用于治疗B细胞恶性肿瘤的手段和方法与流程
背景技术：
b细胞恶性肿瘤(血液形成器官的恶性疾病，以b细胞及其前体在淋巴结、血液和/或骨髓中的异常增殖和发育为特征)代表了具有广泛不同特征和临床行为的一组异质性疾病，在美国每年仍造成超过15000例死亡。
每种b细胞恶性肿瘤都是在b细胞淋巴细胞增殖的不同阶段发生的遗传和表观遗传异常的结果。b细胞淋巴瘤(以b淋巴细胞或其前体的恶性转化为特征的淋巴组织恶性肿瘤)包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(nhl)，b细胞白血病(一类造血组织恶性肿瘤，特征在于b细胞及其前体在血液和骨髓中的异常增殖和发育)是最常见的儿童癌症之一。b细胞发育期间各种表面标志物的动态表达提供必要的生长、分化、成熟和存活信号。当在任何给定阶段的b细胞恶变时，其细胞表面分子和相关细胞内信号传导分子的表达模式以及与该发育阶段相关的过表达基因产物被传递到其克隆恶性衍生物上。
尽管在临床护理方面取得了进展，但许多成熟的b细胞恶性肿瘤仍然无法治愈。历史上，大多数受影响的患者接受通常与放疗联合的细胞毒性剂的组合，目的是达到持久缓解，并在某些情况下治愈。然而，许多传统的方案也具有相当大的急性和长期毒性。干细胞移植(通常是患有急性形式或发生化疗耐药性的患者的最后一种替代方案)伴有相当大的会威胁生命的排斥反应风险。最近的治疗方法集中于单克隆抗体，诸如利妥昔单抗(抗cd20)、抗体缀合物和识别b细胞表面抗原的cart细胞。尽管许多人的生存有所改善，但是长期缓解罕见，疾病复发仍是一个主要问题。此外，常规生物治疗剂所靶向的大多数表面抗原并非专门在导致该疾病的恶性b细胞上表达，因此由于靶向表达相同表面分子的其他(健康)细胞而具有大量且可能危及生命的副作用的风险。此外，许多被靶向的表面标志物在恶性b细胞上不能以足够多的数量表达，因此不能使其有效消耗。而且，大多数结合分子如抗体都相当大，这对其生物分布和生物利用率有负面影响，并且其生产成本也相对较高。
总而言之，有效的治疗因此仍然受到可用治疗选择缺乏特异性的阻碍，这通常会导致严重的副作用并且不能有效消除患者中的所有恶性b细胞。
wo2010/085345a1进一步一般性地公开了与治疗剂、细胞毒性剂或诊断剂偶合的人磷酸化paratarg或其表位。paratarg(stomatin样蛋白2)已在患有意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(mgus)的患者中被鉴定为由分泌的副蛋白(即，由终末分化的浆细胞的异常克隆增殖而过量产生的异常免疫球蛋白片段)识别的共同抗原性靶标，这种病症受到血液中副蛋白水平显著增加的限制。然而，考虑到所述患者的血液中副蛋白过量，作为非功能性paratarg“清除剂”，该方法在患者中是非常不可行的，原因有二：第一，mgus中的恶性细胞是浆细胞而浆细胞不在其表面携带b细胞受体。因此，bcr不能靶向这种疾病中的恶性细胞，而是被分泌的“诱饵”副蛋白结合和捕获，甚至没有到达产生副蛋白的恶性浆细胞。第二，mgus和mm两者的特征在于：免疫球蛋白形式的大量可溶性bcr(即副蛋白)分泌到并存在于相应患者的血清中。重组bcr抗原(即paratarg)的全身性应用将导致免疫复合物的形成，具有免疫复合物病的高风险。使用毒素缀合bcr抗原会导致各种器官的内皮细胞中毒性免疫复合物的沉积，从而造成这些器官的相当大的损伤和可能的坏死，例如免疫复合物肾炎、免疫复合物血管炎和其他免疫复合物介导的炎症反应。因此，从wo2010/085345a1中显然不能预见：靶向表面表达的bcr而不是非功能性分泌副蛋白的抗原缀合物将可用于治疗如本文所述的b细胞恶性肿瘤，即，以表达功能性表面bcr且优选不与丙种球蛋白病(血液中副蛋白过量)相关的恶性b细胞为特征的b细胞恶性肿瘤。
鉴于上述情况，本领域迫切需要提供用于治疗b细胞恶性肿瘤的特异、安全且有效的新的改进的治疗剂。
技术实现要素：
本发明涉及与诊断剂和/或治疗剂缀合的b细胞受体(bcr)抗原，其旨在用于诊断和/或治疗患者中的b细胞恶性肿瘤的方法。据设想，b细胞恶性肿瘤的特征在于存在表达bcr(特别是在细胞表面上表达的功能性bcr)的恶性b细胞，特别是克隆恶性b细胞。
缀合bcr抗原可用于治疗多种b细胞恶性肿瘤，包括慢性淋巴细胞白血病(cll)、b细胞幼淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、脾伯基特氏淋巴瘤、b细胞非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(pcnsl)、或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(nlphl)、毛细胞白血病(hairycellleukemia)、脾淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的结节边缘带区淋巴瘤(malt淋巴瘤)、淋巴结边缘带区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘带区淋巴瘤、原发皮肤滤泡中心淋巴瘤、富于t细胞/组织细胞的大b细胞淋巴瘤(t-cell/histiocyterichlargeb-celliymphoma)、淋巴瘤样肉芽肿、原发性纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、alk阳性大b细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤或原发性渗出性淋巴瘤。
bcr抗原可以包括肽、多肽、蛋白质、脂质或多糖。它可以选自自身抗原、外源性抗原、同种异体抗原或异种抗原。bcr可以是翻译后修饰或未修饰的。
据预期，患者中恶性b细胞的bcr识别缀合bcr抗原，和/或缀合bcr抗原能够结合到所述b细胞，特别是通过它们的bcr。缀合bcr抗原也可以在结合它们的bcr之后被恶性b细胞内化。进一步设想，本发明的缀合bcr抗原能够减少患者中表达bcr的恶性b细胞的数量。
设想缀合bcr抗原能够引起一种或多种下列有益效果：减少恶性b细胞的数量，抑制恶性b细胞的活化和/或增殖，和/或杀灭恶性b细胞。
与bcr抗原缀合的治疗剂可以选自放射性核素、结合剂(bindingagent)、cart细胞或毒素。合适的毒素包括化学毒素、化学治疗剂和蛋白质毒素。结合剂尤其可以能够结合免疫效应细胞，例如，自然杀伤细胞、巨噬细胞、(细胞毒性)t细胞或嗜中性粒细胞。用于本发明的bcr缀合物的特别合适的结合剂包括cd3结合剂、cd16结合剂或cd38结合剂。本文所述的结合剂可以选自单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、scfv、微抗体(minibody)、fv、fab、fab'或f(ab’)2片段。
在本发明的bcr抗原缀合物中可用作治疗剂的化学治疗剂包括细胞抑制剂诸如烯啶(enidyene)、倍癌霉素(duocarmycin)、氨甲喋呤(methothrexate)、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、ara-c、长春地辛、丝裂霉素c、顺铂、依托泊苷、博来霉素、vedotin、emtansin、5-氟尿嘧啶或酪氨酸激酶抑制剂。
本文还提供了与诊断剂和/或治疗剂缀合的bcr抗原在诊断和/或治疗如本文所定义的b细胞恶性肿瘤的方法中的用途。
此外，本发明涉及诊断或治疗患者中如本文所定义的b细胞恶性肿瘤的方法，其包括
(i)提供与诊断剂或治疗剂(优选地如本文所定义的)缀合的bcr抗原；
(ii)将所述缀合bcr抗原施用给患者。
本发明还提供了与治疗剂(优选地如本文所定义的)缀合的bcr抗原，其能够结合患有如本文所定义的b细胞恶性肿瘤的患者中的恶性b细胞的bcr，并且在bcr与缀合bcr抗原结合之后，还能够变得内化。
此外，本发明提供了包含如本文所定义的缀合bcr抗原和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
另一方面，本发明涉及用于鉴定患有如本文所定义的b细胞恶性肿瘤、有倾向对本发明的缀合bcr抗原有利地起反应的患者的非侵入性(non-invasive，无创性)方法。
附图说明
图1：证明携带对ars2具有特异性的bcr的abc-dlbcl细胞系oci-ly3对ars2的结合和内化。a：细胞的制备；b-d：在t＝0时的流式细胞术；e-g：温育1小时后的流式细胞术(t＝1)。
图2：通过毒素缀合的bar对abc-dlbcl淋巴瘤细胞的增殖抑制。重组ars2/假单胞菌外毒素缀合物(ars-eta)特异性杀灭来自具有ars2特异性bcr的abc-dlbcl细胞系的细胞(u2932，oci-ly3)，而具有除ars2之外的bcr特异性的abc-dlbcl细胞(hbl-1，tmd8)不受影响。neurabin1(2/3原发性csn淋巴瘤的抗原性靶标)的对照bar/毒素缀合物nrb1-eta对任何细胞系都没有毒性。
图3：在体外通过假单胞菌-外毒素缀合的ars2进行ocy-l3细胞的bcr特异性杀灭。只有ars2毒素杀灭具有ars2特异性bcr的ocy-l3；作为对照，假单胞菌-外毒素缀合的neurabin(来自2/3cns淋巴瘤的bcr特异性抗原)不影响ocy-l3细胞。
