本发明涉及细菌来源的、改性的、可用于医学或化妆品中的合成纳米粒子。
背景技术：
趋磁细菌合成称为磁小体的氧化铁纳米粒子，其具有突出的性质，一方面是由于存在直径通常大约为20nm至120nm的大尺寸的结晶矿物中心部分，从而达成有利的亚铁磁性质，另一方面是由于它们以链布置，从而防止磁小体聚集。与由化学合成产生的纳米粒子相比，这些细菌来源的纳米粒子显示出有利的磁性性质。例如，对于同等铁浓度，当将其暴露于交变磁场的施加时，从趋磁细菌提取的磁小体链的悬浮液比通常用于磁性热疗的化学纳米粒子，例如化学超顺磁性氧化铁纳米粒子(spion)和化学亚铁磁性氧化铁纳米粒子(fion)产生更多的热量。当将这种悬浮液施用于异种移植在小鼠皮肤下的乳癌肿瘤并暴露于交变磁场的数次施加时，其诱导抗肿瘤活性(alphandéry等人，acsnano，第5卷，第6279页(2011))。另外，对于同等铁浓度，此抗肿瘤活性大于用spion或fion观察到的活性。
然而，这些磁小体链来自革兰氏阴性细菌，因此在一些情况下可能具有高内毒素浓度以及难以精确表征的生物材料。因此，本发明旨在提供一种能够克服这些问题的磁小体产生方法。
技术实现要素：
本发明起因于发明人意想不到的证实，即磁小体的天然周围涂层可以用另一种涂层代替，以产生可用于健康、诊断和/或化妆品的无热原性的合成纳米粒子。
因此，本发明涉及一种包含至少一种合成纳米粒子的制剂，其中所述纳米粒子包含：
-由活生物体合成的主要包含氧化铁的结晶矿物中心部分，以及
-不包含源自所述活生物体的材料的周围涂层。
本发明的制剂可以包含至少1、2、3、5、10、100、103、104、105、106、107、108、109个合成纳米粒子，所述合成纳米粒子包含在1μm3、1mm3或1dm3的体积中。其可以是优选包含在液体介质中的合成纳米粒子的悬浮液，或者它可以是包含在液体、固体或气体介质中的合成纳米粒子的组装物。
本发明还涉及主要包含由活生物体合成的氧化铁并且不包含任何涂层的结晶中心部分。
合成纳米粒子是这样的一种粒子：其尺寸为在至少一个维度上小于10、5、2、5或1μm，优选小于750nm、500nm、400nm或300nm，最优选小于200nm或100nm；优选处于固态；并且其尺寸特别地是可通过透射电子显微镜检查(tem)测量的。词语“合成的”表示纳米粒子使用至少一个涉及人的步骤来制造，特别是使用生物或化学方法来制造。
本发明的合成纳米粒子可以具有至少一种磁性性质，例如：
-为抗磁性的、超顺磁性的，优选亚铁磁性的或铁磁性的，
-具有至少一个磁畴，
-具有至少一个非零磁矩，
-在高于0k、10k、100k、273k、310k、373k或1000k的温度下具有大于0.5oe、1oe、10oe、100oe或1000oe的矫顽力，或者
-在高于0k、10k、100k、273k、310k、373k或1000k的温度下，剩余磁化强度和饱和磁化强度之间的比率大于0.01、0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、0.95或0.99，
这些性质优选是由于其中心部分的性质。
本发明的合成纳米粒子优选是具有单个磁畴的纳米粒子，与具有几个磁畴的纳米粒子相比，其可以达成更好的磁性性质。
本发明的合成纳米粒子优选是亚铁磁性或铁磁性纳米粒子，特别是磁矩在生理温度下是热稳定的和/或尺寸大于1nm、2nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、500nm或1000nm的纳米粒子。
本发明的合成纳米粒子可以是超顺磁性纳米粒子，特别是磁矩在生理温度下是热不稳定的和/或尺寸小于1nm、2nm、5nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm、500nm或1000nm的纳米粒子。
本发明的合成纳米粒子的平均直径可以使用透射电子显微镜检查(tem)或者借助动态或非动态光散射法来测量。
所述合成纳米粒子的中心部分主要包含氧化铁，即至少10％或25％，优选至少50％、75％、95％、97％、99％、99.5％或99.9％的氧化铁。该氧化铁百分比特别对应于中心部分的氧化铁中所包含的原子数除以合成纳米粒子的氧化铁中所包含的原子数，或者对应于中心部分中所包含的氧化铁的质量除以合成纳米粒子中所包含的氧化铁的质量。
优选地，氧化铁是磁赤铁矿、磁铁矿或者介于磁赤铁矿和磁铁矿之间的中间组分。
优选地，合成本发明的合成纳米粒子的中心部分的活生物体是真核细胞或细菌，更优选是合成磁性纳米粒子的细菌，甚至更优选是趋磁细菌。
最优选地，本发明的细菌属于趋磁菌株，特别是磁性磁螺菌(magnetospirillummagneticum)amb-1、海洋趋磁球菌(magnetococcusmarinussp.)mc-1、blakemore磁弧菌(magnetovirriumblakemorei)mv-1、mv-2和mv-4、趋磁螺菌(magnetospirillummagnetotacticum)ms-1、格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(magnetospirillumgryphiswaldense)msr-1、磁性磁螺菌mgt-1和磁性脱硫弧菌(desulfovibriomagneticus)rs-1。
还将注意到，本发明的合成纳米粒子与从趋磁细菌提取的通常以链布置的磁小体不同，区别在于在其涂层中不存在源自趋磁细菌的有机材料。所述涂层优选不包含非变性有机材料。变性在此被定义为生物大分子(例如核酸或蛋白质)损失其通常的三维构象。合成纳米粒子在其涂层中实际上可以包含源自趋磁细菌的变性有机物质。这种变性有机材料可以在旨在纯化纳米粒子的处理，例如化学、热或磁性处理或者这些处理的组合之后出现。
在一个实施方案中，涂层包含小于50％、25％、10％或1％的来自趋磁细菌的非变性有机材料，例如脂质、内毒素和/或来自趋磁细菌的非变性蛋白质。该非变性有机材料的百分比特别对应于涂层中所包含的这种材料的质量除以合成纳米粒子的质量。该少量的来自细菌的有机材料可以通过在纯化的中心部分的表面或内部的化学官能团(例如磷酸酯或胺)的质量来表征，其小于1mg、0.1mg、0.01mg、0.001mg、0.0001mg或40ng/1mg中心部分的总铁。该少量的非变性有机材料使得能够以根据有效标准足够低水平的热原性来产生合成纳米粒子的悬浮液，特别是允许施用于人或动物。
在一个实施方案中，本发明的制剂包含至少2个、5个、10个、20个、30个、50个、100个、150个、200个、500个、10000个、50000个或100000个通过连接材料彼此接合的合成纳米粒子。连接材料可以具有以下性质中的至少一个：i)至少部分地由与合成纳米粒子的涂层相同的材料制成，ii)在小于或大于1mm、100μm、10μm、1μm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、2nm或1nm的距离上，将至少两个合成纳米粒子连接在一起，iii)促进细胞内化，iv)带正电或带负电或中性的，v)具有或不具有治疗或诊断效果，vi)具有足够的抗性以确保在以下情况下至少两个合成纳米粒子之间的连接：当制剂在液体、物理介质、气体介质或生物介质中时，或在灭菌后，或在物理、生物或化学处理后，例如借助于对于(特别用于施用至生物体的)制剂配方的溶液或介质，vii)包含小于20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.1％、0.01％或0.001％的来自所述活生物体的碳材料，viii)不是来自所述活生物体。
合成纳米粒子可以几何图形布置，所述几何图形可以是直链、圆形、正方形、矩形、三角形、五边形、六边形、七边形、八边形、多边形或多面体。这些图形可以通过透射电子显微镜检查来观察。
至少两个合成纳米粒子根据几何图形的布置可以对应于以下这些纳米粒子的布置，这些纳米粒子：i)结晶轴以优选方向取向，ii)属于两个不同合成纳米粒子的至少两条边或两个面平行或垂直，或者形成大于或小于1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、180、225、250、300、325、350或379度的角，iii)当这些纳米粒子暴露于施加磁场，特别是强度大于10-10t、10-9t、10-8t、10-7t、10-6t、10-5t、10-4t、10-3t、10-2t、10-1t、1t的磁场时，平行于磁场对准，或者iv)具有将至少两个合成纳米粒子连接在一起的连接材料。
在几何图形内的至少两个合成纳米粒子的布置可以通过作为ph的函数的ζ电位的变化来表征，当ph从1增加至14、从2增加至12、从3增加至11、从4增加至10、从5增加至9或从6增加至8时，其为连续变化，例如连续降低或增加，优选连续降低，其中连续降低或增加可以对应于在超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个不同的ph单位之间测量的变化，其为降低或增加。
相比之下，不在几何图形中的至少两个合成纳米粒子的布置(例如聚集体)可以通过作为ph的函数的ζ电位的变化来表征，当ph从1增加至14、从2增加至12、从3增加至11、从4增加至10、从5增加至9或从6增加至8时，其为一系列的至少1、2、3、4、5、7、9、10、12、15、20的降低和增加。
在几何图形内的布置可以在固体、液体或气体介质中进行，即特别是在围绕所述合成纳米粒子的介质中，例如用于配制所述合成纳米粒子的介质或者在其研究或表征期间围绕这些纳米粒子的介质。
根据本发明，优选的是，当合成所述合成纳米粒子的中心部分的活生物体是趋磁细菌时，本发明的合成纳米粒子包含用化合物包被的磁小体的中心部分。
优选地，本发明的合成纳米粒子的中心部分具有以下性质中的至少一个：
(α)呈现至少1、2、5、10、50、100、150或200个结晶平面的结晶部分，优选在矿物形式内，主要包含氧化铁，优选磁赤铁矿，特别是当使中心部分与氧接触时，为磁铁矿，特别是当中心部分不与氧接触时，或者为磁赤铁矿和磁铁矿的混合物，
(β)亚铁磁性或铁磁性行为，特别是在生理温度下，
(χ)单个磁畴或磁性单畴，
(δ)磁性微结构，其可通过磁场线的存在来表征，所述磁场线可以优选方向取向，所述优选方向例如合成纳米粒子的中心部分的易磁化轴或晶向，例如[111]，其中这种磁性微结构在某些条件下可能可观察到，特别是通过电子全息术，
(ε)尺寸为1nm至2μm、5nm至1μm、5nm至500nm、5nm至250nm、5nm至100nm、5nm至80nm、5nm至60nm、10nm至1μm、10nm至500nm、10nm至250nm、10nm至100nm、10nm至80nm、10nm至60nm、15nm至1μm、15nm至500nm、15nm至250nm、15nm至100nm、15nm至80nm、15nm至60nm、20nm至1μm、20nm至500nm、20nm至250nm、20nm至100nm、20nm至80nm或20nm至60nm，
(γ)尺寸小于2000nm、1000nm、500nm、400nm、300nm、200nm、150nm、120nm、100nm、95nm、90nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm、50nm、45nm、40nm、35nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm或5nm，
(η)可能存在ζ电位、电荷、表面电荷，
(ι)等电点，优选低于或等于7、6、5、4、3、2或1的ph的酸性等电点，
(ιι)等电点，当中心部分的表面处残留最少量的有机材料时，所述等电点最接近7；当残留少量的有机材料时，等电点可以在ph6.5和ph7.5之间、ph6.2和ph7.1之间、或ph6.1和ph7.1之间。
如本领域技术人员所理解，ζ电位、电荷、表面电荷通常取决于ph、盐度、合成所述合成纳米粒子的中心部分的细菌种类、聚集状态、这些中心部分的表面处有机材料的百分比。它们可以：(1)在酸性ph下，在等于或低于7、6、5、4、3、2或1的ph下，为正电的，(2)在碱性ph下，在大于或等于13、12、11、10、9、8、7的ph下，为负电的，(3)在-10mv至10mv、-20mv至20mv、-30mv至30mv、-40mv至40mv、-50mv至50mv、-60mv至60mv、-70mv至70mv、-80mv至80mv、-90mv至90mv、-100mv至100mv、-150mv至150mv或-200mv至200mv的范围内随ph变化，(4)当在这些合成纳米粒子的中心部分的表面处残留的有机材料(优选碳材料)的量最低时，随ph值变化最显著。
优选地，合成纳米粒子的中心部分包含小于50％、25％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％的有机材料。如本文所用，该有机材料的百分比表示以包含在有机材料例如碳、氮、磷中的任何化学元素或化学元素的组合的质量或原子数或体积计的百分比。该百分比可以使用例如总有机碳(toc)或碳、氢、氮、硫、氧(chns/o)分析仪等元素分析仪器进行测量。
在一个实施方案中，本发明的涂层，也称为周围涂层是固体、液体或气体材料，优选呈固体状态，其特别是以结晶或不结晶的层的形式围绕中心部分，特别是跨越从中心部分的中心测量的小于100μm、10μm、5μm、1μm、500nm、250nm、100nm、10nm或1nm的距离。该涂层可特别用于稳定中心部分或将合成纳米粒子连接在一起。
