、组织工程、药物缓释、生物医药等领域。以fmoc短肽为凝胶因子的超分子水凝胶形成原理是，fmoc提供π-π键，短肽提供氢键或部分π-π键，在水溶液中组装成网状纤维束缚水分子形成凝胶状物质。fmoc-短肽水凝胶一般具有热响应和ph响应双重响应，但是，它们很难具有其它方面的刺激响应，如电化学响应，氧化还原响应，光响应等等。

鉴于水凝胶因子这些优良的性质，我们决定设计一些具有刺激响应性质的超分子水凝胶来实现石菖蒲中有效成分的可注射给药以及稳定性提高。以此形成的水凝胶同时保存氨基酸短肽还原活性和生物兼容性，也具备石菖蒲抗老年痴呆的生物活性。实验结果表明，该水凝胶有望在预防和治疗老年痴呆等神经退行性疾病等领域有很好的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种多响应超分子水凝胶因子、水凝胶及制备方法，该超分子水凝胶具有多重响应性质（温度可逆、ph可逆和氧化还原可逆），符合智能和功能性纳米材料的要求。

为解决上述问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种利用短肽超分子水凝胶复合石菖蒲中有效成分的方法，包括石菖蒲挥发油中提取的β-细辛醚，α-细辛醚，丁香酚甲醚和异丁香酚甲醚，由于β-细辛醚，α-细辛醚，丁香酚甲醚和异丁香酚甲醚自身能够形成较弱的水凝胶再通过苯丙氨酸+壳聚糖形成复合超分子水凝胶因子，将复合超分子水凝胶因子在ph为7.4的pbs缓冲溶液中组装成复合超分子水凝胶，具体步骤如下：（1）药物的储备溶液：分别用dmso将α-细辛醚、β-细辛醚、丁香酚甲醚和异丁香酚甲醚先溶解于乙醇中，然后配制成10mmol/l混合溶液，存放于4℃冰箱中冷藏备用；（2）将商用氨基酸制备成0.1wt%的水溶液作为商业氨基酸储备液，ph控制在9.0；（3）将步骤（1）中药物储备液与步骤（2）中商业氨基酸储备液混合，水浴加热到70℃，向pbs缓冲溶液中逐滴加naoh，边加变摇动，将ph由碱性调节到中性，直到形成澄清的fc-phe-oh溶液；超声1小时后，放置于室温下自然冷却，10分钟后，即自然形成复合超分子水凝胶因子；（4）将步骤（3）中复合超分子水凝胶因子与1%的壳聚糖溶液在70℃下混合，混合过程中保持加热和超声，放置于室温下自然冷却，30分钟后，即得到具有可注射性的复合超分子水凝胶。

作为优选，述步骤（2）的商用氨基酸包括但不限于fmoc-his(trt)-oh，fmoc-cys(trt)-oh，fmoc-asn(trt)-oh，fmoc-gln(trt)-oh和fmoc-his(fmoc)-oh。

与现有技术相比，本发明的有益之处在于：

（1）本发明扩大基于短肽超分子水凝胶的范围，尝试并成功制备基于石菖蒲有效成分的氨基酸的多响应超分子水凝胶。即首次提出利用石菖蒲有效成分和芳香性氨基酸（苯丙氨酸）通过芳香堆积和氢键协同作用，自组装形成三维网状纤维，以此束缚水分子形成超分子水凝胶。

（2）本发明制备的超分子水凝胶具有较好的稳定性和优秀的可注射性，符合药物缓释材料的要求。

（3）本发明制备的超分子水凝胶在人体生理ph（7.4）环境下具有最好的成凝胶性质。鉴于苯丙氨酸具备良好的生物相容性，石菖蒲有效成分具有良好的抑制老年痴呆恶化等特性，对aβ42有良好的消解作用，可以有效地降低aβ42的细胞毒性，该复合超分子水凝胶有望于在神经退行性疾病的治疗等领域有良好的应用。

（4）本发明制备的超分子水凝胶可以包覆其他药物分子，其成凝胶性质不受这些药物分子的影响，因此有望应用于脑外伤的术后恢复的药物缓释领域。

（5）本发明制备的超分子水凝胶在高浓度氯化钠溶液中依然可以形成，即，离子强度对其成凝胶性质影响不大。因此，该水凝胶为耐盐性水凝胶。

（6）本发明制备的超分子水凝胶制备简单，凝胶因子可大量廉价合成。因此，在以上的应用中，该水凝胶为非常合适的选择。

附图说明

下面结合附图对本发明进一步说明：

图1为复合超分子水凝胶的扫描电镜显微图；

图2为药物与aβ42相互作用的（tht）荧光光谱图；

图3为药物作用于aβ42纤维的荧光强度百分比；

图4为β-细辛醚，α-细辛醚，丁香酚甲醚和异丁香酚甲醚在不同浓度下药物单独孵育sh-sy5y细胞的存活率；

图5为aβ42与药物（drug:aβ42=10:1）共同孵育的sh-sy5y细胞存活率。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细描述：

一种利用短肽超分子水凝胶复合石菖蒲中有效成分的方法，包括石菖蒲挥发油中提取的β-细辛醚，α-细辛醚，丁香酚甲醚和异丁香酚甲醚，由于β-细辛醚，α-细辛醚，丁香酚甲醚和异丁香酚甲醚自身能够形成较弱的水凝胶再通过苯丙氨酸+壳聚糖形成复合超分子水凝胶因子，将复合超分子水凝胶因子在ph为7.4的pbs缓冲溶液中组装成复合超分子水凝胶，具体步骤如下：（1）药物的储备溶液：分别用dmso将α-细辛醚、β-细辛醚、丁香酚甲醚和异丁香酚甲醚先溶解于乙醇中，然后配制成10mmol/l混合溶液，存放于4℃冰箱中冷藏备用；（2）将商用氨基酸制备成0.1wt%的水溶液作为商业氨基酸储备液，ph控制在9.0；（3）将步骤（1）中药物储备液与步骤（2）中商业氨基酸储备液混合，水浴加热到70℃，向pbs缓冲溶液中逐滴加naoh，边加变摇动，将ph由碱性调节到中性，直到形成澄清的fc-phe-oh溶液；超声1小时后，放置于室温下自然冷却，10分钟后，即自然形成复合超分子水凝胶因子；（4）将步骤（3）中复合超分子水凝胶因子与1%的壳聚糖溶液在70℃下混合，混合过程中保持加热和超声，放置于室温下自然冷却，30分钟后，即得到具有可注射性的复合超分子水凝胶。

如图1所示是利用石菖蒲有效成分和芳香性氨基酸（苯丙氨酸）通过芳香堆积和氢键协同作用，自组装形成三维网状纤维，以此束缚水分子形成超分子水凝胶，图2和图3分别为药物与aβ42相互作用的（tht）荧光光谱图和药物作用于aβ42纤维的荧光强度百分比，图中a、b、c、d分别表示β-细辛醚/aβ42=10:1，α-细辛醚/aβ42=10:1，丁香酚甲醚/aβ42=10:1，异丁香酚甲醚/aβ42=10:1，通过图2和图3所示可以证明其对aβ42有良好的消解作用，如图4和图5所示为α-细辛醚、β-细辛醚、丁香酚甲醚和异丁香酚甲醚在不同浓度下药物单独孵育sh-sy5y细胞的存活率以及aβ42与药物（drug:aβ42=10:1）共同孵育的sh-sy5y细胞存活率，可以证实该复合超分子水凝胶具有效地降低aβ42的细胞毒性的作用。

需要强调的是：以上仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。