图4：在体内重组假单胞菌-外毒素缀合的ars2对具有ars2特异性bcr的abc-dlbcl细胞系(oci-ly3)的特异性细胞毒性。在第9天将5×106个oci-ly3细胞注射到scid米色小鼠的胁腹中。在第6天，小鼠接受单次静脉内注射15μg毒素缀合的ars2或毒素缀合的neurabin。绿色曲线表示接受ars2毒素的3只小鼠的肿瘤体积(±sem)，红色曲线表示接受对照毒素(假单胞菌-外毒素缀合的neurabin，2/3原发性cns淋巴瘤的bcr抗原)的3只小鼠的肿瘤体积(±sem)。
图5：双特异性cd3-ars2构建体与dlbcl细胞系的结合。a：u2932(ars2反应性的)，b：hbl-1(不是ars2反应性的)，c：oci-ly3(ars2反应性的)。颜色代码：红色＝淋巴瘤细胞+pbs；黑色＝淋巴瘤细胞+ars2；绿色＝淋巴瘤细胞+ars2-cd3。该构建体特异性且专一地结合表达对ars2具有特异性的bcr的细胞系。
图6：cd3-ars2与外周血单核细胞(pbmc)的结合。a：结合到健康对照的pbmc。结果显示cd3-ars构建体在健康供体的外周血中结合cd4阳性和cd8阳性t细胞。b：用cd4-fitc和cd3-ars(apc)双重染色。c：用cd8-fitc和cd3-ars(apc)双重染色。
图7：外周血单核细胞(t细胞)对不同弥漫性大b细胞系的cd3-ars-2介导的细胞毒性。仅观察到表达具有针对ars-2的特异性的bcr的细胞系(ocily3，u2932)的细胞毒性。a-c：将不同的淋巴瘤细胞系和pbmc与cd3-ars2在不同的浓度下温育。根据制造商的说明，通过测定ldh释放来评估细胞毒性。
具体实施方式
在此，本发明人提供了使用b细胞受体(bcr)的毒性诱饵靶向b细胞恶性肿瘤中的肿瘤性b细胞的新方法。自然地，bcr在正常(和恶性)b细胞表面上的主要功能是识别和结合其特异性抗原。抗原结合之后，b细胞受体/抗原复合物迅速内化。在作为抗原呈递细胞的b细胞表面上的mhc复合物的情况下，对抗原进行加工并将其片段呈递给t细胞。
与bcr结合后，bcr抗原刺激b细胞并诱导增殖。已经提出，经由b细胞的bcr对b细胞的慢性抗原性刺激是b细胞淋巴瘤发展中涉及到的机制，并且在发展的早期，b细胞淋巴瘤依赖于抗原而存活。本发明人设想，由于bcr抗原与bcr的结合导致bcr/抗原复合物的快速内化(“进食”)，所以当bcr抗原偶合至可杀灭淋巴瘤细胞的药剂时bcr抗原可用作致死性诱饵。实际上，发明人发现，毒素缀合的bcr抗原可以在体外甚至体内抑制或杀灭靶向的b细胞，如通过scid小鼠中abc-dlbcl细胞的肿瘤大小的显著减小所证明。这些发现显然令人惊讶，因为在本领域中众所周知的是，b细胞与其特异性抗原的相遇导致b细胞的活化和增殖。因此，无法预见，缀合bcr抗原确实能够相反地作用并且抑制甚至杀灭恶性b细胞。这个原理也是新颖的，因为迄今为止只有很少的bcr抗原在分子上被定义，并且完全是作为研究b细胞淋巴瘤的病因和发病机制的结果。目前尚未提出使用bcr抗原作为治疗b细胞恶性肿瘤的治疗剂。在对bcr抗原的系统性搜索中，本发明人首先鉴定了在多种b细胞恶性肿瘤中的主要bcr抗原。对于所有这些类型的b细胞恶性肿瘤，bcr抗原缀合物代表了一种新的治疗选择，并且可以满足尚未满足的医疗需求。
由于bcr在淋巴瘤细胞表面上大量存在(大约是作为单克隆抗体利妥昔单抗的靶标的cd20分子的频率的十倍，利妥昔单抗是所有b细胞淋巴瘤的标准一线治疗的一部分)，所以b细胞淋巴瘤细胞对特异性的缀合bcr抗原高度敏感。而且，由于bcr抗原对各个淋巴瘤细胞具有特异性，并且在身体的任何其他b细胞或其他细胞上都没有发现，所以这种治疗具有高度的和极致的特异性。因此，本文所提供的bcr抗原缀合物具有独特的特异性，因为它们仅靶向恶性细胞，使身体的所有其他细胞不受影响。
如果将缀合bcr抗原用作car-t细胞的一部分或用作双特异性构建体，则应当尤其具有重要意义。cart细胞和双特异性抗体如blinatumomab是有效的治疗策略，但毒性很大，这可能是由于正常交叉反应性细胞的非特异性激活所致。
作为另一个优点，bcr结合性表位可以仅由少量分子组成，例如，跨越10至20个氨基酸的肽，从而保持低生产成本。由于缀合物的可能的小尺寸，缀合物在药理学修饰方面(例如用于穿透血脑屏障)提供了很大的灵活性和多种机会。
本文提出的方法也被称为“bar”，它是“用于反向靶向的b细胞受体抗原”的缩写，因为这种方法逆转了广泛使用的抗体策略(其中抗体结合到恶性细胞上的抗原)，而bar则是结合到b细胞淋巴瘤细胞表面上的bcr的抗原。由于抗体的亲和力可以通过突变而增加，预计突变也可以增加bar与其bcr的亲和力。
由于bcr抗原缀合物具有预期的低毒性和高效力，因此假定本文提出的方法最终将成为标准一线治疗的一部分，对于大多数b细胞淋巴瘤而言，标准一线治疗由r-chop(联合化疗和利妥昔单抗)组成。将bcr抗原缀合物加入标准r-chop应该是可行的，但也可以在治愈率接近100％的患者亚群(例如，具有有利dlbcl的年轻患者)中设想替换r-chop组合中的组分(最可能的候选物：长春新碱)，在该患者亚群中，降低毒性成为了一个问题。
因此，本发明提供了将用于诊断和/或治疗患者中的b细胞恶性肿瘤的方法的与诊断剂和/或治疗剂缀合的b细胞受体(bcr)抗原。
bcr抗原缀合物
本文中“与诊断剂和/或治疗剂缀合的b细胞受体抗原”也缩写为“缀合bcr抗原”、“bcr抗原缀合物”、“bar”或“缀合物”，并且表示缀合到(即连接到)治疗剂和/或诊断剂的并优选地由存在于患者体内的恶性b细胞的bcr识别的抗原。也称本发明的缀合物包含“抗原性部分”或“抗原性靶标”，即bcr抗原；和“治疗/诊断部分”，即治疗剂或诊断剂。术语“抗原”是指能够被选择性结合剂例如bcr结合的分子或分子的一部分。抗原可以具有一个或多个表位。所有语法形式的术语“缀合”是指抗原和药剂通过以下一者或多者相互连接或结合：一个或多个共价键、一个或多个离子键、一个或多个永久偶极子键、一个或多个瞬时偶极子-感应偶极子键(范德华力)。术语“偶合(到)”、“连接(到)”、“缀合(到)”在本文中可互换使用。具体地讲，设想bcr抗原缀合物能够结合到患有b细胞恶性肿瘤的患者中的恶性b细胞的bcr。根据预期的作用模式，例如当偶合到毒素时，bcr抗原缀合物应被恶性b细胞内化，且优选释放毒素以杀灭恶性b细胞。然而，当例如偶合到结合剂、cart细胞或诊断剂时，则以下情况可能就已足够：bcr抗原缀合物结合到恶性b细胞的bcr，从而使恶性细胞和治疗剂或诊断剂紧密接近，使得检测恶性细胞(例如在诊断剂与bcr抗原缀合的情况下)或杀灭恶性细胞(例如在cart细胞或能够结合并活化细胞毒性效应细胞的抗体与bcr抗原缀合的情况下，所述效应细胞包括但不限于t细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞)是可能的。
b细胞和bcr
术语“b细胞”或“b淋巴细胞”以其最广泛的含义包括前b细胞、未成熟的b细胞、成熟的初始b细胞、成熟的活化b细胞、记忆b细胞、b谱系淋巴细胞或任何其他b谱系细胞。技术人员将容易地理解，本发明的潜在原理是将“毒性诱饵”(即bcr抗原缀合物)靶向存在于患者中的恶性b细胞的bcr，该恶性b细胞优选地在细胞表面上表达优选能够识别(即结合)本发明的bcr抗原缀合物的bcr，优选地功能性bcr。也就是说，在本发明的上下文中，设想术语“b细胞”优选地排除浆细胞，即b细胞谱系的终末分化细胞，这些细胞以高速率分泌抗体并且已知缺乏在其表面上表达(功能性)b细胞受体(bcr)。b细胞可以进一步通过特异性细胞表面标志物(包括cd19、cd20、cd22、cd23、cd79、igm、igd、igg或iga)的表达来表征，如可以通过流式细胞术所鉴定。
“b-细胞受体”或“bcr”是一种跨膜受体蛋白复合物，其由b细胞专门表达并包含与称为ig-α/ig-β(cd79)的异二聚体相关联的克隆可变抗原结合部分-重链和轻链免疫球蛋白链，它们通过二硫键结合在一起。二聚体的每个成员跨越质膜并具有含免疫受体酪氨酸活化基序(itam)的胞质尾区。b细胞受体复合物的抗原结合部分是细胞表面免疫球蛋白，其具有与b细胞最终将产生的分泌抗体相同的抗原特异性。因此，完整的b细胞受体被认为是六条链的复合物-两条相同的轻链、两条相同的重链、一条igα和一条igβ。不希望受到理论的束缚，据认为，bcr优选地由未成熟的b细胞、初始b细胞和成熟的b细胞表达，而在细胞表面上的b细胞受体表达可能在浆细胞中丧失。
b细胞恶性肿瘤
术语“b细胞恶性肿瘤”或“b细胞肿瘤”以其最广泛的含义是指b细胞的恶性肿瘤或赘生物，即来源于b细胞的任何阶段。该术语涵盖b细胞淋巴瘤、b细胞白血病和骨髓瘤。根据本发明的b细胞恶性肿瘤的特征在于存在恶性b细胞，优选表达bcr的克隆恶性b细胞。“恶性”细胞在其生长中通常不是自限性的，能够侵入邻近组织，并且可能能够扩散到远处组织(转移)。当在本文中使用时，“恶性”与“癌”同义。当在本文中使用时，术语“恶性b细胞”特别设想是指可以逃避凋亡、显示出生长信号的自给自足和/或对于抗生长信号表现出不敏感性的b细胞，如使用本领域已知的常规方法可确定的。例如，可以如elmorestoxicolpathol.2007；35(4):495-516中的综述，例如通过评估半胱天冬酶活性来确定逃避凋亡。如本文其他地方所述，设想用本发明的bcr抗原缀合物治疗的b细胞恶性肿瘤包括特别是不与克隆恶性浆细胞和/或丙种球蛋白病相关的那些恶性肿瘤。
