一种生物活性玻璃‑改性明胶复合水凝胶及其制备方法与流程

本发明属于生物医用材料的制备领域，具体涉及一种生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶及其制备方法。

背景技术：

创伤、肿瘤切除、畸形矫正及感染等原因使骨丧失骨质后容易造成骨缺损。目前，治疗骨缺损最主要的方法是骨移植，包括自体骨和异体骨。自体骨移植无需考虑组织相容性及免疫排斥反应，但供骨来源有限；异体骨来源广泛，但存在免疫排斥和感染血源性病毒等风险。因此，需要研究和开发新型人工骨修复材料以满足临床需求。

骨组织的主要成分是胶原和羟基磷灰石。基于仿生角度，采用与天然骨成分相似的有机和无机物制备骨修复材料已成为目前的研究热点之一。生物活性玻璃作为典型的硅酸盐材料，具有良好的生物相容性、骨引导性和骨诱导性，在骨缺损修复具有广泛的应用。明胶是胶原部分水解得到的产物，生物相容性良好，同时链上带负电的羧基基团可作为成核位点，控制和诱导羟基磷灰石形成。生物活性玻璃/明胶复合材料在组成上与人骨组织类似，并具有良好的生物相容性和诱导成骨作用等生物学特性，在一定程度上满足骨修复材料的要求。

目前，制备生物活性玻璃/明胶复合材料的常用方法是将一定量的生物活性玻璃粉体加入至明胶溶液中，搅拌均匀后倒入模具中，冷冻干燥成型，随后用交联剂进行化学处理，再进行冷冻干燥，最后得到复合支架材料。然而，通过上述方法制备的复合骨修复材料存在以下问题：（1）制备工艺复杂，需经过成型、冷冻干燥和化学交联等多个步骤；（2）支架成型后需要通过化学交联提高稳定性，但交联剂（如戊二醛）容易残留在支架中，造成细胞毒性；（3）复合支架含水率较低，不利于营养物质和代谢产物的运输。

改性明胶是由明胶侧链的活性氨基与甲基丙烯酸酐反应所得，在紫外光引发下发生自由基聚合反应形成水凝胶，改善了明胶力学性能差和降解速率快等缺点。明胶水凝胶具有良好的生物相容性和优异的加工性，同时与细胞外基质具有类似的结构，可为细胞黏附、增殖和分化提供良好的微环境。有研究者通过在明胶水凝胶中添加无机纳米粒子（纳米金颗粒、二氧化硅和羟基磷灰石等），以提高复合水凝胶的生物活性和成骨作用。

本发明采用光聚合反应原理制备生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶支架材料。该复合水凝胶具有良好的生物相容性和骨诱导能力；生物活性玻璃均匀分散在三维网络结构中，与改性明胶紧密结合，硅、钙和磷等离子溶出产物可缓慢释放；高含水率可保证营养物质和代谢产物的正常运输；制备过程简单，无需使用化学交联剂，在骨组织工程领域具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明目的在于针对现有技术和材料的不足，提供一种生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶及其制备方法，获得具有良好生物活性和骨诱导能力的复合水凝胶，可用于非承重部位骨缺损的治疗，实现骨组织的修复与再生。

本发明通过以下技术方案实现。

一种生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

1）将改性明胶和光引发剂2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2甲基苯丙酮（IRGACURE 2959）充分溶解于磷酸盐缓冲溶液中，得到改性明胶预聚物溶液；

2）在改性明胶预聚物溶液中加入生物活性玻璃粉体，超声分散和磁力搅拌，得到分散均匀的混合浆料；

3）将混合浆料倒入聚四氟乙烯模具中，在紫外光照射引发自由基聚合反应，将反应后的产物在磷酸盐缓冲溶液中溶胀以去除未反应的单体和光引发剂，得生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶。

进一步地，步骤1）所述改性明胶的甲基丙烯酰胺基取代度为40%-80%。

进一步地，步骤1）中改性明胶预聚物在改性明胶预聚物溶液中的浓度为7-15 w/v%，优选为10 w/v%。

进一步地，步骤1）所述的光引发剂在磷酸盐缓冲溶液中的浓度为0.1-1 w/v%。

进一步地，步骤2）所述的生物活性玻璃粉体为采用有机模板结合溶胶-凝胶法制备的微/纳米球形粉体。

进一步地，步骤2）所述超声分散30min和磁力搅拌4 h。

进一步地，步骤2）所述的生物活性玻璃粉体在混合浆料中的浓度为1-10 w/v%。

进一步地，步骤3）所述紫外光的波长为 254-400 nm，强度为 5-20 mW/cm² ，照射时间为 1-20 min。优选波长为365 nm，强度为 5m W/cm2。