涂层可以具有至少一种与中心部分共同的性质或至少一种与中心部分不同的性质。
根据本发明，周围涂层优选不包含源自活生物体的非变性材料。它可以包含小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.1％、0.05％、0.01％、0.001％或0.0001％的这种材料。该百分比可以定义为涂层中所包含的来自活生物体的原子数除以涂层中所包含的总原子数的比率，或者涂层中所包含的来自活生物体的原子质量除以涂层中所包含的总原子质量的比率。该百分比可以对应于碳或有机材料的百分比。
本发明的合成纳米粒子是无热原性的，其中无热原性可以通过测量每毫克合成纳米粒子(优选包含在1毫升制剂中)的内毒素的量来定义，其小于或等于109、108、107或106，优选小于或等于104或103，最优选小于或等于100、50、10、5或1个内毒素单位(eu)。如本领域技术人员所了解，1eu可以对应于每ml100μg源自大肠杆菌的内毒素的量。
优选地，当合成纳米粒子的涂层或其中心部分无热原性时，优选当合成纳米粒子的涂层及其中心部分无热原性时，合成纳米粒子为无热原性的，其中在这种情况下无热原性可以通过测量每毫克的合成纳米粒子中心部分和/或涂层(优选包含在1毫升制剂中)的内毒素的量来定义，其小于或等于109、108、107或106，优选小于或等于104或103，最优选小于或等于100、50、10、5或1个内毒素单位(eu)。
如本文所用，当制剂中所包含的合成纳米粒子以外的物质，例如包含在赋形剂中的物质和/或制剂的溶剂和/或围绕合成纳米粒子的基质无热原性时，制剂是无热原性的。
优选地，无热原性制剂的特征在于内毒素的百分比小于或等于50％、20％、1％、10-1％、10-2％、10-3％、10-4％、10-5％、10-6％、10-7％、10-8％或10-9％，其中该百分比可以为：(i)内毒素的质量除以制剂的总质量，(ii)内毒素所占据的体积除以制剂的总体积，(iii)制剂的内毒素中所包含的原子数除以制剂中所包含的总原子数。
优选地，无热原性制剂的特征在于内毒素的量小于或等于109、108、107或106，优选小于或等于104或103，最优选小于或等于100、50、10、5或1eu或eu/毫克氧化铁或eu/毫升或eu/毫克氧化铁/毫升。
在一个实施方案中，无热原性制剂是施用于诸如个体或动物的生物体的药物。它优选所包含的内毒素量小于以下：(i)对于非鞘内施用，每小时施用、每千克该生物体的体重，5eu，和(ii)对于鞘内施用，每小时施用、每千克该生物体的体重，0.2eu。
在一个实施方案中，无热原性制剂是医疗装置，特别是侵入性装置。因此，其所包含的优选在医疗装置的表面处测量的内毒素量优选小于：(i)当制剂不与脑脊液接触时，每毫升制剂0.5eu，和(ii)当制剂与该液体接触时，每毫升制剂0.02eu。
优选地，本发明的无热原性制剂所包含的内毒素量符合适用于药物、医疗装置或化妆品的适用的监管标准，特别是符合药典，最优选欧洲和/或美国药典。
所述无热原性制剂可以任选地在大于或等于以下值的施用时间内施用于生物体：1、30或60秒，1、30或60分钟，1、15或24小时，1或5天，1或4周。在所述无热原性制剂在大于或等于这些值的施用时间内施用于生物体的情况下，制剂中所包含的内毒素量可大于当相同制剂在小于这些值的时间内施用的情况。
优选地，通过鲎变形细胞裂解物试验(lal)来测量制剂中的内毒素量。如本领域技术人员所理解，优选确保纳米粒子不干扰测试，特别是通过测量回收率。该回收率可以定义为等于c总/c1+c2，其中c总是与已知量的内毒素，例如0.5eu/ml混合的合成纳米粒子的悬浮液的内毒素浓度。在该实施例中，c1是不同的合成纳米粒子的悬浮液中的内毒素浓度，并且c2＝0.5eu/ml。当该回收率大于或等于10％或30％，优选50％、100％或150％时，可以认为没有干扰。
本发明的制剂的热原性可以通过兔热原性试验，特别是根据iso10993-11，美国药典或欧洲药典的第151章进行评估。该试验可以通过以下方式进行：将制剂静脉内施用于1只或数只兔子，优选3只，优选使用一定量的合成纳米粒子，所述量通常但不必须大于或等于1mg。特别地，在制剂是医疗装置的情况下，这样的量似乎是合适的，因为它大于6cm2/ml或mg合成纳米粒子，特别由iso10993-12标准所推荐。实际上，考虑到边为50nm的立方体合成纳米粒子的表面，即15.10-11cm2，以及1mg主要由磁赤铁矿构成的合成纳米粒子包含1.610-12个合成纳米粒子，可估计1mg合成纳米粒子的表面积为94cm2，大于6cm2。然后，通过以下方式来证明制剂不存在热原性：根据欧洲药典，测量三只兔子的温度升高的总和，其必须不超过10.5、2或1℃，优选2.65℃，或者根据美国药典，测量每只兔子的温度升高，其不应超过10、5、2、1或0.1℃，优选0.5℃，或者遵循一或多部药典，特别是欧美药典的建议。
优选地，本发明的制剂是无热原性的或无免疫原性的。特别地，免疫原性或热原性可以由非矿物生物物质、脂质、蛋白质、酶、dna或rna引起，无论这些物质是由不同于人的活生物体产生，还是至少部分地由人合成。
优选地，当本发明的制剂包含小于109个、108个、107个、106个、105个、104个、103个、102个、101个或1个生物分子，例如蛋白质、脂质、酶、dna或rna时，本发明的制剂是无热原性或无免疫原性的。
在一个实施方案中，当本发明的制剂本身不诱导免疫系统的显著应答，即它不具有显著的药物或医学活性，特别地，制剂本身不具有任何抗肿瘤活性时，本发明的制剂可被认为是无热原性或无免疫原性的。如本领域技术人员所理解，当使制剂暴露于例如磁场，优选交变磁场的辐射施加时，制剂可具有药物或医学活性，例如抗肿瘤活性。
在一个实施方案中，制剂、合成纳米粒子、其中心部分和/或其涂层可以是无热原性的和免疫原性的，或者是无热原性的和无免疫原性的。热原性可被认为是由内毒素引起的免疫原性。
优选地，本发明的合成纳米粒子具有低水平的聚集，在给定介质中、优选在制剂中和/或在施用其的生物体中具有均匀分布。该均匀分布的特征在于：(i)这些合成纳米粒子以该介质的0.1％、1％、5％、10％、25％或50％存在，其中该百分比可以定义为合成纳米粒子所占据的体积除以所考虑介质的总体积，(ii)合成纳米粒子的沉降在长于1小时内，优选在长于一周内，最优选在长于15天内发生，(iii)合成纳米粒子的沉降在长于制剂在生物体中的施用时间的时间内发生。合成纳米粒子的沉降可以通过存在聚集体来显示，所述聚集体优选在液体中沉降并且肉眼可见，通过光学显微镜或通过光谱测量，特别是通过吸收光谱测量可见。
优选地，本发明的合成纳米粒子在悬浮液中是稳定的，或者本发明的制剂是稳定的。稳定性被定义为合成纳米粒子保持悬浮而不沉降的能力。稳定性特别地可以通过吸收测量来测量，优选通过在合成纳米粒子吸收的波长(通常为400nm至600nm，最通常等于480nm)下，在大于1nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、450nm、500nm、600nm或800nm、1μm、5μm或10μm的波长下，在低于10μm、5μm或1μm、800nm、600nm、500nm、450nm、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm或1nm的波长下测量随时间的吸收变化来测量。优选地，稳定性使得合成纳米粒子的悬浮液的光密度或吸收的降低不超过50％、25％、10％、5％、2％、1％或0.1％，其中该降低百分比可以被定义为等于[吸收(t0)-吸收(t)]/吸收(t0)，其中吸收(t0)和吸收(t)分别是在测量开始和结束时测量的吸收。特别地，该降低可以随时间测量如下时间段：超过1.5、15、25、45或60秒，2、5、10、30、45或60分钟，将合成纳米粒子的悬浮液施用于生物体所需时间的2、5、10、50、100或1000倍的时间。其可以在刚制备制剂后、制备制剂后的数天后、数周后、数月后、数年后进行测量。其优选在特别是通过超声处理、振动、搅拌将制剂匀化后进行测量。
根据一个实施方案，本发明的制剂对于大于0.01、0.05、1、5、10、30、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800或900mg/ml、1、2、5或10g/ml的合成纳米粒子的铁浓度是稳定的。
在一个实施方案中，合成纳米粒子的分布均匀性、稳定性大于从活生物体，优选趋磁细菌提取的合成纳米粒子的分布均匀性、稳定性或者大于合成纳米粒子的中心部分的或spion或fion的分布均匀性、稳定性。
在一个实施方案中，合成纳米粒子可以具有：
-与其中心部分共同的性质，优选性质(α)、(β)、(χ)、(δ)、(η)(见第5-6页)，
-比其中心部分和/或涂层的尺寸大0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、75、100、250或500nm、1、5、10、50或100μm的尺寸，
-等电点，特别是不同于其中心部分和/或涂层的等电点，
-ζ电位、电荷、表面电荷，特别地，这三个参数中的任何一个和/或作为ph的函数的变化不同于其中心部分和/或涂层，
-无热原性，小于、大于或等于其中心部分和/或其涂层的无热原性。
在一个实施方案中，本发明的涂层有利于物质与合成纳米粒子的附着，能够限制毒性并产生特定组织，例如：(i)链布置，即至少两个合成纳米粒子连接在一起的布置，这些纳米粒子的结晶轴或场线可能对准，(ii)在几何图形内的布置，(iii)有序的并通过存在几何图案被表征，所述几何图案例如圆形、矩形、菱形、正方形、椭圆形。这样的组织可以通过tem测量来突出显示，特别是通过以合适的浓度沉积一滴合成纳米粒子制剂，以便能够观察合成纳米粒子在其组装物中的布置。
在一个实施方案中，涂层不是源自合成所述合成纳米粒子的中心部分的生物体，这可有助于其表征，特别是当涂层的结构或组成是已知的、简单的、可识别的或易于表征的时。
在一个实施方案中，涂层是无热原性物质。
在一个实施方案中，涂层包含至少一种能够与合成纳米粒子的中心部分，特别是氧化铁建立弱相互作用或共价键的化合物。
在一个实施方案中，涂层包含至少一种能够被化学吸附或物理吸附于合成纳米粒子的中心部分上的化合物。
在一个实施方案中，涂层包含至少一种能够与fe2+或fe3+离子、氢氧根离子oh-、氧离子o2-、中心部分的结晶缺陷建立相互作用或键的化合物，其可以在合成纳米粒子的中心部分的表面中或表面处。
在一个实施方案中，涂层包含至少一种化合物、原子、离子或化学官能团，例如酸、羧酸、磷酸或磺酸官能团，其中涂层中所包含的化合物、原子或离子能够与中心部分或中心部分的至少一个原子、中心部分的化学官能团、中心部分的离子例如fe2+、fe3+、氢氧根离子oh-、氧离子o2-或中心部分的结晶缺陷建立相互作用或键。
中心部分的原子、化学官能团或离子可以在合成纳米粒子的中心部分的表面中或表面处。
在一个实施方案中，涂层选自与spion或fion相比为合成纳米粒子产生更好的加热性质的化合物。因此，涂层优选包含作为良好热导体的物质。
在一个实施方案中，涂层选自在合成纳米粒子中产生组织或组装性质的化合物，其有利于辐射或磁场例如交变磁场对这些合成纳米粒子的作用。辐射或磁场的作用可以特别是这些纳米粒子的移动、振动、旋转或平移。
在一个实施方案中，涂层的厚度小于合成纳米粒子的中心部分的平均直径，小于该直径的一半，小于该直径的四分之一，小于10.5、2.5或1μm、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、4、3、2、1或0.5nm。这样的厚度特别可以实现限制毒性。
在一个实施方案中，涂层的厚度通常大于合成纳米粒子的中心部分的平均直径，大于该直径的一半，大于该直径的四分之一，大于0.1、0.5、1、2、4、8、10、15、20或25nm。这样的厚度特别可以实现将合成纳米粒子连接在一起或防止聚集体的形成。有利地，存在足够厚的涂层能够防止合成纳米粒子粘附在一起，特别是在磁力的作用下，合成纳米粒子彼此施加所述磁力并且当这些合成纳米粒子变得彼此最接近时，磁力的强度最高。
在一个实施方案中，涂层厚度的变化百分比被定义为涂层的最小厚度除以涂层的最大厚度，其可使用特别是tem在于制剂中的合成纳米粒子上进行测量。在第一种情况下，涂层的厚度是均匀的。因此，厚度变化百分比优选小于106％、105％、104％、103％、500％、100％、50％、10％、5％、1％或0.1％。均匀的厚度可以特别允许合成纳米粒子的均匀分布。在第二种情况下，涂层的厚度是不均匀的。因此，厚度变化百分比大于0.1％、1％、5％、10％、50％、100％、500％、103％、104％、105％或106％。不均匀的厚度可以特别导致各种不同强度的磁力的分布。
在一个实施方案中，涂层的铁含量小于或等于合成纳米粒子的中心部分的铁含量的1、2、5、10、102、103、104、105或106倍。
在另一实施方案中，涂层的除铁和氧以外的至少一种原子的含量大于或等于合成纳米粒子的中心部分的含量的1、2、5、10、102、103、104、105或106倍。
在一个实施方案中，涂层是引起合成纳米粒子表面的表面张力变化大于10-4％、10-3％、10-2％、10-1％、1％、5％、10％、20％、50％或100％的表面活性剂，其中该百分比被定义为等于ts(cp)-ts(sn)/ts(cp)，其中ts(cp)和ts(sn)分别是中心部分和合成纳米粒子的表面张力。