术语“克隆”b细胞是指这样一组b细胞：其优选地起源于单个祖细胞且通常与之在遗传上相同。“通常在遗传上相同”是指克隆b细胞可以包含使它们彼此区分的自发突变。然而，据设想，克隆恶性b细胞表达具有相同抗原特异性的bcr，即，识别相同的抗原，从而可以用相同的bcr抗原缀合物靶向。
可以使用本领域已知的常规方法评估克隆恶性b细胞的存在。克隆恶性b细胞的存在通常最初因出现扩大的淋巴结或者在全血细胞计数(cbc)化验中存在淋巴细胞增多(一种类型的白细胞增加)而被怀疑。此外，显微镜检查和/或流式细胞术可以用于证明患者中b淋巴细胞的异常(即克隆恶性)群体，通常在从血液、骨髓、淋巴结或淋巴外组织等获得的样品中，具体取决于b-细胞恶性肿瘤的类型。恶性b细胞通常在细胞表面上表达非典型但特征性模式的分子，如可通过流式细胞术使用具有识别所述标志分子的荧光标记的特异性抗体确定的。克隆性通常可以通过在整个群体的异常b细胞上仅检测一种相互排斥的免疫球蛋白轻链κ或λ来推断。正常的b淋巴细胞由一组不同的免疫球蛋白生成细胞组成，从而产生κ和λ表达性细胞的混合物。κ和λ产生性b细胞的正常分布的缺乏是证明克隆性的一个基础。
考虑本发明的缀合bcr抗原可用于治疗多种b细胞恶性肿瘤，优选地因在表面上表达功能性bcr的克隆恶性b细胞的存在而引起的以及与所述克隆恶性b细胞的存在相关联的那些恶性肿瘤，如本文其他地方所解释的。此类恶性肿瘤包括但不限于慢性淋巴细胞白血病(cll)、b细胞幼淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(mcl)、弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、脾边缘带区淋巴瘤(smzl)、伯基特氏淋巴瘤、b细胞非霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(pcnsl)、或结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤(nlphl)、毛细胞白血病、脾淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织的结外边缘带区淋巴瘤(malt淋巴瘤)、淋巴结边缘带区淋巴瘤、小儿淋巴结边缘带区淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤(primarycutaneousfolliclecentrelymphoma)、富于t细胞/组织细胞的大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿、原发性纵隔(胸腺)大b细胞淋巴瘤、血管内大b细胞淋巴瘤、alk阳性大b细胞淋巴瘤、浆母细胞淋巴瘤或原发性渗出性淋巴瘤。
将理解的是，由于本发明的缀合bcr抗原旨在靶向存在于患者中的恶性b细胞的bcr，因此用所述缀合物治疗将优选导致恶性b细胞的抑制或杀灭，特别是在细胞表面上表达bcr(优选功能性bcr)的克隆恶性b细胞。b细胞恶性肿瘤通常具有复杂的病因，并且一些b细胞恶性肿瘤(例如mgus)不仅特征在于存在表达bcr的恶性b细胞(即，演变成产生抗体的浆细胞的祖细胞)，而且特征还在于存在不表达bcr的恶性b细胞(例如，产生抗体的浆细胞)。不希望受到理论的束缚，据设想，在此类情况下，在细胞表面上表达bcr(尤其是功能性bcr)的恶性b细胞可以被本发明的bcr-抗原缀合物靶向，而不在细胞表面上表达bcr(尤其是功能性bcr)的b细胞则不能。因此，认为用本发明的bcr-抗原缀合物治疗会减少患者中在细胞表面上表达bcr(尤其是功能性bcr)的b细胞的数量，而可能需要额外的治疗来消除不表达这种bcr的b细胞。如果待治疗的b细胞恶性肿瘤例如特征在于存在作为演变成(恶性非功能性表面)bcr表达性b细胞的祖细胞的(功能性表面)bcr表达性恶性b细胞，则设想用本发明的bcr抗原缀合物治疗可尤其用于抑制或杀灭祖细胞，从而优选地消除恶性子b细胞的产生来源和/或预防患者复发。因此，本发明的缀合物原则上也可用于缓解中的mgus/mm的巩固；即当产生副蛋白的浆细胞的数量显著减少，并且本发明的缀合物不太可能被分泌的“诱饵”副蛋白结合和捕获而不到达产生副蛋白的恶性浆细胞时。
然而，本文特别设想治疗这样的b细胞恶性肿瘤：所述b细胞恶性肿瘤由表面上携带功能性bcr的克隆恶性b细胞的扩增引起并与所述扩增相关，而不是分泌抗体或抗体片段的血浆b细胞(在mm/mgus中就是这种情况)。这是因为，缀合bcr抗原优选地被设想为由克隆恶性b细胞表面上表达的bcr结合，而不是因与分泌的抗体或其片段(诸如副蛋白)结合而被“夺去”且耗尽。特别设想进行治疗的b细胞恶性肿瘤包括弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbl)、套细胞淋巴瘤(mtl)、原发性中枢神经系统淋巴瘤(pcnsl)、慢性淋巴细胞白血病(cll)、滤泡性淋巴瘤，只要该疾病不是由克隆恶性浆细胞或其产生抗体的前体造成的或与之相关的即可。也就是说，设想用bcr抗原缀合物治疗的上述疾病优选地不与免疫球蛋白病/过量产生(非功能性)免疫球蛋白相关。
如本文所述，待用本发明的缀合bcr抗原治疗的b细胞恶性肿瘤优选地特征在于在细胞表面上表达bcr(尤其是功能性bcr)的克隆恶性b细胞的存在。bcr的细胞表面表达可以容易地使用本领域的常规方法确定，例如，使用对表面免疫球蛋白恒定区特异性的标记抗体进行流式细胞术。如果bcr具有一种或多种以下特性，则其在本文中被称为“功能性的”：i)特异性识别抗原，并且在识别或结合抗原之后，ii)内化bcr-bcr抗原缀合物复合物。功能性bcr在与其特异性抗原性靶标结合后可进一步表现出一种或多种以下能力：iii)使igα/β中的免疫受体酪氨酸活化基序(itam)磷酸化，iv)使下游信号传导组分syk、布鲁顿酪氨酸激酶(btk)和/或磷脂酶cγ2(plcγ2)磷酸化，v)产生第二信使dag和/或ip3，vi)从细胞内储库释放ca2+。
bcr-bcr抗原缀合物复合物的内化可以使用荧光显微镜和本文别处所述的经标记的缀合物来显现。igα/βitam、syk、brk或plcγ2的磷酸化可容易地使用常规技术诸如免疫沉淀和使用市售抗体的免疫印迹来确定。用于检测细胞内ca2+或dag释放的试剂盒也可商购获得。
因此据设想，缀合bcr抗原可以在与恶性b细胞的bcr结合之后被恶性b细胞内化。bcr-bcr抗原缀合物复合物的内化(或内吞作用)可以使用本领域已知的且如所附实施例中所述的常规方法评估。尤其当bcr抗原-缀合物包含能够在其内化并且优选从细胞内的bcr抗原缀合物释放时发挥功能(即，抑制或杀灭恶性b细胞)的毒素时，内化被认为是重要的。
bcr抗原
如本文详细描述的，本发明基于这样的想法：使用“毒饵”即bcr抗原缀合物靶向患者中的恶性b细胞，所述“毒饵”将被所述恶性b细胞特异性识别，最终导致所述细胞的抑制或死亡。通常，任何抗原都可以用作本发明的bcr抗原缀合物的一部分，只要它能够结合恶性b细胞的bcr(即被其识别)即可。在需要本发明的bcr-抗原缀合物内化以发挥bcr抗原的有利能力(即，抑制或杀灭恶性b细胞)的情况下，抗原应优选允许所述缀合物内化。可以使用蛋白质阵列发现患者中由恶性b细胞的bcr所识别的抗原性靶标。例如，可以使用标准方案从样品(例如，来自患者的血液、骨髓、淋巴结或淋巴外组织)获得b细胞，并进行木瓜蛋白酶消化，从而产生bcr的fab片段。随后，可以使用(可商购获得的)蛋白质阵列例如unipex1和unipex2(sourcebiosciences)来筛选fab片段的抗原结合。可以用不同的蛋白质阵列重复筛选fab片段，直到找到抗原性靶标。由于通常存在于患有b细胞肿瘤的患者中的恶性b细胞的丰度，通过用(荧光)标记的二抗(抗fab)来检测结合的fab片段可容易地鉴定恶性b细胞的抗原性靶标。令人惊讶的是，尽管在b细胞恶性肿瘤中发现的恶性b细胞的bcr理论上可以识别大量的抗原，但是本发明人已经发现：对于多种b细胞肿瘤而言，存在主要的抗原，即在许多患有相同的b细胞恶性肿瘤的患者中共有的抗原性靶标。
表1示出了本发明人发现的示例性主要抗原：
表1：
(*)亚群是指具有准类似或相同的bcr的cll患者(“bcr机械重复(stereotypy)”)。
值得注意的是，如本领域技术人员将理解的，bcr-抗原缀合物不一定必须包含鉴定为抗原性靶标的完整分子(例如蛋白质)，而是可以仅包含鉴定的抗原性靶标的片段(例如肽)，只要所述片段能够结合恶性b细胞的bcr，即优选地包含一个或多个由所述bcr识别的表位即可。
特别将肽、多肽、蛋白质、脂质和多糖设想为抗原性靶标，即作为本发明缀合物的抗原性部分。术语“肽”是指由其相应的羧基和氨基之间的化学键合(即肽键)连接的2至10个氨基酸组成的化合物，而“多肽”由超过10个氨基酸组成，并且“蛋白质”由超过100个氨基酸组成。术语“肽”涵盖天然肽(例如降解产物或重组肽)和肽模拟物(合成法合成的肽)，包括类肽和半肽。类似地，术语“多肽”和“蛋白质”分别涵盖天然的、合成法合成的和重组的多肽或蛋白质。