由以上所述的制备方法得到的一种生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶。该生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶可应用于非承重骨缺损部位的治疗，促进骨组织的修复与再生。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明选取生物活性玻璃和改性明胶两种材料进行复合，在紫外光照射下发生自由基聚合反应形成复合水凝胶。该复合水凝胶具有良好的生物相容性和骨诱导能力；合成材料来源广泛，价格低廉；制备方法简单方便，且无需使用化学交联剂。

（2）本发明的复合水凝胶中生物活性玻璃均匀嵌入改性明胶水凝胶形成的三维网络结构中，与改性明胶通过物理方式（氢键）紧密结合，使硅、钙和磷等离子缓慢释放。且复合水凝胶含水率较高（80%以上），可保证营养物质和代谢废物的运输。

（3）改性明胶作为良好的细胞载体，在室温、短时间内即可成胶，可联合骨髓间充质干细胞和生长因子等构建功能化的骨组织工程。

（4）本发明的生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶可应用于骨缺损修复、药物缓释载体和骨组织工程等领域。

附图说明

图1a、图1b是本发明实施例1所得生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶在不同放大倍数的扫描电镜图；

图1c、图1d是本发明实施例2所得生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶在不同放大倍数的扫描电镜图；

图1e、图1f 是本发明实施例3所得生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶在不同放大倍数的扫描电镜图；

图2是本发明实施例2所得生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶的红外图谱；

图3是本发明实施例1、2、3所得生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶的含水率图；

图4是本发明实施例2所得生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶与小鼠骨髓间充质干细胞共培养24 h后的活死染色图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

（1）生物活性玻璃粉体的制备步骤：

生物活性玻璃粉体由有机模板结合溶胶-凝胶法制得，具体合成过程如下：先将40 g十二胺加入至250 ml去离子水和800 ml无水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入202 ml正硅酸乙酯，搅拌30 min；加入24 ml磷酸三乙酯，搅拌30 min；加入137 g四水硝酸钙；将得到的乳白色溶液继续搅拌3 h；最后将玻璃溶胶离心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于马弗炉650℃烧结3 h ，即得生物活性玻璃粉体。

（2）改性明胶（取代度为40%）的制备步骤：

改性明胶由明胶侧链的活性氨基与甲基丙烯酸酐反应所得，具体合成过程如下：先将2 g明胶加入至20 ml磷酸盐缓冲溶液中，在60℃恒温水浴锅中搅拌，制成10%明胶溶液；待明胶完全溶解，加入0.25 ml甲基丙烯酸酐，继续反应4 h；反应完后转至40 ℃恒温水浴锅中，加入40 ml磷酸盐缓冲溶液稀释终止反应，继续搅拌30 min；随后转移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反应的甲基丙烯酸酐和无机盐；最后将溶液置于-80℃冰箱中预冻，冷冻干燥后得到改性明胶（取代度为 40%）。

（3）生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶具体合成过程如下：先将1 g改性明胶（取代度为40%）和0.01 g光引发剂IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸盐缓冲溶液中，在 60℃恒温水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入0.1 g生物活性玻璃粉体，超声分散30 min，磁力搅拌4 h ，使生物活性玻璃均匀分散在溶液中；最后将混合浆料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm²的紫外光照射20 min，得到生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶。所得复合水凝胶在磷酸盐缓冲溶液中溶胀24 h以除去未反应的单体和光引发剂。

实施例2

（1）生物活性玻璃粉体的制备步骤：

生物活性玻璃粉体由有机模板结合溶胶-凝胶法制得，具体合成过程如下：先将4 g十二胺加入至25 ml去离子水和80 ml无水乙醇的混合溶液中，在40℃水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入20.2 ml正硅酸乙酯，搅拌30 min；加入2.4 ml 磷酸三乙酯，搅拌30 min；加入13.7 g四水硝酸钙；将得到的乳白色溶液继续搅拌3 h；最后将玻璃溶胶离心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于马弗炉650℃烧结5 h，即得生物活性玻璃粉体。

（2）改性明胶（取代度为60%）的制备步骤：

改性明胶由明胶侧链的活性氨基与甲基丙烯酸酐反应所得，具体合成过程如下：先将20 g明胶加入至200 ml磷酸盐缓冲溶液中，在60℃恒温水浴锅中搅拌，制成10%明胶溶液；待明胶完全溶解，加入10 ml甲基丙烯酸酐，继续反应4 h；反应完后转至40℃恒温水浴锅中，加入500 ml磷酸盐缓冲溶液稀释终止反应，继续搅拌30 min；随后转移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反应的甲基丙烯酸酐和无机盐；最后将溶液置于-80℃冰箱中预冻，冷冻干燥后得改性明胶（取代度为60%）。