在一个实施方案中，涂层包含碳化合物。
在一个实施方案中，涂层包含至少一种选自由以下组成的组的化合物：螯合剂、两亲性分子、极化或带电聚合物、金属或硅的氧化物、金属或硅的氢氧化物、酸、这些化合物的酸性、碱性、氧化的、还原的、中性的、带正电的、带负电的衍生物，以及这些化合物或衍生物中的几种的组合。
在一个实施方案中，涂层包含至少一种选自由以下组成的组的化合物：多糖、脂肪酸、磷脂、氨基酸聚合物、聚合或非聚合二氧化硅和脂族胺聚合物、这些化合物的酸性、碱性、氧化的、还原的、中性的、带正电的、带负电的衍生物，以及这些化合物或衍生物中的几种的组合。
在一个实施方案中，涂层不包含磷脂或蛋白质或rna或dna或者细菌、细胞或生物来源的化合物或衍生自趋磁细菌的化合物。
在一个实施方案中，涂层包含至少一种选自由以下组成的组的官能团：磷酸、羧酸、磺酸、酯、酰胺、酮、醇、酚、硫醇、胺、醚、硫化物、酸酐、酰卤、脒、腈、氢过氧化物、亚胺、醛、过氧化物、这些化合物的酸性、碱性、氧化的、还原的、中性的、带正电的、带负电的衍生物，以及这些化合物或其衍生物中的几种的组合。
在一个实施方案中，本发明的涂层选自可优选通过高压灭菌进行灭菌的物质、生物相容性、生物可降解的物质，其不诱导代谢作用、免疫作用、细胞毒性作用、药理作用，其可通过静脉内和/或免疫途径施用。这种物质可以是聚维酮、peg400、泊洛沙姆188、葡聚糖、磷脂酰胆碱、二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱、或这些物质的衍生物。
涂层的类型可以根据以下参数来选择：
(i)合成纳米粒子的施用途径：例如，对于静脉内施用，可以最终选择能够防止巨噬细胞捕获合成纳米粒子的涂层，例如peg或葡聚糖，
(ii)细胞内化：为了支持细胞内化，可以最终选择具有正电荷的涂层，例如聚-l-赖氨酸。
在一个实施方案中，本发明的制剂可以用作药物或诊断剂，特别是在例如使用磁性热疗来治疗肿瘤的背景下。
在一个实施方案中，使用该制剂的医学、兽医或美容干预或手术优选以指定的时间顺序包括以下序列中的至少一个：
(i)向生物体施用制剂，特别是通过局部途径、粘膜皮肤、肠内、胃肠外、肿瘤内、静脉内或动脉内施用，
(ii)使合成纳米粒子靶向生物体的一部分，例如器官、肿瘤、血管，
(iii)治疗或检测生物体的那一部分。
在一个实施方案中，本发明的制剂可用于化妆品应用。
在一个实施方案中，本发明的制剂以比包含从趋磁细菌提取的磁小体链的悬浮液的最大施用浓度更高的浓度施用，优选地以铁计14mg/ml。其也可以大于或等于0.01、0.05、1、5、10或15mg/ml，优选25、50、100或150mg/ml，最优选大于或等于200、300、400、500、600、700、800或900mg/ml、1、2、5或10g/ml的铁浓度施用。这可以通过合成纳米粒子与从趋磁细菌提取的磁小体链和/或spion和/或fion相比更高的溶解性或更低的沉降得以实现。
在一个实施方案中，本发明的制剂可以小于或等于1kg/ml、500、250、100、50、10、5、2或1g/ml，优选小于或等于900、700、500或400mg/ml，最优选小于或等于300、200、150、100、10、1或0.1mg/ml的铁浓度施用。
在一个实施方案中，治疗可以通过施加交变磁场来进行，即通常称为磁性热疗的技术，而检测可以特别地通过磁共振成像(mri)来进行。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物或药物，其包含作为活性成分的如上文所述的制剂以及任选的至少一种药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的制剂的医疗装置。
在一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的制剂的诊断组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及包含作为化妆品活性成分的本发明的制剂的化妆品组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗个体或动物中的肿瘤的方法，其中施用治疗活性量的本发明的制剂。
在一个实施方案中，本发明涉及用于制备如上文所述的制剂的方法，其包括以下序列：
(i)从由活生物体合成的包含主要由氧化铁组成的结晶矿物中心部分和生物周围涂层的纳米粒子的制剂分离所述矿物中心部分；
(ii)用周围涂层处理所得制剂以覆盖所述中心部分；
(iii)任选地对所述制剂进行灭菌，优选在序列(i)之后，可在序列(ii)之后。
在一个实施方案中，磁小体的中心部分被或不被不属于该中心部分的化合物或物质围绕。
在一个实施方案中，使经处理的磁小体与已经经历过处理的磁小体结合，特别是在细菌发酵的序列之后。
在一个实施方案中，序列(i)和/或(ii)可以包括：
(a)化学纯化方法，被称为的所述化学纯化方法的目的特别是通过化学方法来移除围绕磁小体中心部分的全部或部分材料。它可以在于将序列(i)或(ii)的任何悬浮液与化学溶液混合，被称为的所述化学溶液优选以大于0.001、0.01、0.1、1、10或100μm、1、10或100mm、1m的浓度，优选以小于1000、100、50、10、5、2或1m、500、100、50、10、5或1mm、100、50、10、5或1μm的浓度。该化学溶液可以是低渗溶液；裂解缓冲液；用于从某些表面解吸或分离磁小体、用于移除不位于磁小体中心部分的表面中或表面处的所有材料，特别是有机材料、用于移除一些洗涤剂残留的溶液。该化学溶液可以包含以下化学物质：(i)化学变性剂，例如氢氧化钠、氢氧化钾或具有中性、酸性或碱性ph的溶液，(ii)有机溶剂，例如甲苯、醚、醇、苯乙基、二甲亚砜(dmso)、苯、甲醇、氯仿，(iii)离液剂，例如尿素、苯酚、胍、氯化胍、硫氰酸胍，其特别能够通过改变水的结构将疏水性化合物引入水溶液中，(iv)螯合剂，例如乙二胺四乙酸(edta)，(v)用于去热原的物质，例如氢氧化钠、尿素、过氧化氢，其能够移除或中和内毒素，(vi)抗生素，例如硫堇，(vii)表面活性剂，例如triton、brij、duponal，(viii)还原剂，例如二硫苏糖醇(dtt)、巯基乙酸酯、β巯基乙醇，其特别能够使键或二硫键断裂，(ix)洗涤剂、具有疏水性烃基和亲水性带电荷末端的化合物，(x)表面活性剂。可以使用的洗涤剂包括离子型、阳离子型或阴离子型洗涤剂、非离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、离液剂、十二烷基硫酸钠(sds)、去氧胆酸盐、胆酸盐、triton，特别是tritonx100、n-十二烷基-1β-d-麦芽糖苷(ddm)、毛地黄皂苷、tween20、tween80、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(chaps)、尿素、盐酸胍、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(np-40)。所述化学溶液还可以包含水或前述化学物质的任何一种衍生物；
(b)生物纯化方法，被称为的所述生物纯化方法的目的特别是通过生物方法来移除围绕磁小体中心部分的全部或部分材料。它可以特别涉及活生物体或衍生自这种生物体的物质，例如酶，特别是裂解酶、噬菌体、蛋白质例如蛋白酶或甘露聚糖酶；
(c)化学涂覆方法，被称为的所述化学涂覆方法在于将包含磁小体的中心部分的悬浮液与用于涂覆磁小体的中心部分的任何物质或物质的组合混合，其中所述物质被称为所述涂覆物质；
(d)热方法，被称为的所述热方法在于将在序列(i)或(ii)期间获得的任何悬浮液暴露于温度梯度，特别是高于或等于10、25、50、100、150、200、300、500、1000、2000、3000或5000℃，和/或使在序列(i)和/或(ii)期间获得的任何悬浮液处于以下温度，所述温度优选低于或等于100、50、10、0、-10、-40、-70、-77、-150、-250℃、50、30、10或1k，优选高于或等于1、5、25、-250、-70、-77、-50、-20、0、5、20、40、100、200、500、1000、2000、4000或5000℃。
(e)机械方法，被称为的所述机械方法在于向在序列(i)和/或(ii)期间获得的任何悬浮液施加：(1)优选大于1、10、100、500、103、104、105、106、107、108或109个大气压，优选低于109、108、107、106、105、104、103、500、100、10或1个大气压的压力，特别是通过使用诸如高压匀化器、弗氏细胞压碎器(frenchpress)、破碎弹(disruptingbomb)或球磨机的仪器，(2)超声处理，特别是以高于0.01、0.1、0.5、1、2、5、7、10、20、40、100、500或1000瓦的功率，以低于1000、500、100、40、20、10、7、5、2、1、0.5、0.1或0.01瓦的功率，其中超声处理时间优选长于1、2、5、10、20、30、45或60秒，长于2、5、10、20、30、45、60或120分钟，长于2、3、4或5小时，优选短于60、30、15、5或1分钟，短于60、45、30、15、10或1秒，(3)特别是使用电离射线的辐照；
(f)磁选择方法，被称为的所述磁选择方法在于将磁小体的中心部分或经处理的磁小体与没有磁性或低磁性的物质分离，所述物质定义为细菌碎片、未裂解的细菌、溶解的铁、溶解的磁小体或包含在序列(i)或(ii)的任何悬浮液中的任何材料，其不包含或包含少量的磁小体，优选每毫升制剂小于109、108、107、106、105、104、103、102或10个磁小体。为此，可以向序列(i)或(ii)的任何悬浮液施加磁场梯度，其中这种悬浮液优选包含在诸如管或瓶的容器中，所述容器优选由玻璃或不吸附改性的磁小体或磁小体的中心部分的材料构成。该磁场梯度特别地使得磁性物质，优选磁小体的中心部分或改性的磁小体朝向磁场最强的区域例如容器的壁迁移，以使它们集中在该区域，从而将其分离。该磁场梯度的强度优选高于地球磁场的强度，处于0.1、1、10或100μt、0.1、1、10或100mt、0.1、1、10、50或100t。其特别具有足够的强度以使诸如磁小体的中心部分或改性的磁小体的磁性物质能够与没有磁性或低磁性的物质分离。该磁场梯度的强度优选低于100或50t，最优选处于5或1t、100、50、10或1mt。特别地，其可具有足够低的强度以避免吸引没有磁性或低磁性的物质。这种磁场梯度可以由诸如钕磁体的磁体、电磁体或者能够产生强度优选在空间和/或时间上变化的磁场的任何仪器或材料施加。该磁场梯度可以施加长于1.5、10、30、45或60秒、5、10、30、45或60分钟、2、5、10、15或20小时、1、2或5天、1、2、3或4周、2、4或6个月的时间。在施加磁场梯度之后，可以移除不包含或包含少量的磁小体的中心部分或改性的磁小体的悬浮液的上清液，并代之以例如溶剂的物质，所述物质优选是无热原性的，例如无热原性水；
(g)另一选择方法，被称为的所述其它选择方法其间，可以特别通过使用切向过滤系统将磁小体的中心部分或改性的磁小体与细菌碎片分离，所述切向过滤系统具有带孔的柱，所述孔的尺寸使得细菌碎片能够通过，但磁小体的中心部分不能通过，或者使得磁小体的中心部分能够通过，但细菌碎片不能通过。该尺寸明显小于100、50、20、10、5、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005或0.0001μm。该尺寸可以优选为0.02μm至2μm，优选0.2μm至1μm，最优选0.2μm至0.4μm；
在一个实施方案中，序列(i)之前是合成磁小体的活生物体例如趋磁细菌的培养的序列。
在一个实施方案中，活生物体的培养序列在未完全控制的条件下进行，例如amb-1趋磁细菌在瓶中的培养条件。
在另一实施方案中，活生物体的培养序列在控制条件下进行，例如msr-1趋磁细菌在发酵罐中的培养条件，其包括：(a)包含铁的酸性营养溶液以使生长培养基的ph在细菌生长期间保持恒定，以及(b)细菌生长期间的空气供应以促进该生长，同时使培养基的氧浓度保持在低值，优选低于20毫巴，最优选低于2毫巴，以便能够进行磁小体合成。
在一个实施方案中，将序列(i)再分成三个序列，所述三个序列优选但不必须按照指定的顺序相继：(i1)趋磁细菌的裂解，(i2)不属于磁小体的中心部分并且在i1期间不可被移除的材料的移除，特别是有机材料的移除，(i3)包含磁小体的中心部分的悬浮液的回收和洗涤。所有这些序列可以使用所述方法(a)至(g)的任何组合进行，重复一次或数次。
在一个实施方案中，序列(i1)可以趋磁细菌的浓缩开始，特别是通过以1000-10000g离心和/或通过使用所述其它选择方法，优选使用切向过滤系统，其中孔的尺寸小于趋磁细菌的尺寸。该序列结束时的细菌浓度可为(i1)开始时测量的细菌浓度的1.1至104倍。然后，可以使浓缩的或未浓缩的趋磁细菌裂解。裂解可以通过渗透冲击使用所述化学方法进行，其中所述化学溶液优选为裂解缓冲液。这可以通过添加比细菌体积更大体积的裂解缓冲液进行，优选等于细菌裂解物体积的2至100倍，最优选等于细菌体积的4倍。在该序列结束时，从细菌提取的经处理的磁小体的悬浮液，其混合有细菌碎片并且可能混合有一定量的未裂解的趋磁细菌。
在另一实施方案中，序列(i2)在于优选使用所述化学溶液，优选使用洗涤剂，例如苯酚或二氯甲烷处理在(i1)结束时获得的磁小体悬浮液以移除剩余材料，特别是有机材料，使得有可能移除围绕经处理的磁小体的膜或材料，特别是有机材料。