也可以想到使用经修饰的bcr抗原，所述抗原经过改变以包括例如改善的或另外的功能，例如降低的免疫原性，增加或减小的流体动力学尺寸(溶液中的大小)、溶解性和/或稳定性和/或延长的血清半衰期。根据本发明使用的示例性功能部分包括与人体内的其他蛋白质(诸如血清白蛋白、免疫球蛋白fc区或新生儿fc受体(fcrn))结合的肽或蛋白质结构域，不同长度的多肽链(例如，xten技术或
术语“脂质”涵盖脂肪和脂肪样物质，包括甘油三酯、脂肪酸、中性脂肪、磷脂、糖脂、蜡和类固醇。术语“多糖”是指由三个或更多个单糖分子形成的碳水化合物聚合物。据设想，包含重复碳水化合物表位的多糖特别适合作为多糖抗原性靶标。
抗原可以是内源性抗原，特别是自身抗原或外源性抗原。作为正常细胞代谢的一部分，或当细胞被(细胞内)细菌或病毒感染时，从宿主细胞内产生“内源性抗原”。“自身抗原”(自体抗原)是宿主的内源性成分，其能够唤起所述宿主的免疫应答。据设想，所述自身抗原(尤其是当其为肽、多肽或蛋白质时)可以是翻译后修饰的或未修饰的。“翻译后修饰”是在蛋白质被核糖体翻译完成后发生在蛋白质上的修饰。“翻译后修饰”包括向蛋白质(共价)添加官能团，但也指蛋白质酶解加工和蛋白质在功能上成熟所必需的折叠过程。在本发明的上下文中可以想到的翻译后修饰包括但不限于：磷酸化、棕榈酰化、糖基化、泛素化、sumo化、甲基化、乙酰化和脱羧基或相应的逆向过程(去磷酸化、去乙酰化、去甲基化等)。
抗原还可以是外源性抗原，即从外部进入宿主体内的抗原，例如通过吸入、摄入或注射而进入。外源性抗原包括在宿主体内被认为是外来的粒子。该术语还包括“异源性抗原”或“异源抗原”，即来源于宿主的外来性物种的抗原。示例性的外源性抗原包括过敏原(诸如花粉)、或微生物的某些部分(诸如细菌、病毒等的衣壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、纤毛或毒素)。
进一步设想抗原可以是同种异体抗原，即来自相同物种的成员(例如人)的外来抗原。
进一步设想，本发明的bcr抗原缀合物的抗原包含由克隆恶性b细胞的bcr识别的至少一个表位。术语“表位”包括能够与免疫球蛋白例如bcr特异性结合的任何决定簇，特别是抗原的区域。表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。值得注意的是，据设想，bcr-抗原缀合物可以仅含抗原的片段(即，抗原性片段)，其优选地包含由恶性b细胞的bcr识别的一个或多个表位。
免疫结合通常是指免疫球蛋白分子(如在bcr中)与免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间因(例如以说明而非限制的方式)静电、离子、亲水和/或疏水吸引或排斥、空间位阻力、氢键、范德华力和其他相互作用而发生的类型的非共价相互作用。一般而言，如果某分子诸如免疫球蛋白分子与特定物质的反应或缔合比与替代物质的反应或缔合更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更大，则称所述分子表现出“特异性结合”。因此，当bcr在分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，即与其抗原的反应具有比与其他物质的反应更大的亲和力、亲合力、容易性和/或更长的持续时间，则在本文中将所述bcr称为“特异性”结合bcr-抗原缀合物(或更具体地讲，缀合物的抗原部分)。确定这种特异性结合的方法在本领域中也是熟知的。
免疫结合相互作用的强度或亲和力可以用相互作用的解离常数(kd)表示，其中kd越小表示亲和力越大。所选多肽的免疫结合性质可以使用本领域熟知的方法定量。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物伴侣的浓度、相互作用的亲和力以及同等地影响两个方向上的速率的几何参数。因此，可以通过计算浓度和实际的缔合及解离速率来确定“结合速率常数”(kon)和“解离速率常数”(koff)。koff/kon的比率能够取消与亲和力无关的所有参数，并因此等于解离常数kd。当平衡解离常数≤10-7或更小，优选10-8m或更小，或更优选≤10-9m或更小时，bcr可尤其与bcr抗原缀合物(或更具体地讲，缀合物的抗原性部分)特异性结合。
设想本发明的缀合bcr抗原具有各种有利的能力。设想其抑制患者中的恶性b细胞的活化和/或增殖(本文也简称为“抑制”)。这可以例如通过与细胞抑制剂紧密接近或通过募集抑制活化和/或增殖的其他细胞来实现。另外地或替代地，设想本发明的缀合物杀灭患者中的恶性b细胞。杀灭可以通过几种机制中的一种来完成，诸如通过诱导细胞凋亡、与毒素紧密接近或者吸引可杀灭靶向b细胞的其他细胞诸如细胞毒性t淋巴细胞或巨噬细胞。杀灭恶性b细胞可以使用本领域已知的常规方法来确定，例如，如所附实施例中所述。
优选地，通过抑制和/或杀灭恶性b细胞，也预期本发明的缀合bcr抗原最终减少患者中恶性b细胞的数量。
缀合剂
如本文所述，本发明设想与治疗剂或诊断剂缀合bcr抗原。根据本发明特别可用于治疗b细胞恶性肿瘤的示例性治疗剂包括放射性核素、结合剂、cart细胞和毒素。
放射性核素
放射性核素是具有放射性的核素，也被称为放射性同位素或放射同位素。合适的放射性核素可以例如选自发射α的同位素，诸如225ac、211at、212bi、213bi、212pb、224ra或223ra。或者，细胞毒性放射性核素可以是发射β的同位素，诸如186rh、188rh、177lu、90y、131i、67cu、64cu、153sm或166ho。其他可想到用作毒素的细胞毒性放射性核素发射俄歇电子和低能量电子，并可选自125i、123i或77br。
用于本发明的放射性核素优选是发射α的同位素，诸如225ac、211at、212bi、213bi、212pb、224ra或223ra。或者，放射性核素可以是发射β的同位素，诸如186rh、188rh、177lu、90y、131i、67cu、64cu、153sm或166ho。此外，放射性核素可以发射俄歇电子和低能量电子，并且可以是同位素125i、123i或77br之一。
结合剂
还设想将“结合剂”偶合到本发明的bcr抗原上。结合剂可以例如用来将免疫效应细胞募集到恶性b细胞。免疫效应细胞优选是非b细胞，例如自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞或(细胞毒素)t细胞。例如，尽管bcr抗原缀合物的抗原性部分靶向恶性b细胞，但是缀合的cd16结合剂被认为能够将自然杀伤(nk)细胞募集到恶性b细胞，这将最终杀灭b细胞。能够募集nk细胞或募集能够杀灭或抑制恶性b细胞的其他免疫效应细胞的其他结合剂也在本文中设想，例如cd3结合剂和cd38结合剂。优选的结合剂是经分离的多肽，特别是经分离的抗体或其抗原结合片段。技术人员将容易理解，作为本发明的bcr抗原缀合物的一部分而选择的结合剂优选不(例如在空间位阻上)干扰恶性b细胞的bcr与缀合物的抗原性部分的结合，以便保留bcr抗原缀合物作为恶性细胞与所募集的免疫效应细胞之间的“衔接子”的能力，由此产生优选地具有如本文所述的相同的有利性质(即，与恶性b细胞的bcr结合并杀灭或抑制所述细胞)的bcr-抗原缀合物。
术语“抗体”是指结合抗原性靶标的单克隆或多克隆抗体或所述抗体的保留或基本上保留其结合特异性的衍生物。此类抗体的示例性衍生物是嵌合抗体，其包含例如小鼠或大鼠可变区和人恒定区；以及人源化抗体，即非人类来源的抗体，其中可变区中的至少一个互补性决定区(cdr)诸如cdr3优选全部6个cdr已经被具有所需特异性的人源抗体的cdr置换，并且任选地，抗体的非人恒定区已经被人抗体的一个或多个恒定区置换。
术语“抗体”也涵盖功能性抗体片段，即保留或基本保留抗体的结合特异性的抗体片段，如分开的轻链和重链、fab、fab/c、fv、fab'、f(ab’)2。术语“抗体”还包括双功能(双特异性)抗体和抗体构建体，如单链fv(scfv)、串联scfv、双-scfv、或抗体-融合蛋白、重链抗体及其可变结构域、结构域抗体(“dab”)(其基于或衍生自传统4链抗体分子、双链抗体、单链抗体分子的重链可变结构域(vh)或轻链可变结构域(vl))和由抗体片段形成的多特异性抗体。
包含抗原和结合剂的双特异性b细胞抗原缀合物在本文中也称为“bi-bar”。
毒素
与本发明缀合物中的抗原偶合的治疗剂可以是毒素。本文使用的术语“毒素”包括但不限于化学毒素、化学治疗剂和蛋白质毒素。任何其他化合物也是可以想到的，只要其可以与如本文所述的bcr抗原缀合，从而产生优选地具有如本文所述的相同的有利能力(即，与恶性b细胞的bcr结合并杀灭或抑制所述细胞)的bcr缀合物即可。
