本发明涉及医疗技术领域，具体涉及一种脐带血干细胞治疗肌营养不良症的方法。
背景技术：
肌营养不良症(MD)是指人体运动肌肉变弱的一组遗传性的肌肉疾病，肌营养不良症特点是进行性骨骼肌无力、肌肉蛋白缺陷、肌肉细胞和组织死死亡等。
假肥大性肌营养不良(DMD)，也称Duchenne型肌营养不良症(DMD)，是一类儿童最常见的进行性肌营养不良症，当一个孩子开始走路时，就有很明显的临床表现，患者通常在10到12岁不能正常行走，需要坐轮椅，一般死于十几岁到二十几岁之间。在男性中，Duchenne型肌营养不良症(DMD)的发病率为1/3500。
在基因治疗领域，尽管加强动物实验或临床前的研究，但是肌营养不良症还没有办法治愈。目前主要的治疗方法有两种：一种是反义寡核苷酸疗法，另一种是使用腺相关病毒经行治疗。然而，无论是利用反义寡核苷酸法或全身性腺病毒法经行治疗，都只能产出一个短暂的效果。由于免疫反应和高昂的费用，要想长期使用是不可能的。
治疗肌营养不良症，干细胞疗法是最具有应用前景的一种治疗方法。对于自体干细胞疗法，一是iPS细胞可以产生和再分化成肌肉干细胞并通过同源重组校正患病的基因，这种方法的主要障碍是：耗时、费力和要把iPS细胞衍生的肌肉干细胞移植到体内。二是纯化供者提供的肌肉干细胞或成血管干细胞然后回输到患者体内，然而，异基因的即使是造血干细胞移植也需要长期使用免疫抑制剂来阻止免疫排异反应。
目前，还没有治愈MD的方法，在不久的将来，基因治疗方法，如反义寡核苷酸或AAV能够用于临床试验。然而，这些治疗不能修正遗传突变，只能产生一个短暂的影响。更重要的是，反复的运用反义寡核苷酸或AAV会引起强烈的免疫反应，因此，要避免长期使用。
参考文献：
1.Butler MG,Menitove JE(2011)Umbilical cord blood banking:an update.J Assist Reprod Genet.
2.Forraz N,McGuckin CP(2011)The umbilical cord:a rich and ethical stem cell source to advance regenerative medicine.Cell Prolif 44Suppl 1:60-69.
3.Kuang S,Kuroda K,Le Grand F,Rudnicki MA(2007)Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle.Cell 129:999-1010.
4.Darabi R,Santos FN,Filareto A,Pan W,Koene R,et al.(2011)Assessment of the myogenic stem cell compartment following transplantation of Pax3/Pax7-induced embryonic stem cell-derived progenitors.Stem Cells 29:777-790.
5.Sousa-Victor P,Munoz-Canoves P,Perdiguero E(2011)Regulation of skeletal muscle stem cells through epigenetic mechanisms.Toxicol Mech Methods 21:334-342.
6.Messina G,Sirabella D,Monteverde S,Galvez BG,Tonlorenzi R,et al.(2009)Skeletal muscle differentiation of embryonic mesoangioblasts requires pax3 activity.Stem Cells27:157-164.
7.Christov C,Chretien F,Abou-Khalil R,Bassez G,Vallet G,et al.(2007)Muscle satellite cells and endothelial cells:close neighbors and privileged partners.Mol Biol Cell 18:1397-1409.
8.Kuang S,Gillespie MA,Rudnicki MA(2008)Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.Cell Stem Cell 2:22-31.
9.Pituch-Noworolska A,Majka M,Janowska-Wieczorek A,Baj-Krzyworzeka M,Urbanowicz B,et al.(2003)Circulating CXCR4-positive stem/progenitor cells compete for SDF-1-positive niches in bone marrow,muscle and neural tissues:an alternative hypothesis to stem cell plasticity.Folia Histochem Cytobiol 41:13-21.
10.Lee AS,Kahatapitiya P,Kramer B,Joya JE,Hook J,et al.(2009)Methylguanine DNA methyltransferase-mediated drug resistance-based selective enrichment and engraftment of transplanted stem cells in skeletal muscle.Stem Cells 27:1098-1108.
11.Sampaolesi M,Blot S,D'Antona G,Granger N,Tonlorenzi R,et al.(2006)Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs.Nature 444:574-579.