在另一实施方案中，序列(i3)在于洗涤在(i2)中获得的悬浮液数次以移除来自洗涤剂的所有残留，并获得包含磁小体的中心部分的悬浮液。
在一个实施方案中，序列(ii)在于用涂层，优选无热原性的涂层，覆盖磁小体的中心部分。这可以使用所述化学涂覆方法进行，特别是通过将在(i3)结束时获得的包含磁小体的中心部分的悬浮液与包含该涂层的悬浮液混合。该混合可以通过匀化；通过超声处理，优选小于500、250、100、50、25、10、5、2或1瓦的低功率超声处理，特别是使用超声处理指或超声处理浴；通过搅拌；通过加热；通过辐射，从而允许涂层粘附至磁小体的中心部分的表面或与其相结合来进行。混合可以在中性、酸性或碱性ph下进行，优选在能够促进化学相互作用和/或化学反应，从而实现涂层与磁小体的中心部分之间的结合的ph下进行。所使用的涂层的质量优选为磁小体的中心部分的质量的千分之一至一千倍，优选该质量的百分之一至一百倍，最优选该质量的十分之一至十倍。在序列(ii)结束时，获得包含覆盖有无热原性涂层的磁小体的中心部分的悬浮液。
在一个实施方案中，在序列(i3)结束时获得的磁小体的中心部分优选使用不使该中心部分变性的方法，例如高压灭菌进行灭菌。然后，优选在无菌环境中进行序列(ii)，以便在序列(ii)结束时获得无热原性制剂。
在一个实施方案中，在序列(ii)结束时获得的悬浮液优选使用不会破坏涂层和磁小体的中心部分的方法，例如γ射线进行灭菌。
在一个实施方案中，包含经涂覆的磁小体的中心部分的悬浮液的获得产率被估计为等于该悬浮液中所包含的铁的量除以裂解序列之前趋磁细菌悬浮液中所包含的初始铁的量。该产率优选大于1％、2％、5％、10％、25％、50％、75％或100％。可以通过将数个所述方法彼此组合和/或通过重复所述方法中的一个或多个来优化该产率。
实验实施例：
表格说明：
表1和表2：各种类型的悬浮液的性质，所述悬浮液包含bnf-淀粉、全细菌、未涂覆的磁小体的中心部分、涂覆有聚-l-赖氨酸、壳聚糖、羧甲基葡聚糖、柠檬酸、油酸、二氧化硅、叶酸、dopc、阿屈膦酸盐、奈立膦酸盐、pei、al(oh)3的磁小体的中心部分，其中趋磁细菌种类为amb-1和msr-1。在表1中：以每毫升悬浮液每毫克铁的eu计的内毒素浓度，1mg各种悬浮液20分钟后在480nm下测量的吸收降低百分比，根据条件3处理的与gl-261细胞接触的悬浮液的温度变化(δt)和该变化的初始斜率(δt/δt)，与gl-261细胞接触的悬浮液的活细胞百分比：根据条件1处理，没有磁场(-b)；以及根据条件2处理，有磁场，最大温度升高为45℃，％活细胞(+b)。活细胞百分比是在条件1或2下经处理的活细胞数除以在37℃下未经处理的活细胞数。对于用bnf-淀粉的第一项研究，活细胞百分比是在条件1或2下经处理的活细胞数除以在45℃下未经处理的活细胞数。在表2中：包含在各种悬浮液中的经涂覆或未经涂覆的合成纳米粒子的涂层厚度(nm)、等电点(ph单位)、流体动力学尺寸(nm)、作为ph的函数以mv测量的ζ电位，经涂覆或未经涂覆的合成纳米粒子中的氮(％n)、碳(％c)、氢(％h)、硫(％s)百分比。
表3：对于不同涂层，中心部分彼此之间的结合性质。
材料和方法：
不同纳米粒子悬浮液的铁浓度的测定：首先用12n盐酸溶解纳米粒子，并用过氧化氢将fe2+离子氧化成fe3+离子。然后使用硫氰酸钾来络合fe3+离子，并且fe3+浓度通过测量络合物在476nm下的吸收来测定。
透射电子显微镜检查(tem)：使用tem来测定不同纳米粒子的尺寸、尺寸分布、纳米粒子的涂层厚度和纳米粒子的组织类型。为了进行tem研究，将不同的悬浮液洗涤两次，并再悬浮于milliq高压灭菌水中，以获得300μg/ml的铁浓度。将5μl每种悬浮液沉积在碳网格的顶部。将网格在室温下干燥至少2小时，然后在tem(jeollab6jem-2100)下观察。
鲎变形细胞裂解物试验(lal)：lal试验在无菌条件下使用称为“piercelal显色内毒素定量试剂盒”的thermoscientific试剂盒88282进行。首先，将1ml通过超声处理匀化并用无热原性水洗涤的每种悬浮液在干燥浴中在70℃下加热10分钟，以使任何残留的可使lal试验的结果失真的蛋白质变性。然后，将25μl包含10μg铁的每种悬浮液引入在整个实验期间维持在37℃温度的微孔板的孔中。加入25μllal试剂盒溶液以引发反应。反应10分钟后，将50μl显色底物引入孔中持续6分钟，以能够检测内毒素的量。最后加入25μl乙酸以停止反应。使用酶标仪在405nm下测量获得的悬浮液的光密度。然后使用试剂盒提供的标准范围估计内毒素的浓度。为了验证lal试验不干扰纳米粒子，测量定义为等于c总/c1+c2的回收率，其中c总是与已知量的0.5eu/ml的内毒素混合的纳米粒子悬浮液的内毒素浓度，c1是不同纳米粒子悬浮液中内毒素的浓度，并且c2＝0.5eu/ml。在不同测量期间估计的回收率大于50％，表明纳米粒子不干扰lal试验。
碳、氢、氮和硫(chns)的元素分析仪：使用每种冻干悬浮液的10mg铁，使用chis分析仪(thermofischerscientific的flashea1112分析仪)进行测量，从而能够测定这些悬浮液的碳、氮、氢和硫的百分比。
散射测量：使用马尔文仪器(malverninstruments)zetasizernanozs测量各种纳米粒子的ζ电位和流体动力学尺寸(在球形物体的情况下的流体动力学直径)。球形物体用相关函数的递减指数曲线来识别。对于测量，纳米粒子的悬浮液包含30μg/ml铁，并且使用盐酸和氢氧化钠溶液将ph调节在2和12之间。
吸收测量：使用uviline9400secomam吸收分光光度计在480nm下测量不同纳米粒子悬浮液的吸光度随时间的变化。
对于合成纳米粒子中心部分悬浮液中的1mg铁，伯胺浓度的测定：一种控制中心部分的纯度的方法是通过具有与伯胺反应的特殊性的tnbsa(2,4,6-三硝基苯磺酸)定量胺。第一步是向ph8.5的0.1m碳酸氢钠缓冲溶液中加入1mg中心部分的铁，然后加入tnbsa(r'-so3h)，从而导致如下反应：r-nh2+r’-so3h＜＝＞h2so3+r’-nh-r。该反应在37℃下进行2小时，并且获得的化合物呈现为黄色(r'-nh-r)，其胺浓度通过405nm下的吸收来测定。该浓度相当于中心部分的浓度。校准曲线用具有伯胺官能团的甘氨酸进行。
对于合成纳米粒子中心部分悬浮液中的1mg铁，磷酸盐浓度的测定：中心部分的磷酸盐基团的测定通过比色法进行。钼酸铵((nh4)2moo4)首先在磷酸盐(来自用于校准的储备溶液(dopc)或来自在130℃下用70％高氯酸消化2小时后待测定的样品)存在下反应。钼酸盐的沉淀物是黄色并且不稳定的。非常快速地加入抗坏血酸，其会将这种络合物还原而得到作为稳定化合物的蓝色钼酸盐(在100℃下在干燥浴中加热5分钟以激活该还原)，并通过800nm下的吸光度来测量络合磷酸盐的量。
暴露于或未暴露于交变磁场的施加的各种纳米粒子的细胞毒性和温度测量：将gl261细胞接种在t175烧瓶中直至达到70-80％汇合，移除上清液，将4ml胰蛋白酶-edta以0.25％加入细胞，将细胞孵育5分钟，然后分离。通过加入30ml细胞培养基使胰蛋白酶失活。然后，将细胞在4℃下以700rpm离心10分钟后稀释至1.25×106个细胞/毫升的浓度。将400μl细胞引入eppendorf管中，以达到每个条件约5×105个细胞。将各种合成纳米粒子的悬浮液以铁的最终浓度为1mg/ml加入管中。然后，将eppendorf管在37℃下加热10分钟。以下为三个条件。对于处理条件1，将管使用干燥加热浴在37℃下保持30分钟。对于处理条件2，通过施加频率为198khz并且平均强度调节在23mt和46mt之间的交变磁场以将温度保持在45℃，将管在45℃下保持30分钟。对于处理条件3，将管暴露于频率为198khz并且平均强度为32mt的交变磁场的施加30分钟。使用放置在eppendorf管中的热电偶探针来测量随时间的温度变化。处理后，将管内容物引入烧瓶t25中，向其中加入6mlrpmi培养基和10％胎牛血清。将细胞在5％co2存在下孵育24小时。24小时后，用台盼蓝进行细胞活力试验，从而能够区分无色活细胞与染色死细胞。
实施例1：包含bnf-淀粉的悬浮液的表征。
测试由micromod公司以化学方式合成的称为bnf-淀粉的纳米粒子(参考编号：10-00-102)。这些氧化铁纳米粒子由羟乙基淀粉围绕，并且流体动力学直径为119nm。它们的等电点为ph9.5，ζ电位从ph2下的7mv至ph12下的-20mv变化，并且用chns测量的碳百分比为8.7％。tem测量使得能够估计涂层的厚度为1至4nm。包含1mgbnf-淀粉的悬浮液在480nm下测量的吸收随时间的变化在20分钟内不降低，从而表明该悬浮液的稳定性。对这些悬浮液进行的lal试验显示低水平的内毒素(<50eu/mg/ml)。对于第一系列测量，表1显示，当bnf-淀粉悬浮液和gl-261细胞的混合物经受处理条件3时，混合物的温度略微升高6.2℃，从施加磁场前的36.5℃至施加磁场30分钟后的42.7℃。温度变化的初始斜率估计为0.009℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，表1显示活细胞百分比为78±5％，与没有磁场的处理条件1中获得的71±5％接近。这表明与加热至45℃的细胞相比，在处理条件2存在下，bnf-淀粉对gl261细胞诱导低细胞毒性。在第二系列测量中，当混合物经受处理条件2时，表1显示活细胞百分比为31％，低于在没有磁场的处理条件1期间获得的86％，该百分比通过与37℃下的活细胞数进行比较来估计。这表明与加热至37℃的细胞相比，在处理条件2存在下，bnf-淀粉对gl261细胞诱导细胞毒性。
实施例2：从菌株amb-1提取的热原性磁小体链。
制备：将磁螺菌属amb-1细菌(atcc，菌株79024)首先引入无菌培养基中，该无菌培养基包含趋磁细菌繁殖以及磁小体产生所必需的营养物和添加剂(培养基atcc1653)，然后将培养基在30℃下的孵育器中放置7天。7天后，将培养基离心，洗涤细菌沉淀物，通过使用磁体使趋磁细菌浓缩，引入包含1ml0.05mtris的管中，使用超声处理指在30℃下在0℃下超声处理2小时，然后使用磁体用无菌
表征：tem测量显示在这些悬浮液中存在磁小体链，长度为50nm至800nm，磁小体尺寸为5nm至60nm。涂层的厚度为1至5nm。这些包含1mg铁的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟后降低30％，这表明这些悬浮液的低沉降。对这些链的光散射测量表明存在三个链群，流体动力学尺寸(hs)为176nm的占5％，hs986nm的占81％，hs4363nm的占14％。它们的等电点为ph4.2，ζ电位从ph2下的20mv至ph12下的-38mv变化。chns分析显示这些链中碳的百分比为13.9％。通过lal试验测量的这些悬浮液的内毒素浓度估计为每毫克氧化铁18,000至150,000eu/ml的高值。使用nicoletft-ir380型光谱仪的傅立叶变换红外吸收测量也表明内毒素的存在。这些光谱表明在1250cm-1和1050cm-1处存在峰，这可归因于脂多糖和磷脂的磷酸酯基团的振动。在第一系列测量中，当将从amb-1提取的热原性磁小体链与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高20.5℃，从施加磁场前的36℃至施加磁场30分钟后的56.5℃。温度变化的初始斜率估计为0.043℃/秒。该温度升高大于对于bnf-淀粉所观察到的升高。在第二系列测量中，当该混合物经受在磁场存在下的处理条件2时，表1显示活细胞百分比低至10％，并且低于在没有磁场下的处理条件1期间获得的55％。这表明在条件1和2的处理存在下，这些热原性磁小体对gl261细胞诱导的细胞毒性，条件2(存在磁场)时的细胞毒性高于条件1(不存在磁场)时的细胞毒性。
对植入小鼠脑中的u87-luc肿瘤的抗肿瘤功效：对7组每组10只小鼠进行功效实验，其中u87-luc脑内肿瘤生长至体积在1和29mm3之间。在这些实验期间，小鼠按照有效程序喂食，并随意供以水。每天监测动物的一般状况，每两天称量小鼠，并且当观察到其体重减轻大于15％、疼痛迹象、异常姿势时，将其无痛致死。在注射u87-luc细胞后8天后，在肿瘤细胞注射部位(2.2.0)，不同的7组小鼠接受：2μl0.9％nacl溶液(第1和2组)；2μl磁赤铁矿为20mg/ml的磁小体悬浮液(第3、4和5组)；2μl磁赤铁矿为20mg/ml的bnf-淀粉悬浮液(第6和7组)。在注射u87-luc细胞后8天后，第1、2、3、4、5、6和7组的平均肿瘤体积分别为29、10、5、3、25、10和2mm3。第2、4、5和7组的小鼠每周3次暴露于平均强度为25mt并且频率为198khz的交变磁场，每次30分钟，持续5周。对第4组的小鼠进行组织学研究，以确定在施用磁小体链后150天后肿瘤是否完全消失。组织学研究的组织取自无痛致死的小鼠，提取大脑，用4％多聚甲醛溶液固定，切成2mm厚的横切片，包覆在3μm厚的石蜡块中，收集在载玻片上，然后用苏木精-曙红(h&e)染色以区分健康区域与肿瘤区域。最后，使用红外摄像机测量在不同的治疗期间的温度。
在通过单独施用纳米粒子(磁小体链和bnf)或通过多次施加交变磁场治疗的仅包含肿瘤的小鼠中，肿瘤体积在施用肿瘤细胞后小于40天内迅速增加至达到150mm3的平均体积。第1、2和6组的小鼠的平均存活时间估计为平均38天。这些结果表明，施加交变磁场和单独施用bnf-淀粉或磁小体链都不会对u87-luc肿瘤具有显著的抗肿瘤作用。