可想到用于本发明的“化学治疗剂”包括可用于治疗b细胞恶性肿瘤(包括小尺寸有机分子、肽、寡核苷酸等)的任何抗肿瘤剂和/或细胞抑制剂。包括在化学治疗剂定义中的药剂是但不限于烷化剂，例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、白消安、n-亚硝基-n-甲基尿素(mnu)、卡莫司汀(bcnu)、洛莫司汀(ccnu)、司莫司汀(mccnu)、福莫司汀、链脲霉素、达卡巴嗪、米托唑胺、替莫唑胺、噻替派、丝裂霉素、地吖醌(azq)、顺铂、卡铂、奥沙利铂、丙卡巴肼和六甲基三聚氰胺；抗代谢物，例如甲氨喋呤、培美曲塞、氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、阿扎胞苷(vidaza)、氟达拉滨、奈拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、喷司他丁、硫鸟嘌呤、巯嘌呤；抗微管剂，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁、紫杉醇、多西他赛、鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂，例如伊立替康、拓扑替康、依托泊苷、多柔比星、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、硫巴妥苯胺(merbarone)、阿柔比星；细胞毒性抗生素，例如放线菌素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星、米托蒽醌；有毒凝集素；植物毒素，例如蓖麻毒素、相思豆毒素、门冬霉素；肉毒杆菌毒素、白喉毒素；烯啶、倍癌霉素、加利车霉素、埃斯培拉霉素、多柔比星、ara-c、顺铂、5-氟尿嘧啶、多拉司他汀、奥瑞斯他汀、vedotin、emtansin；酪氨酸激酶抑制剂或本领域已知用于治疗如本文所定义的b细胞恶性肿瘤的任何其他小分子药物。也设想衍生物及其组合也可用于本发明的bcr缀合物。根据本发明的特别优选的毒素包括但不限于烯啶、倍癌霉素、氨甲蝶呤(methotrexate)、多柔比星、美法仑、苯丁酸氮芥、ara-c、长春地辛、丝裂霉素c、顺铂、依托泊苷、博来霉素、vedotin、emtansin、5-氟尿嘧啶和酪氨酸激酶抑制剂(例如伊马替尼)。cart细胞
cart细胞是携带人工嵌合t细胞受体(或嵌合抗原受体(car))的t细胞。典型地，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到t细胞上。这些分子最常见的形式是来源于单克隆抗体的单链可变片段(scfv)与cd3-ξ跨膜和内源性结构域融合而成的融合体。在识别其抗原性靶标的scfv后，此类car导致信号传输，从而诱导car-t细胞的活化、增殖、细胞因子产生和/或效应子功能。
据设想，在本发明的bcr缀合物中用作治疗剂的cart细胞通过与bcr结合的缀合物的抗原性部分而靶向恶性b细胞，其中cart细胞将最终被活化并且抑制或杀灭恶性b细胞。
包含car-t细胞作为治疗剂的bcr抗原缀合物在本文中也称为“bar-car”。
化学修饰
缀合bcr抗原可以被化学修饰。通常，可以想到所有种类的修饰，只要不消除本发明的缀合bcr抗原的有利性质即可，即，经化学修饰的bcr抗原缀合物应该优选地具有与所附实施例中所评估的化合物的能力相当的能力。具体地讲，经修饰的bcr抗原缀合物应优选保持其结合到恶性b细胞的bcr、抑制或杀灭所述b细胞的能力。可能还期望被内化的能力。
诊断剂
(可检测的)标记可以附接到bcr抗原以用于诊断目的。根据本发明可设想使用的此类标记包括但不限于荧光分子或磁性实体，诸如磁性粒子。由此，可以通过检测由可检测标记产生的信号来检测样品中靶标的存在和/或浓度。
可以直接或间接检测可检测标记，并且可以组合使用与不同的特异性抗体缀合的几种不同的可检测标记来检测一个或多个靶标。
可直接检测的可检测标记的实例包括荧光标记、酶标记、放射性同位素、化学发光标记、电化学发光标记、生物发光标记、聚合物、聚合物粒子、金属粒子、半抗原和染料。荧光标记的实例包括5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-甲酰氨基己酸、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明，和染料，诸如cy2、cy3和cy5，任选经取代的香豆素，包括amca、percp、藻胆蛋白(包括r-藻红蛋白(rpe)和别藻红蛋白(apc))、德克萨斯红、普林斯顿红、绿色荧光蛋白(gfp)及其类似物，以及r-藻红蛋白或别藻红蛋白的缀合物，无机荧光标记，诸如基于半导体材料(如被包覆的cdse纳米晶)的粒子。聚合物粒子标记的实例包括可嵌入有荧光染料的聚苯乙烯、pmma或二氧化硅的微粒或胶乳粒子，或包含染料、酶或底物的聚合物胶束或囊。金属粒子标记的实例包括可以通过银染料转化的金粒子和包覆的金粒子。半抗原的实例包括dnp、异硫氰酸荧光素(fitc)、生物素和地高辛(digoxigenin)。酶标记的实例包括辣根过氧化物酶(hrp)、碱性磷酸酶(alp或ap)、β-半乳糖苷酶(gal)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-n-乙酰葡糖胺酰胺酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶和葡萄糖氧化酶(go)。常用的辣根过氧化物酶底物的实例包括3,3'-二氨基联苯胺(dab)、镍增强的二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(aec)、二盐酸联苯胺(bdhc)、hanker-yates试剂(hyr)、靛酚蓝(indophaneblue,ib)、四甲基联苯胺(tmb)、4-氯-1-萘酚(cn)、α-萘酚焦宁(α-np)、邻联茴香胺(od)、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐(bcip)、硝基蓝四氮唑(nbt)、2-(对碘苯基)-3-对硝基苯基-5-苯基四唑氯(int)、四硝基四氮唑蓝(tnbt)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-d-半乳糖苷/铁氰化铁(bcig/ff)。碱性磷酸酶的常用底物的实例包括萘酚-as-b1-磷酸盐/坚牢红tr(nabp/fr)、萘酚-as-mx-磷酸盐/坚牢红tr(namp/fr)、萘酚-as-b1-磷酸盐/坚牢红tr(nabp/fr)、萘酚-as-mx-磷酸盐/坚牢红tr(namp/fr)、萘酚as-b1-磷酸盐/新品红(nabp/nf)、溴氯吲哚基磷酸盐/硝基蓝四氮唑(bcip/nbt)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-吡喃半乳糖苷(bcig)。发光标记的实例包括鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1,2-二氧杂环丁烷和吡啶并哒嗪。电化学发光标记的实例包括钌衍生物。放射性标记的实例包括碘、钴、硒、氚、碳、硫和磷的放射性同位素。
与治疗剂和诊断剂缀合bcr抗原也在本文中设想，并且可以例如用于监测患者中缀合物的分布和内化，同时靶向恶性b细胞。
接头
治疗剂或诊断剂通常经由接头与bcr抗原附接。可以想到的接头例如一般包括柔性的、可切割的和刚性的接头，并且将根据缀合物的类型和预期的用途/应用来选择。例如对于治疗性应用，通常优选非免疫原性的柔性接头，以便确保结构域之间一定程度的柔性或相互作用，同时降低不利的免疫原性反应的风险。此类接头通常由小的非极性(例如gly)或极性(例如ser或thr)氨基酸组成，并且包括由gly和ser残基的段组成的“gs”接头。也是本发明的缀合物所设想的最广泛使用的柔性接头的实例具有(gly-gly-gly-gly-ser)n的序列。治疗
所有语法形式的术语“治疗”包括治疗性或预防性治疗b细胞恶性肿瘤。“治疗性或预防性治疗”包括目的在于完全预防临床和/或病理表现的预防性治疗或目的在于改善或缓解临床和/或病理表现的治疗性治疗。术语“治疗”因此也包括改善或预防b细胞恶性肿瘤。
优选地，治疗涉及施用治疗有效量的bcr抗原缀合物。所谓“治疗有效量”是指引起如本文所述的治疗效果的bcr抗原缀合物的量。bcr抗原缀合物的确切剂量将取决于治疗目的(例如缓解、维持相比于疾病的急性发作或转移扩散)，并且可由本领域技术人员使用已知技术来确定。针对施用途径、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症严重程度进行调整可能是必要的，并且可以由本领域技术人员使用常规实验来确定。
在本发明的上下文中，术语“治疗效果”通常是指治疗的理想或有益的影响，例如，疾病表现的改善或缓解。术语“疾病的表现”在本文中用于描述其可察觉的表现，并且包括临床表现(其在下文中被定义为可以在体检期间检测到的和/或可由患者察觉到的疾病的征兆(即，症状))和病理表现(意思是疾病在细胞和分子水平上的表现)。例如，可以评估相应患者的一般性表现(例如健康、幸福感)，这也将有助于技术人员评估是否已经引发了治疗效果。技术人员知道适于观察本发明的bcr抗原缀合物的治疗效果的许多其他方式。
术语“患者”(在本文中也称为“受试者”)意欲包括可用作人类疾病(即，b细胞恶性肿瘤)的模型系统的任何哺乳动物或任何脊椎动物。受试者的实例包括人、猴、猿、狗、猫、小鼠、大鼠、马、猪、牛、绵羊、山羊、兔、豚鼠、仓鼠及其转基因物种。在本发明的上下文中优选的是人类患者。
多种途径适用于施用本发明的缀合物，包括但不限于口服、局部、透皮、皮下、静脉内、腹膜内、肌内或眼内。然而，如果需要的话，本领域的技术人员可以容易地选择任何其他途径。