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可将造血干细胞转化成肌干细胞，由脐血造血干细胞分化而来的肌肉干细胞进行移植，具有更好的移植能力的脐带血干细胞治疗肌营养不良症的方法。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：一种脐带血干细胞治疗肌营养不良症的方法，它包含以下步骤：
(S1)获得HLA相合的脐带血；
(S2)按照免疫磁珠法富集CD34+细胞；
(S3)非清髓处理后，将50％的CD34+细胞和所有CD34-细胞移植入病人体内；
(S4)剩余50％的CD34+细胞通过因子组合增加转化效率，将脐带血干细胞转化成肌肉干细胞；
(S5)将中间干细胞移植给患者；
(S6)移植的肌肉干细胞分化成有功能的肌肉干细胞；
(S7)肌肉干细胞繁殖并分化成肌肉组织。
作为本发明的进一步改进；所述的步骤(S1)-步骤(S2)中，HLA相合的脐带血可以从脐血库中获取，若不能得到HLA相合脐带血的情况下，6个位点有1到2个不匹配时依旧可以使用，解冻后的脐带血将按照免疫磁珠法的标准纯化富集CD34+细胞。
作为本发明的进一步改进；所述的步骤(S3)中，非清髓预处理的标准是：氟达拉滨(180mg/mm)+二甲磺酸丁酯(8-16mg/kg)或ATG抗胸腺细胞球蛋白(10-50mg/kg)或者是2-3Gy剂量的非全身照射，移植后，给予病人标准护理。CD34+细胞含有造血干细胞，能重建造血和免疫系统，CD34-细胞中存在免疫细胞，能够阻止移植排异反应。
作为本发明的进一步改进；所述的步骤(S4)中的因子组合是OCT4+PAX7，PAX3和/或MyoD，可以增加转化效率。这几个基因同在一个2a肽表达载体上，另外，在分化的早期阶段，将单独使用Oct4基因。而在分化后期，会用到多个基因。
基因瞬时表达载体：以EB病毒核抗原(EBNA1)为基础的游离性载体，在转染后的3周，只有1％的细胞可以检测到这种载体。辅助非依赖型载体Ad5/35，能够有效的感染人脐血细胞和中胚层干细胞，转染后的几天，基因可以维持高水平的表达。每3-5天，重新进行转染以维持基因的表达水平。
基因调控：把一个Tet-on调控原件整合到上述载体中以提高其安全性。
作为本发明的进一步改进；所述的步骤(S5)中，为了增加中间干细胞的移植，对其转染因子CXCR4和/或在缺氧条件下诱导CXCR4的表达；或者使用肌肉损伤的药物以增加可用的干细胞龛。
采用上述技术方案后，本发明具有以下有益效果：
1、脐带血是最容易获得的干细胞移植来源。
2、造血干细胞移植是能够诱导中枢免疫耐受的唯一证明方法，防止移植的同种异体细胞、组织和器官的排斥反应。
3、可将造血干细胞转化成肌干细胞。
4、中间干细胞用于移植是最好的，并且与成体干细胞相比由脐血造血干细胞分化而来的肌肉干细胞进行移植具有更好的移植能力。
5、脐带血移植为正常的异基因肌肉干细胞的移植提供了中枢免疫耐受的环境。
6、由胎儿的血细胞转化而来的中间干细胞具有超凡的自我更新能力。在移植入肌肉干细胞龛中后，细胞经行增殖和植入，并且它们会转变成全功能的肌肉干细胞。
附图说明
图1为本发明所提供的实施例的流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
请参阅图1，本具体实施方式采用以下技术方案：一种脐带血干细胞治疗肌营养不良症的方法，它包含以下步骤：
(S1)获得HLA相合的脐带血；
(S2)按照免疫磁珠法富集CD34+细胞；
(S3)非清髓处理后，将50％的CD34+细胞和所有CD34-细胞移植入病人体内；
(S4)剩余50％的CD34+细胞通过因子组合增加转化效率，将脐带血干细胞转化成肌肉干细胞；
(S5)将中间干细胞移植给患者；
(S6)移植的肌肉干细胞分化成有功能的肌肉干细胞；
(S7)肌肉干细胞繁殖并分化成肌肉组织。
本具体实施方式的具体实施方法及原理如下：
1、脐带血干细胞：