在通过施用磁小体链和多次施加磁场治疗的小鼠中，在施加磁场的前三个疗程期间观察到轻微的温度升高，对于第4和5组的小鼠，其类似并且为4℃(第一疗程)、2℃(第二疗程)和0.5℃(第三疗程)。在第4和5组的小鼠中，在施加磁场的接下来的疗程中，没有观察到温度升高。对于所有其它组，没有观察到温度升高。对于第5组的具有大肿瘤(约25mm3)的小鼠，观察到在施用磁小体链后7天内肿瘤体积显著减小64％。总体而言，在施用磁小体链后28天内，与第1、2、3和6组相比，第5组的肿瘤体积增加明显更少。另外，第5组的小鼠平均比第1、2和6组的小鼠的寿命长一周。对于第4组的40％的具有小肿瘤(约3mm3)的小鼠，在施用磁小体链后51天内平均肿瘤体积减小，直至肿瘤完全消失。这些小鼠完全愈合。实际上，这些小鼠在施用磁小体链后143天后仍然存活(j143)。这些小鼠的完全治愈通过对d143取得的其大脑组织切片的研究来证实，显示没有肿瘤和病变。对于用bnf-淀粉治疗的第7组的小鼠，平均肿瘤体积的增加和45天的时间与第1、2和6组的小鼠类似。没有观察到抗肿瘤作用。
可以得出以下结论：(i)对于40％的所治疗的u87-luc肿瘤的平均体积为3mm3的小鼠，有可能通过以下方式来完全破坏这些肿瘤：在这些肿瘤中施用从amb-1提取的热原性磁小体链的悬浮液，以悬浮液的磁赤铁矿计为40μg，以及将这些肿瘤暴露于平均强度为25mt并且频率为198khz的交变磁场的多次施加。
实施例3：从菌株msr-1提取的热原性磁小体链。
制备：msr-1细菌首先在铁和低浓度氧(0.5％o2)存在下，在琼脂凝胶上在30℃下培养5至7天。收集磁性菌落，并在包含碳、氮、矿物质、微量元素和酵母提取物源的无铁预培养培养基中，在空气存在下于30℃下培养数日。从预培养获得的趋磁细菌在类似于预培养培养基的培养基中，在50升发酵罐中于30℃下生长。在生长期间，通过加入包含铁源的酸性营养培养基将ph保持在6.8-7，并将压缩空气引入培养基中以促进细菌生长，同时保持氧浓度低于0.2％以允许合成磁小体。将从发酵产生的msr-1细菌浓缩至在565nm下测量的光密度(od565nm)为110-120。然后，将100ml该细菌浓缩物与400ml5mnaoh混合，并在60℃下加热1小时30分钟至2小时以使细菌裂解。然后，通过将钕磁体倚靠包含裂解细菌悬浮液的容器的壁放置过夜，并用1×pbs替换包含氢氧化钠和细菌碎片的上清液，将经处理的磁小体与细菌碎片分离。然后，将获得的悬浮液在10w下在1×pbs存在下超声处理20秒，倚靠钕磁体放置15分钟，移除上清液，并将经处理的磁小体再悬浮于1×pbs中。该超声处理和磁性分离序列重复四次。由此获得从msr-1菌株提取的热原性磁小体链。
表征：tem测量显示在这些悬浮液中存在磁小体链，长度为200nm至1500nm，磁小体尺寸为20nm至60nm。包含1mg铁的这些链的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟后降低86％，这表明这些悬浮液的低稳定性。对这些链进行的光散射测量表明存在两个流体动力学尺寸为535nm和2822nm的链群。它们的等电点为ph6.4，ζ电位从ph2下的15mv下降至ph12下的-31mv。chns分析显示，从第一次测量推算出的这些链中的碳百分比为4.1％，而经接下来的9次测量推算出的碳百分比平均为12.2％。在第二系列测量中，通过lal试验测量的这些悬浮液的内毒素浓度估计为2000至17000eu/ml/mg铁。使用nicoletft-ir380型光谱仪的傅立叶变换红外吸收测量也表明内毒素的存在。这些光谱表明在1150cm-1和1030cm-1处存在峰，这可归因于脂多糖和磷脂的磷酸酯基团的振动。在第一系列测量中，当将从msr-1提取的热原性磁小体链与gl-261细胞混合并经受处理条件3时，混合物的温度升高9.4℃，从施加磁场前的36.2℃至施加磁场30分钟后的45.6℃。第一次测量期间温度变化的初始斜率估计为0.012℃/秒，第二次测量期间为0.019℃/秒。该温度升高大于用bnf-淀粉所观察到的升高。当该混合物经受处理条件2时，表1显示，在第一次测量中活细胞百分比低至5％，在第二次测量中为12％，低于在第一次和第二次测量期间在没有磁场的处理条件1中获得的39％。这表明在处理条件1和2存在下，这些热原性磁小体对gl261细胞诱导的细胞毒性，条件2(存在磁场)时的细胞毒性高于条件1(不存在磁场)时的细胞毒性。
实施例4：衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将100μl包含在实施例3中获得的从msr-1菌株提取的热原性磁小体链的悬浮液与200ml包含1％tritonx-100和1％sds的溶液混合，将混合物在50℃下加热过夜，倚靠钕磁体放置，移除上清液，并代之以80mlph8的苯酚。将获得的悬浮液在超声处理下在60℃下加热2小时，在没有超声处理下在60℃下保持过夜，倚靠磁体放置，移除悬浮液的上清液，并代之以80ml氯仿。将包含氯仿的悬浮液倚靠钕磁体放置，移除上清液，并通过将这些磁小体在通风柜下加热2小时来移除吸附于经处理的磁小体表面的残留氯仿。最后，通过加入在超声处理浴中在60℃下加热1小时的80ml1mnaoh，将获得的磁小体的中心部分从包含它们的管的玻璃壁解吸。将包含磁小体的中心部分的悬浮液倚靠钕磁体放置，移除上清液，并代之以无菌milliq水，将悬浮液在10w下超声处理20秒。该洗涤序列重复四次。将包含磁小体的中心部分的悬浮液用氮气脱气以避免氧化，通过高压灭菌进行灭菌，并储存于-80℃下。
表征：tem测量显示不存在围绕磁小体的中心部分的涂层。包含1mg磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟后降低60％至80％，这表明这些悬浮液的低稳定性。这些悬浮液的内毒素浓度估计为每毫升每毫克氧化铁10-100eu，这表明这种悬浮液的热原性。这些悬浮液的等电点测量为酸性ph3.5。此外，在ph4和ph6之间，观察到ζ电位从-8mv增加至-1.5mv，并且在ph6和ph8之间，观察到ζ电位从-1.5mv下降至-27mv，这似乎是聚集体存在的特征。使用zetasizer的光散射测量显示存在79％的流体动力学球形尺寸为3076nm的聚集体和21％的流体动力学球形尺寸为677nm的聚集体。这些悬浮液的chns分析显示，碳浓度为3.3％，氮浓度为0.2％。这些浓度低于对于从msr-1提取的热原性磁小体链(％n＝0.7和％c＝4.1)和冻干的全msr-1细菌(％n＝11和％c＝49)测得的浓度。这些结果表明，包含磁小体中心部分的样品中围绕磁小体中心部分的有机材料的量比包含全msr-1细菌或从msr-1提取的热原性磁小体链的样品显著更低。胺测定表明，在包含1mg铁的中心部分悬浮液中，在中心部分的表面中或表面处存在260ng至1.2μg胺官能团。磷酸酯测定表明，在包含1mg铁的中心部分悬浮液中，在中心部分的表面中或表面处存在10μg磷酸酯官能团。在第二系列测量中，当磁小体的中心部分与gl-261细胞混合并经受处理条件3时，混合物的温度在施加磁场30分钟后升高9.8℃。温度变化的初始斜率估计为0.012℃/秒。当该混合物经受处理条件2时，表1显示活细胞百分比低至0-9％，低于在没有磁场的处理条件1中获得的77％。
实施例5：衍生自amb-1的磁小体的中心部分。
制备：根据实施例3中所述的方法进行amb-1趋磁细菌的培养。培养7天后，使用切向过滤(500kda柱，800rpm)在25℃下将细菌浓缩在1升体积中。然后，将它们在包含1mmedta和30μg/ml鱼精蛋白的溶液中在ph＝7.4下搅拌混合，通过切向过滤将液体培养基与细菌分离，然后将获得的细菌与ph＝7.4的pbs溶液混合，再次通过切向过滤将液体培养基与细菌分离。然后，将获得的细菌悬浮液在pbs中稀释至在565nm下测量的允许细菌裂解的光密度。将获得的悬浮液使用直径为13mm的钛超声处理探针在0℃下，在70w下超声处理30分钟。通过以下方式对由此获得的悬浮液进行第一次洗涤：倚靠包含悬浮液的容器的壁放置磁体，移除上清液，代之以6℃的包含10mmhepes和200mmnacl的溶液，并通过3个脉冲系列在30w下超声处理两秒。使用类似的方法，用无菌无热原性水代替hepes和nacl的混合物再洗涤4次。在洗涤结束时，通过tem证实获得了包含磁小体链的悬浮液。通过使用磁体将磁小体链与上清液分离，用30ml体积的tri试剂(sigma，参考编号：t9424)替换上清液，将所得溶液在超声加热浴中在50℃下超声处理2小时。然后，将获得的悬浮液在4℃下倚靠磁体放置1小时，移除上清液，并代之以乙酸钠溶液，并将混合物用超声加热浴在37℃下超声处理30分钟。然后，通过以下方式对经处理的磁小体进行第一次洗涤：用磁体分离上清液，移除上清液，代之以乙酸钠溶液，然后将悬浮液在超声加热浴中在37℃下超声处理30分钟。该洗涤步骤以相同的方式重复三次。特别地，为了移除脂质双层，将悬浮液倚靠磁体放置，移除上清液，并代之以包含1％tritonx114、1％脱氧胆酸盐和4mmedta的溶液。然后，将悬浮液在4℃下机械搅拌1小时，倚靠磁体放置，移除上清液，并代之以包含1％tritonx114、1％脱氧胆酸盐和4mmedta的溶液。将混合物在37℃下搅拌1小时。然后，通过以下方式对悬浮液进行第一次洗涤：倚靠包含悬浮液的容器的壁放置磁体，移除上清液，代之以甲醇/磷酸盐缓冲液(v/v，1/1)混合物。然后，通过以下方式对获得的悬浮液进行洗涤：倚靠磁体放置，移除上清液，代之以包含甲醇和磷酸盐缓冲液的混合物，然后将获得的悬浮液使用超声处理指在30w下超声处理5分钟。以相同的方式进行第二次洗涤。通过以下方式再次洗涤悬浮液：将悬浮液倚靠磁体放置，移除上清液，代之以无菌无热原性水，并用超声处理浴在37℃下超声处理1小时。以相同的方式进行5次额外的水洗涤。然后，将获得的悬浮液通过在121℃下高压灭菌进行灭菌，以获得包含衍生自amb-1的磁小体中心部分的悬浮液。
表征：tem显示不存在围绕磁小体的中心部分的涂层。这些悬浮液的chns分析表明碳百分比为4.9％，明显低于整个细菌(32％)和热原性磁小体链(13.9％)的碳百分比。这些中心部分中的内毒素水平为20-100eu/mg/ml。包含1mg磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟后降低80％至90％，这表明这些悬浮液的低稳定性。这些悬浮液的ζ电位全部从ph2下的38mv下降至ph12下的-60mv。这些悬浮液的等电点测量为酸性ph4.9。在第二系列测量中，当磁小体的中心部分与gl-261细胞混合并经受处理条件3时，混合物的温度在施加磁场30分钟后升高23.8℃。温度变化的初始斜率估计为0.024℃/秒。当该混合物经受处理条件2和1时，活细胞百分比分别为48％和30％。
实施例6：涂覆有聚-l-赖氨酸的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将实施例4中所述的衍生自msr-1的磁小体的中心部分在无菌条件下在层流通风柜下用聚-l-赖氨酸涂覆。分子量为21000g/mol的聚(l-赖氨酸氢溴酸盐)溶液(gmac,cas:25988-63-0)包含40mg/ml聚(l-赖氨酸氢溴酸盐)，其在无热原性水中制备并用0.45μm的pes(聚醚砜)过滤器过滤，储存于-80℃下。在涂覆序列期间，使用的聚-l-赖氨酸的质量是磁小体的中心部分的质量的7倍。将25ml铁浓度为3mg/ml的包含磁小体的中心部分的悬浮液引入玻璃管中，将管倚靠1.3tndfeb磁体放置，移除上清液，然后，将25ml聚(l-赖氨酸氢溴酸盐)的悬浮液以20mg/ml的最终浓度引入管中。然后，将获得的悬浮液在4℃超声处理6分钟，在10℃使用超声处理指。将管在轮上以每分钟13转的速度在25℃搅拌24小时(在4℃至8℃之间的温度下)，将悬浮液使用超声处理指在10w下超声处理10秒。为进行第一次洗涤，然后将管倚靠相同的磁体放置，移除上清液，并代之以无菌milliq水。将悬浮液以这种方式洗涤1至4次。最后，将获得的悬浮液在低于4℃的温度下在冰中在24w下超声处理2分钟，以避免加热，并用过滤的koh将ph调节至6.8-7.2。由此获得包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液。