联合疗法
本发明的bcr-抗原缀合物也被设想用于与用来治疗b细胞恶性肿瘤的常用治疗方法一起的联合治疗。可想到用于联合疗法的治疗方法包括例如chop(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松)、任选地补充利妥昔单抗(r-chop)、br(苯达莫司汀和利妥昔单抗)、r-cvp(利妥昔单抗、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松)和基于氟达拉滨的组合。还设想了放射疗法(通常是外照射放疗)作为与单克隆抗体如利妥昔单抗、奥法木单抗、obinotuzimab或抗体-药物缀合物brentuximabvedotin一起进行的治疗。干细胞移植也可能是需要的。为了减少或控制b细胞恶性肿瘤治疗和症状(包括由b细胞恶性肿瘤或其治疗引起的疼痛、恶心、呼吸困难、失眠和其他身体症状)的副作用，还设想了另外施用缓和剂(palliativeagent)。
技术人员将认识到，治疗选择根据待治疗的特定b细胞恶性肿瘤而变化。一般而言，用本发明的bcr抗原缀合物进行治疗可以在常用治疗方法之前和/或之后进行，或者可以同时进行。虽然本文设想将本发明的缀合物与常用治疗选择进行组合，但其也可用于替代常用于治疗b细胞恶性肿瘤的化学治疗方案的组成部分。例如，由于其具有优异的特异性并因此预期具有减少的副作用，因此也可以设想将本发明的缀合物用于替代利妥昔单抗或长春新碱治疗(例如在r-chop中)。
诊断方法
也考虑在诊断方法中使用bcr抗原缀合物。所述诊断方法基于鉴定和表征识别受试者中的bcr抗原缀合物的表达bcr的恶性b细胞，并且可以在体内、离体或体外进行。体内方法可以包括向受试者施用经标记的bcr抗原缀合物。对于离体或体外方法，可以使怀疑含有与本发明的缀合bcr抗原结合的恶性b细胞的体液、组织或细胞样品(特别是血液样品)与能够结合所述细胞的bcr的经标记的bcr抗原缀合物接触。经标记的缀合物的结合指示存在表达bcr的细胞，所述细胞具有特异性识别样品中缀合物的抗原性部分的bcr，并且所述结合可以通过本领域技术人员熟知的方法检测。本发明的一些方面涉及通过确定识别缀合bcr抗原的恶性b细胞的存在或量或水平来诊断或监测受试者中的b细胞恶性肿瘤。此类b细胞的存在或水平可以使用本领域技术人员已知的常规方法来确定。具体地讲，(经标记的)bcr抗原缀合物可有助于支持对基于常规诊断方法而预先诊断的某种b细胞恶性肿瘤的怀疑。
分层
本文还设想用于鉴定患有如本文所述的b细胞恶性肿瘤的患者的非侵入性方法，所述患者有倾向对本发明的缀合bcr抗原有利地起反应。所述方法包括：(i)提供经标记的bcr抗原缀合物，(ii)将经标记的bcr抗原缀合物加到每个患者的包含恶性b细胞的样品中；(iii)如本文所述评估经经标记的bcr抗原缀合物与所述恶性b细胞的结合和/或内化。
术语“鉴定有倾向对本发明的缀合bcr抗原有利地起反应的患者”包括分层患者。术语“分层”是指将患者分为可能或不可能从所述缀合物的治疗中受益的患者。具体地讲，分层患者涉及确定患者恶性b细胞结合和/或内化本发明缀合物的能力。恶性b细胞结合到和/或内化经标记的bcr抗原缀合物的患者在本文中被定义为有倾向对用缀合bcr抗原进行的治疗有利地反应，而恶性b细胞不结合和/或内化经标记的bcr抗原缀合物的患者则不。
“有倾向有利地起反应”是指当用本发明的缀合bcr抗原治疗时，患者可能会经历有益的效果。有益的效果包括恶性b细胞的抑制和/或杀灭、恶性b细胞数量的减少和/或可使用本领域已知的常规方法确定的治疗效果。优选地，所述患者先前已被诊断为患有b细胞恶性肿瘤。
组合物
设想以药物组合物的形式施用bcr抗原缀合物。优选地，所述bcr抗原缀合物以治疗有效量存在于药物组合物中。术语“药物组合物”特别是指适于施用给人的组合物，即优选含有药学上可接受的组分的无菌组合物。优选地，药物组合物包含与一种或多种药物赋形剂一起的bcr抗原缀合物。术语“赋形剂”包括填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、防粘剂、助流剂、防腐剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、助溶剂、缓冲剂、螯合剂、粘度赋予剂、表面活性剂、稀释剂、保湿剂、载体、稀释剂、防腐剂、乳化剂、稳定剂或张力调节剂。本发明的药物组合物优选包含治疗有效量的bcr抗原缀合物，并且可以配制成各种形式，例如以固体、液体、气体或冻干形式，并且尤其可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体剂、酏剂、提取物、酊剂或流体提取物或以特别适于所需施用方法的任何其他形式。
本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种另外的药剂。优选地，所述药剂对于治疗b细胞恶性肿瘤是治疗有效的。可用在本发明的药物组合物中的特定的另外药剂包括但不限于本文其他地方所述的毒素，包括化学治疗剂或缓和剂。
应当注意的是，在bcr抗原缀合物或包含所述缀合物的试剂盒的上下文中描述的所有方面以及治疗方法加上必要的变更也适用于本发明的药物组合物。
鉴于上述情况，本发明还提供了如本文所定义的b细胞抗原缀合物在制备用于治疗b细胞恶性肿瘤的药物组合物中的用途。
试剂盒
还设想bcr抗原缀合物可以用作试剂盒的一部分。因此，在另一方面，本发明还涉及一种包含bcr抗原缀合物的试剂盒，其尤其旨在用于如本文其他地方所定义的治疗b细胞恶性肿瘤的方法。
该试剂盒可以是两个或更多个部分的试剂盒，并且包含bcr抗原缀合物或含有所述bcr抗原缀合物的药物组合物，以及一种或多种如在药物组合物的上下文中所定义的另外的药剂。试剂盒的组分可以装在容器或小瓶中。应当注意的是，在bcr抗原缀合物或包含所述缀合物的药物组合物的上下文中描述的所有方面以及治疗方法加上必要的变更也适用于本发明的试剂盒。
据设想，包含在试剂盒中的另外药剂可以相对于bcr抗原缀合物的施用同时、或依次、或单独应用。本发明还包括经由不同的施用途径施用药剂。
本发明的另一个方面是治疗有需要的受试者中的b细胞恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所定义的b细胞抗原缀合物。本领域的技术人员将认识到，在本文中在bcr抗原缀合物、药物组合物和包含它们的试剂盒的上下文中描述的所有方面加上必要的变更也适用于治疗方法。
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必须注意的是，如本文所用，除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一个/种”和“该/所述”也包括复数指代。因此，例如，对“一种试剂”的提及也包括一种或多种这样的不同试剂，并且对“该方法”的提及也包括对本领域普通技术人员已知的可加以修改或代替本文描述的方法的等同步骤和方法的提及。
除非另外指明，否则在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。本领域技术人员将会认识到，或仅仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同形式。此类等同形式旨在由本发明涵盖。
本文使用的术语“和/或”包括“和”、“或”和“由所述术语连接的要素的全部或任何其他组合”的含义。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指给定值或范围的20％以内，优选10％以内，更优选5％以内。然而，它也包括具体的数字，例如约20包括20。
术语“小于”或“大于”包括具体的数字。例如，小于20表示小于或等于。类似地，多于或大于意味着分别多于或等于，或大于或等于。
在此整个说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”以及诸如“包括”和“含有”的变化形式将被理解为暗示包含所述整数或步骤，或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤，或整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包含”可以用术语“含有”或“包括”代替，或者有时在本文中使用时用术语“具有”代替。
当在本文中使用时，“由...组成”排除了在权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文中使用时，“基本上由...组成”不排除不实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。
应该理解的是，本发明不限于本文描述的特定方法、方案、材料、试剂和物质等，并且因此可以变化。本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而无意限制仅由权利要求限定的本发明的范围。
本说明书全文中引用的所有出版物和专利(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商规范、说明书等)，无论是上文还是下文，均通过引用整体并入本文。本文中没有任何内容被解释为承认本发明由于在先发明而无权先于这样的公开。如果通过引用而并入的材料与本说明书相矛盾或不一致，说明书将取代任何此类材料。