大部分情况下，HLA相合的脐带血可以从脐血库中获取。如果不能得到HLA相合脐带血的情况下，6个位点有1到2个不匹配时依旧可以使用，解冻后脐带血的将按照免疫磁珠法的标准纯化富集CD34+细胞。
2、脐血移植：
非清髓预处理后，将一半CD34+细胞和所有的CD34-细胞移植入病人体内。CD34+细胞含有造血干细胞，能重建造血和免疫系统，CD34-细胞中存在免疫细胞，能够阻止移植排异反应。
非清髓预处理的标准是：如氟达拉滨(180mg/mm)+二甲磺酸丁酯(8-16mg/kg)或ATG抗胸腺细胞球蛋白(10-50mg/kg)或者是2-3Gy剂量的非全身照射，移植后，给予病人标准护理。
3、造血干细胞分化成成肌干细胞：
几种因子组合的使用：
1)OCT4，能够将血液干细胞转化成中胚层干细胞并促进中胚层干细胞的增殖；
2)PAX3和PAX7，配对盒转录因子PAX7在胎儿发育过程中起着关键的作用，这种蛋白对肌肉干细胞的更新和维护是必不可少的。此外，在损耗其他间充质细胞系的情况下，PAX3可以促进间充质干细胞和成血管干细胞向肌源性细胞系分化；
3)MyoD，MyoD是主要的肌源性转录因子，这在肌肉卫星细胞(肌肉干细胞)分化中起着重要作用。Pax7和MyoD表达与激活的卫星细胞存在有关，在骨骼肌增生及肥厚性增生中也起着重要的作用。
最优的因子组合是OCT4+PAX7，PAX3和/或MyoD可以增加转化效率。这几个基因同在一个2a肽表达载体上，另外，在分化的早期阶段，将单独使用OCT4基因。而在分化后期，会用到多个基因。
基因瞬时表达载体：
1)以EB病毒核抗原(EBNA1)为基础的游离性载体。在转染后的3周，只有1％的细胞可以检测到这种载体；
2)辅助非依赖型载体Ad5/35，能够有效的感染人脐血细胞和中胚层干细胞，转染后的几天，基因可以维持高水平的表达。每3-5天，重新进行转染以维持基因的表达水平。
基因调控，即使是非整合型DNA载体，106个感染细胞中可能会有1-10个细胞发生非正常的基因整合，因此，把一个Tet-on调控原件整合到上述载体中以提高其安全性。
4、中间干细胞移植：
转分化和增殖的干细胞是这些中间干细胞，OCT4基因存在的情况下，会阻止血液干细胞完全分化成肌肉干细胞。然而，移植几天后，OCT4和其他因子表达水平降低，此时中间干细胞细胞可以分化成功能性的肌肉干细胞，这表明在受损的肌肉组织中，可以进一步加速中间干细胞向肌肉干细胞和祖细胞分化。一些移植的干细胞可能无法植入肌肉细胞，这些细胞最终死亡或转变成间充质干细胞。
干细胞移植是外周血中的干细胞通过血管屏障迁移到干细胞生态位的过程，在静止和增殖这两种状态下，分别占人类和小鼠68％和82％卫星细胞，发现定位与从邻近的毛细血管或血管内皮细胞5μm范围内。类似于造血干细胞，像肌肉干细胞这类的干细胞的迁移是通过SDF1/CXCR4轴来实现的，受损或炎症组织高水平表达配体SDF-1，吸引表达受体CXCR4细胞的迁移。
肌营养不良症患者的肌肉不断地被破坏，为了增加中间干细胞的移植，可以对其转染因子CXCR4和/或在缺氧条件下诱导CXCR4的表达。也可以使用肌肉损伤的药物以增加可用的干细胞龛。
对于婴幼儿肌肉萎缩症，一半的脐带血进行移植以诱导中枢免疫耐受性，一半的脐带血干细胞通过转染一组主要的转录因子以将造血干细胞转化成肌肉干细胞。这些注射的干细胞不是造血干细胞，不能形成肌肉，尚未成为肌肉干细胞，因为全身给药后，全身肌肉组织移植是相当困难的。这些干细胞是具有造血干细胞和肌肉干细胞特性的中间的干细胞，它们处在中胚层干细胞或成血管细胞向成肌肉干细胞转化的过程中。移植后，它们会迁移到损伤和炎症部位，进一步分化转移和将肌肉干细胞转化为成熟的肌肉组织。
中间干细胞可以介导所有的器官和组织移植，然而，只有这些细胞移植在损伤肌肉中，它们才分泌多能因子完成转分化过程、促进存活和增殖并分化成成熟的肌肉组织。移植后若干天后，残留在血液循环中的中间细胞会逐渐死去，而那些移植的非肌肉组织的细胞最终将转变为中胚层细胞或间充质干细胞，这些细胞最终形成结缔组织。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。