表征：包含1mg涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟后降低大约50％，这表明与包含未涂覆的磁小体的中心部分的悬浮液相比，该悬浮液的稳定性更高。tem图像显示在这些磁小体的中心部分周围存在聚-l-赖氨酸涂层，其厚度为4至16nm，平均厚度为8nm，并且显示以链布置于这些合成纳米粒子的一部分中。对这些悬浮液进行的lal测定显示78eu/毫升/mg铁的低内毒素浓度(回收率为119％)。使用zetasizer进行的光散射测量显示存在92％的流体动力学球形尺寸为2489nm的聚集体和8％的流体动力学直径为137nm的球形物体，其可对应于涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的流体动力学直径。chns分析显示，包含10mg涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的样品包含0.4％的氮、3.6％的碳、0.6％的氢、0.03％的硫。包含10mg冻干聚-l-赖氨酸的样品包含13％的氮、33％的碳、3.2％的氢、0.03％的硫。这些结果表明，与包含全细菌或从msr-1提取的热原性磁小体链的那些悬浮液相比，包含涂覆有或未涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液中的碳浓度更低。这表明，与包含全细菌或从msr-1提取的热原性磁小体链的那些悬浮液相比，包含涂覆或未涂覆的磁小体中心部分的悬浮液中存在的有机材料更少。在磁小体中心部分的周围存在聚-l-赖氨酸涂层由与包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的样品(％c＝3.6％)相比，包含未涂覆的磁小体的中心部分的样品中碳的百分比更低(％c＝3.3％)来表明。当将1.5mg包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液与100μl1％琼脂混合并使获得的混合物经受平均强度为32mt并且频率为198khz的交变磁场施加时，混合物在175秒后达到43℃的加热温度。使与100μl1％琼脂混合的、包含1.5mg化学纳米粒子(micromodbnf-淀粉，参考编号为10-00-102和micromodm-pei，参考编号为17-00-152)的凝胶经受相同的交变磁场。它们在600秒后达到43℃的温度，与包含化学纳米粒子bnf-淀粉和m-pei的悬浮液相比，包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液显示出更好的加热性质。当将涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分与gl-261细胞混合并使混合物经受条件3时，混合物的温度升高11.5℃，从施加磁场前的37℃至施加磁场30分钟后的48.5℃。温度变化的初始斜率估计为0.024℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为53％，而不施加磁场(处理条件1)时仅为23％。这表明在磁场存在下，包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液对gl261细胞诱导的细胞毒性。
细胞毒性：根据iso10993-5的mts(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2h-四唑鎓)细胞毒性试验由认可的机构在无菌条件下，使用包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体中心部分的悬浮液(以0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.5mg/ml和1mg/ml的铁浓度包含在emem10培养基中)，对l929小鼠成纤维细胞进行。首先，将这些悬浮液与l929细胞在37℃下在5％co2存在下孵育24至26小时。孵育后，向细胞中加入20μl包含mts和吩嗪硫酸甲酯(pms)试剂的染色溶液。然后，将细胞在37℃下在5％co2存在下再次孵育120至135分钟。导致在492nm下的吸收的染色能够证明细胞的活力。在显微镜下观察细胞使得有可能确认细胞的活力或认定细胞没有活力。获得的结果显示，对于以0.5mg/ml、0.1mg/ml和0.01mg/ml的铁浓度包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液，活细胞百分比为100％、92％和89％，这表明在这些浓度下这些悬浮液不存在细胞毒性。浓度为1mg/ml时，不可作出结论。
热原性：为了证实由lal试验结果表明的包含聚-l-赖氨酸涂覆磁小体的中心部分的悬浮液不存在热原性，由认可的机构根据iso10993-11对兔进行热原性试验。为此，将以5mg/ml的铁浓度包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液在超声浴中放置2分钟，将1ml该悬浮液稀释在119ml0.9％nacl中。使悬浮液的温度在37℃下保持30分钟，将悬浮液匀化，并以10ml/kg的剂量静脉内施用于三只兔子。每30分钟测量三只兔子的体温，持续3小时。其升高0.02℃(第一只兔子)、0℃(第二只兔子)和0.22℃(第三只兔子)。三只兔子显示的温度升高均不大于0.5℃，并且三只兔子的温度升高总和为0.24℃，小于2.65℃。因此，根据欧洲和美国药典的标准，所试验的产品不是热原性的。
急性毒性：急性全身毒性试验在6周龄的c57bl/6雌性小鼠中，通过在小鼠尾部施用100μl以0mg、0.5mg、1mg、2mg、4mg和8mg的铁浓度包含聚-l-赖氨酸涂覆磁小体的中心部分的悬浮液来进行。注射后12天每天测量的每只小鼠的体重保持稳定，表明小鼠耐受的最大剂量大于8mg，即约400mg/kg。
对小鼠皮下植入的gl261肿瘤的抗肿瘤功效：
使用1ml25g注射器，将包含2×106个鼠科胶质母细胞瘤gl261细胞的50μl体积皮下施用于雌性黑色6c57bl/j小鼠的爪和背部之间的左胁腹。肿瘤生长10至15天，直至其达到约40至150mm3的尺寸。当肿瘤达到这个尺寸时，将小鼠用异氟烷气麻醉，并通过热板保持在37℃。使用hamilton250μl注射器，在肿瘤的中心施用50μl两种不同的无热原性悬浮液，所述悬浮液包含：(1)5％葡萄糖，(2)涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分，铁浓度为50mg/ml，混合有5％葡萄糖。悬浮液2以等于20.t的量(以μg铁计)施用，其中t是所治疗肿瘤的尺寸(mm3)。然后，将小鼠暴露(或不暴露)于频率为198khz并且平均强度为9mt至28mt的交变磁场30分钟，以使肿瘤内温度在前三个磁场疗程期间保持在43℃至46℃之间的值。在接下来的磁场施加疗程期间，交变磁场的平均强度固定在28mt。使用热电偶来测量肿瘤内温度。磁场施加疗程每周重复3次，总共15次。在两次加热疗程后肿瘤继续增大的小鼠经历第二次悬浮液(2)施用。用卡尺测量肿瘤尺寸，并使用公式v肿瘤＝0.5(l.l2)估计肿瘤体积，其中l和l分别表示肿瘤的长度和宽度。当肿瘤体积超过1000mm3和/或当小鼠的体重从一次测量到另一次降低大于20％时，将小鼠无痛致死。根据该方案，存活和肿瘤体积监测曲线在施用纳米粒子悬浮液后71天内进行。
观察到，用涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分和数次施加磁场治疗的10只小鼠中有5只小鼠在开始加热疗程后15天完全治愈。在这些小鼠中，没有肿瘤或其后遗症的可见痕迹(痂皮或瘢痕)。用涂覆的磁小体的中心部分和施加磁场治疗的未完全治愈的剩余的5只小鼠在治疗开始后约30天后被无痛致死。在不施加磁场下用涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分治疗的小鼠在治疗开始后约12天后全部被无痛致死。对于用包含涂覆的磁小体的中心部分的悬浮液和施加交变磁场治疗的小鼠，在治疗开始后50天后的存活率为60％，并且对于在不施加磁场下用包含涂覆的中心部分的悬浮液治疗的小鼠，存活率为0％。在不施加磁场下，所有小鼠在治疗开始后不到20天时死亡。
对植入小鼠脑中的u87肿瘤的抗肿瘤功效：
用于施用肿瘤细胞和监测小鼠的方案与实施例3中所述的相同。在小鼠脑中施用u87-luc肿瘤细胞的6天后，当肿瘤达到0.8至2mm3之间的尺寸时，在麻醉小鼠的脑坐标(0.2.2)处施用2μl两种不同的悬浮液。对于每组包含9只小鼠的第1和2组，小鼠接受混合有5％葡萄糖的以250mg/ml的铁浓度包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液。对于每组包含9只小鼠的第3和4组，给予小鼠包含5％葡萄糖的悬浮液。第1和3组的小鼠不暴露于磁场。第2和4组每周暴露于平均强度为25mt并且频率为198khz的交变磁场3次，每次30分钟，持续6周。对于第2组，4只具有肿瘤再生长的小鼠在植入u87-luc细胞的8周后接受另外的治疗，在于第二次施用2μl混合有5％葡萄糖的以147mg/ml的铁浓度包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液以及每周施加平均强度为25mt并且频率为198khz的交变磁场3次，持续3周。在不同的治疗期间使用红外摄像机测量温度变化。
在通过施用包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液和多次施加交变磁场治疗的小鼠中，对于第2组的小鼠，在前十六个磁场施加疗程期间观察到温度升高，平均为8℃(前3个疗程)、5℃(接下来的12个疗程)和1℃(第16个疗程)。对于第2组的小鼠，在接下来的磁场施加疗程中没有观察到温度升高。对于在第16个加热疗程后由于肿瘤完全消失而进一步治疗的第2组的四只小鼠，在9个另外的磁场施加疗程期间观察到5.5℃的温度升高。对于第1、3和4组，没有观察到温度升高。
在第3和4组的小鼠中，肿瘤体积在施用肿瘤细胞后小于45天内迅速增大而达到200mm3的平均体积。在施用肿瘤细胞后，第3和4组的小鼠的平均存活时间估计为平均40天，表明仅施加交变磁场没有抗肿瘤作用。对于第1组的小鼠，肿瘤体积平均每周增大5mm3，远小于第3和4组。另外，在植入u87-luc细胞后13周后，50％的第1组的小鼠存活，平均肿瘤体积为56mm3。与第3和4组的小鼠相比，通过单独施用包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液对第1组的小鼠的治疗能够减缓肿瘤生长和改善存活。在施用包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液后85天期间，平均肿瘤体积减小，直至对于66％的小鼠在施用这些悬浮液后42天观察到肿瘤完全消失(j42)。对于由于肿瘤不消失而接受第二次治疗的第2组的4只小鼠，在第二次治疗开始后20天后肿瘤完全消失。总体来说，在施用u87-luc细胞的91天后，第2组的所有小鼠仍然存活并且不显示生物发光信号，表明治愈。
可以得出以下结论：(i)当在u87-luc肿瘤中施用包含涂覆有聚-l-赖氨酸的磁小体的中心部分的悬浮液时，肿瘤生长减缓，这可以由高浓度的聚-l-赖氨酸或存在聚-l-赖氨酸来解释，(ii)当在u87-luc肿瘤中施用这些相同的悬浮液并多次施加频率为198khz并且平均强度为25mt的交变磁场时，可以完全消除这些肿瘤。
实施例7：涂覆有壳聚糖的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将混合有无菌无热原性水的包含1mg磁小体的中心部分的悬浮液用超声处理指以5w的功率以0.1秒的脉冲，以0.1秒脉冲间隔超声处理5分钟。将0.25mg壳聚糖(壳聚糖盐酸盐crs，参考编号：sigmay0000104)与包含1mg磁小体中心部分的悬浮液混合，并用1mnaoh将悬浮液的ph调节至6.2。将获得的混合物用超声处理指以5w的功率以0.1秒的脉冲以0.1秒脉冲间隔，在45℃下超声处理60分钟，然后在60℃下超声处理15分钟，然后在70℃下超声处理15分钟。通过以下方式对获得的悬浮液进行第一次洗涤：倚靠包含悬浮液的玻璃管的壁放置钕磁体，移除上清液，并代之以无菌无热原性水。以相同的方式进行第二次洗涤。
表征：涂覆有壳聚糖的这些磁小体的内毒素水平为25eu/mg/ml。包含1mg涂覆有壳聚糖的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟测量期间降低3％，这表明该悬浮液的稳定性。对涂覆有壳聚糖的磁小体的中心部分进行的tem测量表明这些合成纳米粒子以链布置，存在聚集体以及围绕磁小体的中心部分的涂层的平均厚度为6nm。当将包含涂覆有壳聚糖的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高8.5℃。在第一系列测量期间，温度变化的初始斜率估计为0.009℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为0-5％，而不存在磁场(处理条件1)下为20％。这表明在处理条件2中，涂覆有壳聚糖的磁小体的中心部分对肿瘤细胞具有破坏效力。这些磁小体的等电点估计为ph11。ζ电位在ph2下的46mv至ph12下的-55mv之间变化。估计这些磁小体中，7％的磁小体的流体动力学尺寸为273nm，并且93％的磁小体的流体动力学尺寸为1908nm。chns分析表明，它们的碳百分比为3.2％，接近对于未涂覆磁小体测量的3.3％碳百分比。
实施例8：涂覆有羧甲基葡聚糖的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将混合有无菌无热原性水的包含1mg磁小体的中心部分的悬浮液用超声处理指以5w的功率以0.1秒的脉冲，以0.1秒脉冲间隔超声处理5分钟。将4mg羧甲基葡聚糖(参考编号：sigma86524-10g-f)与1mg磁小体的中心部分混合，并用1m盐酸将混合物的ph调节至3.5。将所得混合物在45℃下使用超声处理指以5w的功率以0.1秒的脉冲，以0.1秒脉冲间隔超声处理60分钟。将获得的悬浮液洗涤三次。对于第一次洗涤，将磁体倚靠管壁放置，移除上清液，并代之以无菌无热原性水。将获得的悬浮液以相同的方式洗涤第二次，然后洗涤第三次。