从以下实施例中将更好地理解本发明及其优点，这些实施例仅为了说明性目的而提供。这些实施例无意以任何方式限制本发明的范围。
实施例
实施例1：
本发明人已经开发了将bar在临床上用于多种b细胞恶性肿瘤的方法，如下所述：
慢性淋巴细胞白血病(cll)：
据估计，cll的发病率为每100000人每年新发4例。在美国，每年约有14620例新发cll和4650例cll死亡(americancancersociety2014:cancerfactsandfigures2014；检索自http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf)，在欧洲每年有10000例死亡7。
bar的临床适应症：cll是一种缓慢发展的疾病，当出现症状时进行治疗。采用现今的一线治疗，通常是有反应的，从而为大多数患者提供延长的无治疗期。对于需要再次治疗的患者，有许多不同的方案可供选择，并且许多患者在死于该病前接受了多达十几种治疗。然而，与多发性骨髓瘤一样，cll被认为若不进行同种异体移植便是不可治愈的，而同种异体移植在该大部分都是老年人的群体中几乎不可能。对一系列不同可用方案的选择以效力和耐受性为基础，而高效低毒(被认为是bar的特征)的新药仍有空间。虽然迄今为止，bar可用于大约30％的所有cll病例，但用于cll的bar的问题在于：抗原性bcr靶标是相当多样化的，其中大多数在具有已知bar的情况下在给定的bar内具有不同的表位。尽管预期生产bar的成本较低，但是如果对于任何可用的cllbar都需要单独的许可程序，那么bar的广泛临床应用将是值得怀疑的。应该追求cll-bar的全面许可。
候选患者的鉴定：
使用已知的抗原作为外壳，通过完善的全血裂解物elisa测试外周血(cll细胞)的bcr特异性。
实施策略：
证明cll-bar在(多次)复发性cll患者中的单药活性(理论上西方世界每年有15000例cll死亡，其中30％是这种i/ii期研究的潜在候选者)。
如果有效，则在下一步中将对一线治疗有反应的cll患者随机分成维持bar组或观察组。
作为第三步(或者在第一步之后)：将一线治疗的患者随机分成有和没有bar(诱导加维持)。
套细胞淋巴瘤(mcl)
mcl占所有非霍奇金淋巴瘤病例的约3％。美国总发病率为0.55/100000/年，且随着年龄增加：<50岁患者为0.07，70至79岁患者为2.97，≥80岁患者为2.78％。男性中mcl的发病率(0.84/100000)要高于女性(0.34/100000,p<.05)，高加索人(0.61/100000)要高于非洲裔美国人(0.32/10000)。在74.6％的患者中确诊出晚期(iii-iv)mcl8。美国估计每年约有4200例新mcl，欧洲估计约有6000例。目前，mcl采用联合化疗或化疗加免疫疗法，然后进行干细胞移植来治疗。然而，诸如硼替佐米、依罗替尼和来那度胺的药剂最近已经证明了通过靶向b细胞受体信号传导而提高无进展生存(pfs)和总生存(os)的能力，显示出从之前的3年生存期到7年中位数的显著改善。mcl患者对初始联合化疗方案的反应率通常非常好；然而，复发是非常普遍的，目前还不清楚是否可以通过可用的治疗选择来治愈患者，或许只有同种异体移植例外，但是同种异体移植只在中位诊断年龄为70岁的这些大多为老年人的患者中的少数中可行9。因此，亟需新的方法。
bar的临床适应症：尽管近年来新药实现的治疗结果有了相当大的提高，但是mcl的治愈率仍然较低，一线治疗很少能治愈患者。因此，mcl仍然是未得到满足的医疗需求。已在4/9(44％)的mcl病例中鉴定出bar(lrpap1)。作为bar治疗的潜在候选者的高百分比的mcl患者应当加速mcl-bar的临床开发。
候选患者的鉴定：
检查mcl-bcr与lrpap-1的结合。使用外周血的测试仍在开发中。
实施策略：
在i/ii期临床试验中证明mcl-bar在复发性mcl患者中的单药活性。由于mcl-bar的预期高活性和低毒性，这可以在老年人的首次复发和年轻mcl患者的第二次复发中完成。在据估计的西方世界每年10000个新的mcl病例中，预计有4400个具有lrpap1特异性bcr。在这些之中，每年预计有四分之一会复发；因此估计每年有1000名患者将是这种i/ii期临床试验的潜在候选者。
如果有效，则在下一步中将对一线治疗有反应的cll患者随机分成维持bar组或观察组。
作为第三步(或者在第一步之后)：将一线治疗的患者随机分成有和没有bar(诱导加维持)。
原发性中枢神经系统淋巴瘤(pcnsl)
pcnsl占所有原发性脑肿瘤的3.1％和nhl的2-3％。在二十年前观察到三倍的增长之后，在过去十年中，60岁以上的个体中pcnsl的发病率仅略有增加，现在每100000患者年达到0.46。估计美国每年新增1000例患者。诊断时的中位年龄为60-65岁，中位生存期为10-20个月，5年生存率<20％-30％10。年龄大于60岁的患者病情严重恶化，5年生存率为19％，而年轻患者为75％。高剂量化疗联合自体干细胞移植可能会改善结果，但并非在所有患者中都是可行的11,12。复发的预后不佳，尤其是当淋巴瘤对高剂量化疗产生耐药性时。
bar的临床适应症：所有pcnsl病例中的三分之二具有对neurabin-1(一种优先在cns中表达的蛋白质)的samd14结构域有特异性的bcr。有趣的是，在这些患者中，与健康对照相比，neurabin-1/samd14是高度糖基化的。这种高度糖基化的原因尚不清楚，但支持以下假说：这种经修饰的蛋白质诱导对neurabin-1具有特异性的b细胞的慢性抗原应答，最终导致恶性克隆的克隆进化。因为pcnsl特别是复发性pcnsl的预后不良，所以对于更有效的治疗存在尚未满足的需要。因此，尽管pcnsl罕见，但是pcnsl-bar的临床开放应当迅速进行，这也是因为所有pcnsl患者中有2/3是pcnsl-bar治疗的潜在候选者。在据估计的西方世界每年2000例新的pcnsl病例中，至少有四分之一每年应当可用于i/ii期研究。pcnsl-bar的先决条件是它们穿透血脑屏障。对于像bar那样的仅代表bcr结合性表位的小分子，可以预期其将穿透血脑屏障，并且bcr结合性表位的小尺寸应当为目的在于打破血脑屏障的若干药理学修饰留有空间。
候选患者的鉴定：
通过已建立的elisa测试外周血的高度糖基化neurabin。
实施策略：
在i/ii期临床试验中证明pcnsl-bar在复发性pcnsl患者中的单药活性。由于复发患者的预后不佳，采用50名患者的i/ii期研究应当足以显示哪些人应当能够在1年内招募的强烈信号。
如果有效，则在下一步中，应在随机化ii期研究中将pcnsl-bar与标准的挽救治疗方案结合。
作为第三步(或者与步骤#2并行)，应该进行使用和不使用pcnsl-bar的标准治疗的随机化iii期研究。目标应该是将无进展生存期提高6个月。
弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)
弥漫性大b细胞非霍奇金淋巴瘤(dlbcl)是最常见的非霍奇金淋巴瘤，并占非霍奇金淋巴瘤系列的30％-58％(取决于地理区域)。欧盟的粗发病率为3-4/100000/年。该发病率随着年龄从0.3/100000/年(35-39岁)增至26.6/100000/年(80-84岁)。nhl的发病率从20世纪70年代到20世纪90年代中期急剧增加，在2010年美国估计有65540例新发病例，从而使nhl成为第七大常见癌症(不包括基底细胞癌和鳞状细胞皮肤癌)13。在此期间，在两性、不同种族、除了年轻人的所有年龄段中均存在淋巴瘤和dlbcl新发病例每年3％至4％的稳定增加。发病率在20世纪90年代末达到稳定，从1992年到2006年，经年龄校正的dlbcl发病率每年增长约1％，从每100000人口8.07例增至8.98例。从20世纪70年代起dlbcl发病率的增加代表了仅与皮肤癌的上升相当的前所未有的上升。
自从引入单克隆抗体利妥昔单抗后，dlbcl患者预后明显改善，预计75％的患者可通过由利妥昔单抗和chop(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松)组成的联合免疫化疗治愈。治愈率取决于根据国际预后指数(ipi)的风险因子的数量：年龄>60岁、治疗前ldh血清水平升高、晚期(根据annarbor分期系统的iii/iv期)和>1个淋巴结外受累部位。除了ipi之外，其他独立的风险因子已被确定，其中最广为接受的一个是起源细胞(coo)。根据coo，衍生自生发中心(gc型)的dlbcl有别于衍生自激活的b细胞(abc型)的dlbcl，留下一小部分无法分配coo的病例。abc型估计占所有dlbcl的约40％，并且其频率随着年龄而增长，大多数着眼于>60岁的患者的研究至少观察到与gc-dlbcl一样多的abc-dlbcl。虽然据报道通过基因表达谱所确定的gc-dlbcl的治愈率或5年生存率为75％，但abc-dlbcl仅为40％14。已经报道了不良结局的其他亚型是具有myc中断的dlbcl、具有bcl2中断的dlbcl、双命中dlbcl(double-hitdlbcl)以及表达myc和bcl2两种蛋白的dlbcl。