（3）生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶具体合成过程如下：先将1 g改性明胶（取代度为60%）和0.05 g光引发剂IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸盐缓冲溶液中，在60℃ 恒温水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入0.5 g生物活性玻璃粉体，超声分散30 min，磁力搅拌4 h，使生物活性玻璃均匀分散在溶液中；最后将混合浆料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm² 的紫外光照射10 min，得到生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶。所得复合水凝胶在磷酸盐缓冲溶液中溶胀24 h以除去未反应的单体和光引发剂。

实施例3

（1）生物活性玻璃粉体的制备步骤：

生物活性玻璃粉体由有机模板结合溶胶-凝胶法制得，具体合成过程如下：先将8 g十二胺加入至50 ml去离子水和160 ml无水乙醇的混合溶液中，在40℃ 水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入40.4 ml正硅酸乙酯，搅拌30 min；加入4.8 ml磷酸三乙酯，搅拌30 min；加入27.4 g四水硝酸钙；将得到的乳白色溶液继续搅拌3 h；最后将玻璃溶胶离心得到白色沉淀，置于60℃干燥箱干燥24 h，再置于马弗炉650℃ 烧结3 h，即得生物活性玻璃粉体。

（2）改性明胶（取代度为80%）的制备步骤：

改性明胶由明胶侧链的活性氨基与甲基丙烯酸酐反应所得，具体合成过程如下：先将5 g明胶加入至50 ml磷酸盐缓冲溶液中，在60℃恒温水浴锅中搅拌，制成10%明胶溶液；待明胶完全溶解，加入5 ml甲基丙烯酸酐，继续反应4 h；反应完后转至40℃恒温水浴锅中，加入100 ml磷酸盐缓冲溶液稀释终止反应，继续搅拌30 min；随后转移至12k的透析袋中透析7 d，以除去溶液中未反应的甲基丙烯酸酐和无机盐；最后将溶液置于-80℃冰箱中预冻，冷冻干燥后得改性明胶（取代度为80%）。

（3）生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶具体合成过程如下：先将1 g改性明胶（取代度为80%）和0.1 g光引发剂IRGACURE 2959加入至10 ml磷酸盐缓冲溶液中，在60℃恒温水浴锅中搅拌至完全溶解；随后加入1 g生物活性玻璃粉体，超声分散30 min，磁力搅拌4 h，使生物活性玻璃均匀分散在溶液中；最后将混合浆料加入至聚四氟乙烯模具中，在365 nm、5 mW/cm² 的紫外光照射1 min，得到生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶。所得复合水凝胶在磷酸盐缓冲溶液中溶胀24 h以除去未反应的单体和光引发剂。

对实施例1、2、3所得的生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶进行性能表征，所得扫描电镜图如图1a、图1b、图1c、图1d、图1e、图1f所示，三种生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶均呈现窝蜂状的连通多孔结构，孔径范围为200-500 μm，且生物活性玻璃颗粒均匀嵌入在复合水凝胶的三维网络中。图2为实施例2所得生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶的红外图谱，其中a曲线为10%改性明胶的红外谱图，呈现出典型的明胶蛋白所特有的酰胺峰，其中包括在1702 cm^-1酰胺I带的C=O 伸缩峰，在1540 cm^-1酰胺II带的N-H伸缩振动峰。b曲线为生物活性玻璃的红外图谱，1091，802和474 cm^-1处分别为生物活性玻璃中典型的Si-O-Si非对称伸缩振动峰，Si-O的对称伸缩振动峰以及Si-O-Si的对称弯曲振动峰。c曲线为复合水凝胶的红外图谱，同时出现生物活性玻璃和改性明胶的特征峰，可证明复合水凝胶中同时存在生物活性玻璃和改性明胶。其它实施例的生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶的红外图谱与图2相似，均能证明复合水凝胶中同时存在生物活性玻璃和改性明胶。图3显示实施例1、2、3的生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶均具有较高的含水率（80%以上），可保证营养物质和代谢废物的运输。图4为小鼠骨髓间充质干细胞在实施例2的生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶培养24 h的活死染色图，可见细胞能在水凝胶表面黏附，呈梭形状，具有较好的细胞活力。其它实施例的生物活性玻璃-改性明胶复合水凝胶的活死染色情况与实施例2相似，均可见细胞能在水凝胶表面黏附，呈梭形状，具有较好的细胞活力。