表征：在第一系列测量中，包含1mg涂覆有羧甲基葡聚糖的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟测量期间不会降低，这表明该悬浮液的稳定性。tem测量使得能够估计围绕磁小体的中心部分的涂层的厚度为2至20nm。包含涂覆有羧甲基葡聚糖的磁小体的中心部分的悬浮液的光散射测量表明存在79％的流体动力学直径为1359nm的球形物体(群1)、6％的流体动力学直径为5124nm的球形物体(群2)和15％的流体动力学直径为331nm的球形物体(群3)。群3的尺寸可以对应于涂覆有羧甲基葡聚糖的磁小体的中心部分的尺寸。等电点估计为ph＝3.4，并且ζ电位从ph＝2下的20mv下降至ph＝12下的-31mv。当将包含涂覆有羧甲基葡聚糖的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高29℃。温度变化的初始斜率估计为0.023℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为11％，而不存在磁场(处理条件1)下为63％。这表明使用处理条件2，涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分对肿瘤细胞具有破坏效力。在这些磁小体中，用chns测量的碳百分比为3.7％。
实施例9：涂覆有柠檬酸的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将混合有4.5ml无菌无热原性水的包含50mg磁小体的中心部分的悬浮液用超声处理指以5w的功率以0.1秒的脉冲，以0.1秒脉冲间隔超声处理5分钟。将包含在1.8ml体积中的20mg该悬浮液与包含在8ml无菌无热原性水中的35mg柠檬酸一水合物(参考编号：sigma33114-500g)混合。在该制备中，铁的质量是柠檬酸的质量的1.75倍。用1m氢氧化钠将悬浮液的ph调节至6，将获得的混合物在90℃下超声处理1小时。通过以下方式对获得的悬浮液进行第一次洗涤：倚靠玻璃管的壁放置钕磁体，移除上清液，并补充以无菌无热原性水。以相同的方式进行第二次洗涤。
表征：包含1mg涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟内降低大约15％，这表明该悬浮液的稳定性。这些合成纳米粒子的tem图像表明存在许多链、这些合成纳米粒子的良好分散、低聚集和在这些磁小体的中心部分周围存在厚度为1至15nm的涂层。对这些悬浮液进行的lal试验显示19eu/毫升/mg铁的低内毒素浓度(回收率为188％)。对这些冻干悬浮液进行的chns分析表明，氮百分比为0.8％，碳百分比为3.7％，氢百分比为0.3％，并且不含硫。仅包含冻干柠檬酸的样品包含0％百分比的氮、36％的碳、4.7％的氢，并且不含硫。这些结果表明，与包含全细菌或从msr-1提取的热原性磁小体链的那些悬浮液相比，包含涂覆有或未涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分的悬浮液中的碳百分比更低。这也可表明，与包含全细菌或从msr-1提取的热原性磁小体链的那些悬浮液相比，包含涂覆有或未涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分的悬浮液中存在更少的有机材料。在涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分的周围存在涂层由与包含涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分的冻干悬浮液(％c＝3.7％)相比，包含磁小体的中心部分的冻干悬浮液中碳的百分比更低(％c＝3.3％)来表明。当将包含涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高25℃，从施加磁场前的35℃至施加磁场后的60℃。温度变化的初始斜率估计为0.038℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为26％，而不存在磁场(处理条件1)下为57％。这表明在处理条件2中，涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分对肿瘤细胞具有破坏效力。这些悬浮液的光散射测量表明存在可对应于链的流体动力学尺寸为788nm的非球形物体。等电点估计为ph＝3.7，并且ζ电位从ph＝2下的25mv下降至ph＝12下的-38mv。
实施例10：根据第一方案制备的涂覆有油酸的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：向5ml以1mg/ml的铁浓度包含5mg磁小体的中心部分的悬浮液中加入10μl氨nh4oh溶液(分子量为25％)，以获得10至11的ph。将获得的悬浮液在80℃的水浴中用超声处理指以6-7w的功率以0.2秒的脉冲，以0.5秒脉冲间隔超声处理15分钟。然后，加入267μl的211mm油酸溶液(条件1)或50μl的32mm(0.4mg)油酸溶液(条件2)。然后，将混合物用超声处理指以6-7w的功率以0.2秒的脉冲，以0.5秒脉冲间隔超声处理1小时。然后，将获得的悬浮液用倚靠包含悬浮液的玻璃管放置的钕磁体洗涤，移除上清液并补充以无菌无热原性水。将悬浮液以相同的方式洗涤第二次，然后洗涤第三次和第四次。最后一次洗涤后，取出等分试样以进行各种表征试验。将悬浮液保持在4℃直至使用。
表征：包含涂覆有油酸的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟内不会降低，表明其稳定性。根据条件2制备的涂覆有油酸的磁小体的中心部分的tem图像显示存在纳米粒子聚集体和厚度为0.5至5nm的围绕磁小体的中心部分的涂层。对根据条件2合成的这些涂覆的磁小体进行的光散射测量表明存在流体动力学直径为123nm的非聚集的、稳定的球形物体，其可以对应于这些涂覆的磁小体的流体动力学直径。等电点估计为ph＝3.5，并且ζ电位显示存在两个群，其中一个群的ζ电位从ph＝2下的30mv下降至ph＝12下的-60mv，另一个群的ζ电位从ph＝6下的-10mv下降至ph＝12下的-35mv。当将包含涂覆有油酸的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高28℃。温度变化的初始斜率估计为0.051℃/秒。
实施例11：根据第二方案制备的涂覆有油酸的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：中心部分可以下列方式涂覆以油酸。在ph11下，向1ml以1mg/ml的铁浓度包含10mg磁小体的中心部分的悬浮液中加入100mg的10mg/ml油酸溶液。将获得的悬浮液用超声处理指以20w的功率在环境温度下连续超声处理5分钟。然后，将悬浮液在-80℃下冷冻30分钟，然后在80℃下加热5分钟。然后，将混合物用超声处理指以10w的功率以3秒的脉冲，以3秒脉冲间隔超声处理1.5小时。然后，将获得的悬浮液用倚靠包含悬浮液的玻璃管放置的钕磁体洗涤，移除上清液并代之以无菌无热原性水。将悬浮液以相同的方式洗涤第二次和第三次。最后一次洗涤后，取出等分试样以进行各种表征试验。将悬浮液保持在4℃直至使用。
表征：涂覆有油酸的磁小体的中心部分的性质如下。包含1mg铁的涂覆有油酸的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟内不会降低，表明其稳定性。当将包含涂覆有油酸的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高5℃。温度变化的初始斜率估计为0.012℃/秒。当该混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为14％，而不存在磁场(处理条件1)下为53％。这些磁小体中的碳百分比为3.4％。
实施例12：涂覆有叶酸的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将混合有4.5ml无菌无热原性水的包含以铁计50mg的磁小体中心部分的悬浮液使用超声处理指以30w的功率以30秒的脉冲，以10秒脉冲间隔超声处理5分钟。将1.8ml体积的包含以铁计20mg的磁小体中心部分引入10ml倚靠磁体放置的无菌玻璃管中，移除上清液，并代之以8ml2mg/ml的叶酸溶液(fisherbioreagents，参考编号：59-30-3)，所述叶酸溶液与无菌无热原性水混合，预先用1m氢氧化钠溶液调节至ph9.5，并通过过滤(0.45μm过滤器)灭菌。在该制备中，铁的质量是叶酸的质量的1.25倍。将获得的混合物用超声处理指以30w的功率以30秒的脉冲，以10秒脉冲间隔超声处理1.5小时。将8ml体积的获得的悬浮液包含在10ml玻璃管中。通过以下方式将其洗涤一次：倚靠玻璃管的壁放置钕磁体，移除上清液，然后代之以pyclerotichyclone水，并以30w超声处理1分钟。以相同的方式再洗涤四次。
表征：包含1mg涂覆有叶酸的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟内不会降低，这表明该悬浮液的稳定性。该悬浮液的扩散测量显示存在90％的流体动力学直径为2876nm的球形聚集体和10％的流体动力学直径为235nm的球形物体，其可对应于涂覆有叶酸的磁小体。该悬浮液的等电点估计为ph7.9，并且ζ电位从ph2下的45mv下降至ph12的-43mv。围绕这些磁小体的中心部分的涂层的厚度被测量为1至4nm。当将包含涂覆有柠檬酸的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高20℃。温度变化的初始斜率估计为0.042℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为9％，而不存在磁场(处理条件1)下为93％。这表明在处理条件2中，涂覆有叶酸的磁小体的中心部分对肿瘤细胞具有破坏效力。这些磁小体中的碳百分比估计为3.9％。
实施例13：涂覆有dopc的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将40mgdopc(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，参考编号：sigmap6354)溶解在10ml玻璃管中的100μl氯仿中，然后使用惰性气体(氮气)将溶剂蒸发10分钟以在管中形成均匀的脂质膜。将与8ml无菌无热原性水混合的以20mg铁包含磁小体的中心部分的悬浮液引入包含所述脂质膜的管中，然后用超声处理指以30w的功率以10秒的脉冲，以0.5秒脉冲间隔超声处理1.5小时。在该制备期间，dopc的质量是铁的质量的两倍。通过以下方式对获得的悬浮液进行第一次洗涤：倚靠玻璃管壁放置钕磁体，移除上清液，然后代之以无菌无热原性水，并以30w超声处理1分钟。以相同的方式再洗涤五次。
表征：在第一系列测量中，包含涂覆有dopc的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟测量期间不会降低，这表明该悬浮液的稳定性。tem图像显示存在厚度为0.6至3nm的围绕这些磁小体的中心部分的涂层。对这些悬浮液进行的光散射测量显示存在87％的流体动力学直径为1871nm的球形聚集体和13％的流体动力学直径为278nm的球形物体，其可对应于涂覆有dopc的磁小体的中心部分的尺寸。等电点测量为ph3，并且ζ电位从ph2下的10mv下降至ph12下的-35mv。当将包含涂覆有dopc的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高33.5℃。温度变化的初始斜率估计为0.05℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为0-5％，而不施加磁场(处理条件1)时为13％。这表明在交变磁场存在下，涂覆有dopc的磁小体的中心部分对gl261细胞诱导的细胞毒性。这些磁小体中的碳百分比估计为7.5％。
实施例14：涂覆有dopc的衍生自amb-1的磁小体的中心部分。
制备：在35ml圆锥形玻璃管中，将280mgdopc(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，参考编号：sigmap6354)溶解在500μl氯仿中，然后用氮气将溶剂蒸发15分钟以在管中形成均匀的脂质膜。将混合有15ml无菌无热原性水的以10mg铁包含磁小体的中心部分的悬浮液引入包含所述脂质膜的管中，然后用超声处理指以20w的功率以10秒的脉冲，以20秒脉冲间隔超声处理30分钟。在该制备期间，dopc的质量是铁的质量的28倍。使用sephadexg-25尺寸排阻柱(gehealthcare,buckinghamshire,uk)纯化所得悬浮液。收集棕色悬浮液，然后通过以下方式对其进行浓缩：倚靠玻璃管壁放置钕磁体，移除一部分上清液，将其替换为无菌无热原性水，并将样品以30w超声处理1分钟。
表征：这些悬浮液的tem图像使得能够估计涂层的厚度为50至150nm。
实施例15：涂覆有阿屈膦酸盐的衍生自amb-1的磁小体的中心部分。