bar的临床适应症：5个abc型dlbcl细胞系中有3个表达了对ars2蛋白具有特异性的bcr受体，但4个gc类型的dlbcl细胞系均未表达。有趣的是，在这些患者中，ars2(如在dlbcl细胞系中)低磷酸化。这种低磷酸化的原因尚不清楚，但支持以下假说：该经修饰的蛋白诱导对ars2具有特异性的b细胞的慢性(自身)抗原刺激，最终导致恶性克隆的克隆进化。得自dlbcl的离体或活组织检查数据仍然有限，但似乎abc亚型的dlbcl不像对应细胞系那样频繁地表达对ars2具有特异性的bcr。然而，由于几乎所有在美国和欧洲的每年>100000个的新增dlbcl病例都会得到治疗，并且其中三分之一将不会起反应或在实现反应后复发，因此可以计算出其中33000例需要挽救治疗。与一线治疗的结果形成鲜明对比，自从引入利妥昔单抗以来，复发性dlbcl的治疗结果变得相当严重。尽管有包括高剂量化疗和自体干细胞移植的挽救治疗，但是只有20％的年轻患者实现了持久的二次缓解，并且持久缓解率在不太适合高剂量化疗的复发(老年)患者中甚至更低。对来自abc-dlbcl的新鲜活组织检查进行的最近研究显示：31个中有8个表达了低磷酸化ars2。由于复发性dlbcl富含dlbcl的abc亚型，所有复发性dlbcl中有10％至20％可被假定为表达低磷酸化ars2，因此预计每年有>3000名患者可以选择dlbcl-bar。
候选患者的鉴定：
通过已建立的elisa测试外周血的低磷酸化ars2。
实施策略：
在i/ii期试验中证明dlbcl-bar在复发性dlbcl中的单药活性。由于这些患者的高流行率，在1年内将50名患者招募到i/ii期试验中应当是可行的。
如果有效，则在下一步中，应在随机化ii期研究中将dlbcl-bar与标准挽救治疗方案结合。目标应当是pfs延长6个月。
作为第三步(或者与步骤#2并行)，应该进行使用和不使用dlbcl-bar的标准治疗的随机化iii期研究。目标应该是无进展生存率提高7.5％至10％。
滤泡性淋巴瘤(fl)
滤泡性淋巴瘤(fl)是美国第二大淋巴瘤，每年诊断出近14000例13，年发病率为3例/100000例。欧洲的估计发病率为每100000人每年2.18例15，因此在美国和欧洲预计会出现类似数量的新病例。发病率随时间稳定，但因种族而异，白人发病率是黑人和亚洲人群的两倍以上16-18。
尽管到晚期，但中位生存时间从8年到15年不等，从而被称为“惰性的”。观察等待(即推迟治疗直至患者出现症状)是晚期滤泡性淋巴瘤患者的一个选择。患有晚期滤泡性淋巴瘤的患者用目前的治疗选择不能治愈。虽然>90％的患者对一线方案(chop、苯达莫司汀)有反应，但随着时间的推移，复发率相当一致，即使对治疗实现了完全反应的患者也是如此19，且5年无进展生存率为约50％20。
bar的临床适应症：虽然没有进行系统性和因果性调查，但迄今唯一鉴定的bar是optineurin，它被认为是4/40滤泡性淋巴瘤患者的bcr的靶标。虽然有50％的患者需要在5年内复治，但有许多治疗选择，并且患者通常对多种挽救治疗有反应。只有10％的fl患者是fl-bar治疗的潜在候选者，发现bar在这种淋巴瘤类型中的适应症可能是困难的。
候选患者的鉴定：
测试尚待建立。
实施策略：
在i/ii期试验中证明fl-bar在多次复发性fl患者中的单药活性。由于迄今为止可用的fl-bar的比率较低，因此将50名患者招募进i/ii期可能需要几年的时间。30％的反应率将是临床相关的目标。
如果有效，则在复发性患者中将fl-bar与流行的挽救治疗相结合而进行的随机化iii期研究将成为一种选择。
另一种选择将是在对一线治疗有反应的患者中进行巩固/维持治疗的fl-bar随机化研究，无论是在所有有反应的患者中，还是仅在可以检测到微小残留病的那些有反应的患者中。
实施例2：ars2在u2932细胞中的内化
在与flag标记的ars2(uniprot登录号q9bxp5，2016年4月13日最后修订的版本127)蛋白质(10μg/ml，30分钟，4℃)温育后，将细胞量分成2个池，其中第一个保持在4℃并立即染色，而另一个在37℃下温育1小时，然后染色。通过以下程序将两个池在4℃下染色：将每个池再分成2份，其中一份保持不处理，而另一份用2％pfa/0.2％皂苷处理。然后添加小鼠抗flagmab(30分钟)，再用力洗涤(pbs)，然后与抗小鼠-fitcmab(30分钟)温育。之后，再次洗涤细胞(pbs4℃)并通过facs分析。
facs分析清楚地表明，在4℃下，仅在细胞表面检测到ars2，而在37℃下的1小时内化后ars2在细胞质中富集。x轴：fsc；y轴：fitc信号(图1)。
实施例3：抑制免疫毒素处理的abc型dlbcl细胞的增殖。
抑制免疫毒素处理的abc型dlbcl细胞的增殖。在作为对照的偶合到ars2(ars2-eta)或neurabin(nrb1-eta)的假单胞菌外毒素存在下培养(37℃，24h)ars2阳性(u293，oci-ly3)和ars2阴性细胞系(hbl-1，tmd8)。使用ez4u试剂盒(biomedica,vienna,austria)根据制造商的说明测量细胞增殖(图2)。
实施例4：通过ars2-免疫毒素构建体杀灭oci-ly3细胞。
在ars2-eta或nrb1-eta存在下培养oci-ly3细胞(2.5×104个细胞/1μg毒素/孔)。通过台盼蓝染色和计数来分析培养物的活细胞(图3)。
实施例5：通过毒素缀合的ars2来特异性抑制异种移植的abc型ars2阳性人dblc细胞在scid小鼠中的生长。
从charlesriverlaboratories(koln,germany)获得5-7周龄的雌性scid-米色小鼠。将100μlpbs/基质胶中的5×106个ars2阳性oci-ly3细胞各自在第0天皮下注射到5-7周龄雌性scid米色小鼠的胁腹。分别在pbs中以75μg毒素/ml的剂量将200μl作为对照的ars2-eta或nrb1-eta在肿瘤接种后第6天注射到尾静脉中一次。使用游标卡尺在两个垂直方向上每天测量肿瘤直径。根据v＝(π/6)×最小直径×最高直径来计算肿瘤体积。得自3只经ars2-eta(绿线)和arb1-eta处理的小鼠的结果示于图4。
实施例6：cd3-ars2与dlbcl细胞系的结合
背景
据怀疑，自身抗原在不同类型的b细胞瘤的发生中起着重要作用。该假设暗示了要限制机械重复的ighv库在cll、mcl中的使用，最近在dlbcl中也发现了要限制使用。近来，ars2被鉴定为约5％dlbcl中的生长刺激性自身抗原，在此称为ars2反应性淋巴瘤，其以高亲和力与很大一部分dlbcl的b细胞受体(bcr)结合。我们设计了含有针对连接到ars2的cd3(cd3-ars2)的重组单链片段(scfv)的双特异性产物。一个位点涉及人类t细胞的t细胞共受体cd3，另一个位点以高特异性识别ars2反应性淋巴瘤的b细胞受体，以将t细胞重定向至淋巴瘤细胞。我们测试了这种双特异性构建体对ars2反应性淋巴瘤细胞系的选择性细胞毒性。
材料和方法
通过标准克隆技术在pcdna3.1载体中克隆了okt3杂交瘤的vl和vh基因以及含有ars2表位的33个氨基酸的dna序列克隆。vh和vl通过甘氨酸-丝氨酸接头连接，vl与ars2表位也一样，从而产生vh-glyser-vl-glyser-ars2肽链。包括组氨酸尾巴以用于随后的检测和纯化。
将最终的克隆产物在hek细胞中转染以产生双特异性构建体。通过流式细胞术评估了与淋巴瘤细胞系(oci-ly3、u2932、hbl-1)和pbmc的结合能力。与单克隆抗his标签抗体温育后，使用western印迹分析检测cd3-ars2。通过ldh释放测定法评估细胞毒性。
使用sigma-aldrich的x-tremegenetmhpdna转染试剂进行hek293细胞中的转染。通过流式细胞术评估与淋巴瘤细胞系(oci-ly3、u2932、hbl-1)和pbmc的结合能力。与单克隆抗his标签抗体温育后，使用western印迹分析检测cd3-ars2。使用基于钴的“固定化金属亲和色谱(imac)”完成蛋白质的纯化。该技术使用与组氨酸标记的蛋白(例如cd3-ars2)结合的磁珠。用ldh释放测定法(roche的“细胞毒性检测试剂盒”)评价细胞毒性。
所用的引物如下：
cd3-vh-hindiii(5‘-3‘)：
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cd3-vh-bamhi(5‘-3‘)：
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结果
我们的cd3-ars2双特异性构建体经由其b细胞受体同时结合t细胞和ars2反应性淋巴瘤细胞系上的cd3。其仅在ars2反应性淋巴瘤细胞系中诱导快速的细胞毒性，浓度低至250ng/ml，效靶比为10∶1(图5、图6)。4小时后特异性细胞介导的细胞毒性达到40％。具有特异性不同的bcr的淋巴瘤细胞系不受影响(图7)。
序列表
<110>萨尔布吕肯大学（universitaetdessaarlandes）
<120>用于治疗b细胞恶性肿瘤的手段和方法
<130>sar15379pct
<160>6
<170>patentinversion3.5
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