制备：将包含10mg铁的2ml体积引入25ml玻璃管(无热原性的)中，然后倚靠磁体放置。移除上清液，然后代之以以10ml包含11.6mg/ml阿屈膦酸盐的溶液，所述阿屈膦酸盐溶液混合有无菌milliq水，预先用0.1m盐酸溶液调节至ph2.5，并通过过滤(0.45μm过滤器)灭菌。在该制备期间，阿屈膦酸盐的质量是铁的质量的11.6倍。将获得的混合物在超声处理指下以30w的功率连续超声处理15分钟。然后，将悬浮液在70w的微波下加热1分钟，加热三次，每次间隔5分钟，其中将样品在冰浴中冷却。通过以下方式对悬浮液进行第一次洗涤：倚靠玻璃管壁放置钕磁体，移除上清液，然后代之以以无菌milliq水，并以30w超声处理1分钟。以相同的方式通过以下方式洗涤十次：倚靠玻璃管壁放置钕磁体，移除上清液，然后代之以无菌milliq水，并以30w超声处理1分钟。
表征：lal试验的测量使得能够估计这些悬浮液中的内毒素量为53至144eu/mg/ml。包含1mg铁的涂覆有阿屈膦酸盐的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟测量期间降低1％，这表明该悬浮液的稳定性。tem测量表明基质围绕着这些磁小体。这些磁小体具有ph3.5的等电点，其中14％的磁小体的流体动力学尺寸为527nm，其中86％的磁小体的流体动力学尺寸为2735nm，ζ电位从ph2下的25mv至ph12下的-47mv变化。当将包含涂覆有阿屈膦酸盐的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并使混合物经受处理条件3时，混合物的温度升高18.3℃。温度变化的初始斜率估计为0.28℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为2％，而不施加磁场(处理条件1)时为17％。这表明在交变磁场存在下，涂覆有阿屈膦酸盐的磁小体的中心部分对gl261细胞诱导的细胞毒性。这些磁小体中的碳百分比估计为9％。
实施例16：涂覆有奈立膦酸盐的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将混合有4.5ml无菌无热原性水的包含50mg铁的磁小体的中心部分的悬浮液用超声处理指以30w的功率以30秒的脉冲，以10秒脉冲间隔超声处理5分钟。将1.8ml体积的包含20mg铁的获得的悬浮液引入倚靠磁体放置的10ml玻璃管中，移除悬浮液的上清液，并代之以8ml包含20mg/ml奈立膦酸盐的溶液，所述奈立膦酸盐溶液混合有无菌无热原性水并调节至ph2.5。在该制备中，奈立膦酸盐的质量是铁的质量的8倍。将获得的混合物使用超声处理指以30w的功率以30秒的脉冲，以10秒脉冲间隔超声处理2小时。通过以下方式对悬浮液进行第一次洗涤：倚靠玻璃管的壁放置钕磁体，移除上清液，然后代之以预先调节至ph11的无菌无热原性水。以相同的方式再洗涤五次。
表征：包含涂覆有奈立膦酸盐的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟内不会降低，这表明该悬浮液的稳定性。tem测量显示在磁小体的中心部分周围存在厚度为19至200nm的涂层。对这些悬浮液进行的光散射测量表明存在1％的流体动力学直径为5560nm的球形聚集体、59％的流体动力学直径为710nm的球形聚集体和40％的流体动力学直径为207nm的球形物体，其可对应于涂覆有奈立膦酸盐的磁小体的中心部分。当将包含涂覆有奈立膦酸盐的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并经受处理条件3时，混合物的温度从施加磁场前的37.2℃升高至施加磁场30分钟后的43.9℃。温度变化的初始斜率估计为0.017℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为28％，而不施加磁场(处理条件1)时为44％。这表明在处理条件2存在下，涂覆有奈立膦酸盐的磁小体的中心部分对gl261细胞诱导的细胞毒性。这些涂覆有奈立膦酸盐的合成纳米粒子的等电点估计为ph3.5，并且ζ电位从ph2下的40mv下降至ph12下的-42mv。这些磁小体的碳百分比估计为18.1％。
实施例17：涂覆有pei的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将混合有4.5ml无菌无热原性水的包含50mg铁的磁小体材料悬浮液用超声处理指以30w的功率以30秒的脉冲，以10秒脉冲间隔超声处理5分钟。将1.8ml体积的包含20mg铁的该悬浮液引入倚靠磁体放置的10ml玻璃管中。移除上清液，并代之以8ml浓度为25mg/ml的pei溶液，所述pei溶液混合有无菌无热原性水并调节至ph9.5。在该制备中，pei的质量是铁的质量的10倍。将获得的混合物用超声处理指以30w的功率以30秒的脉冲，以10秒脉冲间隔超声处理2小时。通过以下方式对获得的悬浮液进行第一次洗涤：倚靠玻璃管壁放置钕磁体，移除上清液，代之以无菌无热原性水，并以30w超声处理1分钟。以相同的方式再洗涤五次。
表征：包含涂覆有pei的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟测量期间不会降低，这表明该悬浮液的稳定性。tem测量表明涂层厚度为8至10nm。该悬浮液的光散射测量表明存在流体动力学直径为175nm的球形物体，其可对应于涂覆有pei的磁小体的中心部分。等电点估计为11，并且ζ电位从ph2下的42mv下降至ph12下的-16mv。chns测量显示，氮百分比为1.1％，碳百分比为4.5％，两者均大于未涂覆的磁小体的中心部分中的氮百分比和碳百分比，后者分别为0.2％和3.3％，表明涂层的存在。在第二系列测量中，当将包含涂覆有pei的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并经受处理条件3时，混合物的温度从施加磁场前的37℃升高至施加磁场30分钟后的43℃。温度变化的初始斜率估计为0.014℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为15％，而不施加磁场(处理条件1)时为40％。这表明在处理条件2存在下，涂覆有pei的磁小体的中心部分对gl261细胞诱导的细胞毒性。
实施例18：涂覆有pei的衍生自amb-1的磁小体的中心部分。
制备：将混合有10ml无菌无热原性水的包含10mg铁的磁小体中心部分的悬浮液用超声处理指以30w以30秒的脉冲，以10秒脉冲间隔超声处理5分钟。将该悬浮液倚靠磁体放置，移除上清液，然后代之以10ml20mg/ml的pei溶液，所述pei溶液混合有无菌无热原性水并且ph为9.5。在该制备期间，pei的质量是铁的质量的两倍。将获得的混合物用超声处理指以20w的功率以10秒的脉冲，以20秒脉冲间隔超声处理30分钟。悬浮液每两分钟在冰浴中冷却一次。通过以下方式将其洗涤一次：倚靠玻璃管的壁放置钕磁体，移除上清液，然后代之以pyclerotichyclone水，并以30w超声处理1分钟。以相同的方式再洗涤十次。
表征：lal试验显示这些悬浮液中的内毒素浓度小于50eu/mg/ml。tem测量使得能够估计围绕这些磁小体的中心部分的涂层的厚度为4至18nm。包含1mg铁的涂覆有pei的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟测量期间降低64％。该悬浮液的光散射测量表明存在6％的流体动力学尺寸为125nm的物体、1％的流体动力学尺寸为5445nm的物体和93％的流体动力学尺寸为1067nm的物体。等电点估计为11.3，并且ζ电位从ph2下的50mv下降至ph12下的-10mv。chns测量显示碳百分比为6.6％。当将包含涂覆有pei的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并经受处理条件3时，混合物的温度在施加磁场30分钟后升高12℃。温度变化的初始斜率估计为0.04℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为12％，而不施加磁场(处理条件1)时为26％。这表明在处理条件2存在下，涂覆有pei的磁小体的中心部分对gl261细胞诱导的细胞毒性。
实施例19：涂覆有al(oh)3的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将包含7mg/ml的磁小体的中心部分的悬浮液首先以5w的功率以0.1秒的脉冲和0.1秒的脉冲间隔超声处理5分钟。将包含2mg的磁小体的中心部分的悬浮液引入8ml玻璃管中，将悬浮液倚靠钕磁体放置，移除上清液，并代之以600μl10mg/ml氢氧化铝。将混合物在20w下连续超声处理90分钟。通过以下方式进行第一次洗涤：将悬浮液倚靠磁体放置，移除上清液，并代之以hyclone水。以相同的方式再洗涤三次。
表征：包含涂覆有al(oh)3的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟测量期间不会降低，这表明该悬浮液的稳定性。tem测量显示存在围绕这些磁小体的中心部分的凝胶。该悬浮液的光散射测量表明存在5％的流体动力学尺寸为204nm的物体和95％的流体动力学尺寸为1810nm的物体。等电点估计为ph2.5，并且ζ电位从ph2下的5mv下降至ph12下的-30mv。chns测量显示碳百分比为3.3％。当将包含涂覆有al(oh)3的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并经受处理条件3时，混合物的温度在施加磁场30分钟后升高21.3℃。温度变化的初始斜率估计为0.034℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为26％，而不施加磁场(处理条件1)时为91％。这表明在处理条件2存在下，涂覆有al(oh)3的磁小体的中心部分对gl261细胞诱导的细胞毒性。
实施例20：涂覆有二氧化硅(apts)的衍生自msr-1的磁小体的中心部分。
制备：将包含7mg/ml的磁小体的中心部分的悬浮液首先以5w的功率以0.1秒的脉冲和0.1秒的脉冲间隔超声处理5分钟。将包含10mg的磁小体的中心部分的悬浮液引入8ml玻璃管中，将悬浮液倚靠钕磁体放置，移除上清液，并代之以2ml己烷和无水乙醇的混合物(1:1；v/v)。将悬浮液超声处理数分钟，然后加入200μlapts((3-氨基丙基)三乙氧基硅烷，apts；sigma参考编号：440140)，即211mg和500μl5mnaoh。将混合物在85℃下以5w的功率以0.1秒的脉冲和0.1秒的脉冲间隔超声处理10分钟。通过以下方式进行第一次洗涤：将悬浮液倚靠磁体放置，移除上清液，并代之以1.5ml体积的己烷和无水乙醇的混合物(1:1；v/v)。然后，将悬浮液以5w的功率以0.1秒的脉冲和0.1秒的脉冲间隔超声处理30秒。以相同的方式再洗涤三次。然后，向纳米粒子悬浮液中加入1毫升体积的5m氢氧化钠，然后将混合物在80℃下以5w的功率以0.1秒的脉冲和0.1秒的脉冲间隔超声处理15分钟。通过以下方式进行第一次洗涤：将悬浮液倚靠磁体放置，移除上清液，并代之以hyclone水。以相同的方式再洗涤两次。
表征：包含1mg铁的涂覆有二氧化硅的磁小体的中心部分的悬浮液在480nm下测量的吸收在20分钟测量期间降低90％。tem测量显示存在围绕这些磁小体的中心部分的凝胶。该悬浮液的光散射测量表明存在10％的流体动力学尺寸为235nm的物体、7％的流体动力学尺寸为277nm的物体和93％的流体动力学尺寸为1986nm的物体。等电点估计为ph6.7，并且ζ电位从ph2下的39mv下降至ph12下的-31mv。chns测量显示碳百分比为7.4％。当将包含涂覆有二氧化硅的磁小体的中心部分的悬浮液与gl-261细胞混合并经受处理条件3时，混合物的温度在施加磁场30分钟后升高26.9℃。温度变化的初始斜率估计为0.1℃/秒。当相同的混合物经受处理条件2时，活细胞百分比为2.5％，而不施加磁场(处理条件1)时为40％。这表明在处理条件2存在下，涂覆有二氧化硅的磁小体的中心部分对gl261细胞诱导的细胞毒性。
实施例21：不同的涂覆方案。
根据实施例6至20中所述的方案，有可能用涂覆剂聚-l-赖氨酸、壳聚糖、羧甲基葡聚糖、柠檬酸、油酸、二氧化硅、叶酸、dopc、阿屈膦酸盐、奈立膦酸盐、pei、al(oh)3来涂覆磁小体的中心部分，对于中心部分和涂覆剂的混合物，所使用的涂覆质量与中心部分质量之间的比率为10-9至109、10-6至106或10-2至102，超声处理时间为10-9至109秒、10-6至106秒或10-2至102秒，或超声处理功率为10-9至109w、10-6至106w或10-2至102w。
实施例22：中心部分之间的结合性质。
对涂覆有不同涂层(pei、dopc、奈立膦酸盐、壳聚糖、柠檬酸、葡聚糖、al(oh)3、二氧化硅、叶酸)的中心部分进行的tem测量显示，由接合材料隔开的两个中心部分的外表面之间的距离为0至大于400nm，通过接合材料连接在一起的中心部分的数量为2至大于10,000个，通过接合材料连接在一起的中心部分形成不同的形状，例如链、圆形、菱形、四边形(表3)，链的特征在于存在小平面平行的不同的中心部分，表明不同的中心部分的结晶轴在链的延伸方向上对准。
表1
表1(续)
表2
表2(续)
表2(续)
表3。