经X线照射处理的低抗原的角膜基质透镜及其制备方法与流程

本发明涉及组织工程学角膜技术领域，包括角膜基质透镜的制备和用途。

背景技术：

角膜病是仅次于白内障的世界第二大眼病。目前，世界上有超过1000万的双眼角膜盲患者，而且每年新增角膜盲病例150～200万。角膜移植一直是很多角膜病变的最有效解决方法。但近年来通过捐献并能应用于临床的角膜材料越来越紧张，很难满足大众的需求。

近年来，各国研究者们正在努力研究探寻一种安全、高效的移植材料，来缓解角膜供体的紧张，同时也能降低手术移植排斥反应。早在1963年McCarey研究采用氧化铅玻璃植入手动机械刀切开的角膜基质层中，但出现了角膜坏死及植片排出等严重并发症。之后也有研究者将PMMA材料、水凝胶材料等人工合成材料植入角膜基质中进行观察，但均有中毒性角膜基质炎、植片排出、植片溶解等并发症报道。人工合成材料在角膜移植上还有待改进，所以应用异种的生物材料进行角膜移植开始受到关注。

近期研究表明，脱细胞角膜材料可作为角膜组织再生的支架。但是，有效地通过化学或者物理方法去除移植组织中的细胞成分，同时仍能保持组织的固有结构是目前的一大难题。冻干法是常用的脱细胞方法，此方法减少了物理及化学损伤，也减少了角膜组织蛋白变性，但其对角膜基质细胞的迁移生长存在一定影响，术后的屈光矫正度数存在问题 。化学法和物理法对角膜材料进行脱细胞处理后，可能会因柔韧性变差而不能植入角膜层间，也有可能改变角膜基质的微环境而导致移植失败。

技术实现要素：

针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种经X线照射处理的低抗原的角膜基质透镜及其制备方法。

本发明是这样来实现上述目的的：

经X线照射处理的低抗原的角膜基质透镜及其制备方法，包括以下步骤：1）新鲜板层角膜材料的获取，利用飞秒激光技术从供体取出角膜基质透镜材料；2）将取出的角膜基质透镜材料在设定温度的湿房保存；3）快速取出角膜基质透镜进行X线照射，照射剂量为100Gy；4）将X线照射后的角膜基质透镜保存在无菌甘油中。

其中，所述角膜基质透镜材料的厚度为150~320μm。

其中，所述步骤2）中的湿房温度为4℃。

其中，所述步骤3）中的X线照射设备为RS2000生物学X线辐照仪，辐照参数为160kV、25mA、0.3mm铜过滤片。

其中，所述步骤4）中角膜基质透镜在无菌甘油保存温度为-20℃。

本发明的有益效果是：利用放射性的射线照射也可以达到脱细胞的目的，研究证实γ射线照射后可以显著降低角膜的免疫原性，疾病传播风险和植片感染。X线和γ射线虽能量和发生机理不同，但两者都是电磁波，在一定程度下均能引起组织内的细胞发生凋亡，所以生物学效应相同。由于γ射线源于放射性元素的衰变，对组织的破坏性更强，能在空气中传播，所以γ放射源的管理非常严格，能力源数量也很有限。而如今X线广泛应用于各种肿瘤的放疗治疗，使用历史性长，并且目前对其能量源防范性高，能量使用具备可调节性，更加精准。总而言之，相较于γ射线而言，X线使用更加安全、可控，来源也更方便。利用飞秒激光辅助的经X线照射的异种或同种异体角膜基质透镜保持了植片良好的透明度和组织相容性，并且利用X线照射的异种生物角膜基质透镜材料，大幅度减轻角膜供体的负担，利用飞秒激光辅助移植，使手术方式更加安全、高效，同时，移植的透镜可以准确控制屈光度数，达到个性化设计治疗目的。因此，使用X线照射的方法诱导角膜基质透镜中细胞凋亡，从而降低抗原性，可能会成为人角膜基质的理想替代物。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明：

图1是从人体取出角膜基质透镜经X线照射后利用TUNEL染色技术检测获得的图像；

图2是从兔角膜中取出膜基质透镜后经X线照射后的照片；

图3是利用供体为人体并经X线照射处理的低抗原的角膜基质透镜对恒河猴进行角膜移植术后的6月观察猴眼的照片。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1 X线照射处理人角膜基质透镜的制备

利用激光飞秒技术进行个性化设计切口、曲率、屈光度数，取出角膜基质透镜，可来源于行SMILE手术的近视患者，也可来源于人同种异体角膜。手术由同一经验丰富的主任医师完成。将术中取出的角膜基质透镜，4℃湿房保存。快速将新鲜保存的角膜基质透镜进行RS2000生物学X线辐照仪照射，照射总剂量选择100Gy，辐照参数：160kV，25mA，0.3mm铜过滤片。照射后，角膜基质透镜保存在无菌甘油中，-20℃保存。

利用TUNEL染色技术检测透镜中的细胞凋亡情况显示，在经过X线照射后透镜中的细胞全部凋亡，呈红色荧光，参见图1。

实施例2 X线照射处理兔角膜基质透镜的制备

利用激光飞秒技术从兔角膜中取出的板层角膜基质透镜，并设定取出的基质层一定的屈光度数。用兔袋固定兔身体，露出头部，铺手术洞巾，置于VisuMax全飞秒激光手术台，使用VisuMax飞秒激光仪在拟行SMILE术式的猴眼角膜基质内进行双层扫描，制作角膜基质透镜。

手术由同一经验丰富的主任医师完成。将术中取出的角膜基质透镜，4℃湿房保存。快速将新鲜保存的角膜基质透镜进行RS2000生物学X线辐照仪照射，照射总剂量选择100Gy，辐照参数：160kV，25mA，0.3mm铜过滤片。照射后，角膜基质透镜保存在无菌甘油中，-20℃保存。参见图2，大体观察照相所示兔板层角膜基质透镜经过X线照射后，透镜仍保持透明。

实施例3 用X线照射的人角膜基质透镜进行恒河猴异种板层角膜移植实验

用实例1所制备的人板层角膜基质透镜为医用供体材料（简称供体），选健康的恒河猴为受体进行板层角膜移植术。常规角膜屈光术前准备，盐酸氯胺酮注射液和氯丙嗪对猴进行全身麻醉后，用猴袋固定恒河猴身体，露出头部，铺手术洞巾，置于VisuMax全飞秒激光手术台，使用VisuMax飞秒激光仪在拟行SMILE术式的猴眼角膜基质内进行双层扫描，制作角膜基质板层囊袋。手术由同一经验丰富医师完成。用显微无齿镊及分离铲辅助讲供体植入角膜基质囊袋内，尽可能使透镜展平，将平衡盐溶液用24G冲洗针头冲洗角膜基质层间。术后予以妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。术后6个月观察期间内无排斥反应发生。

实施例4 用X线照射的兔角膜基质透镜进行恒河猴异种角膜移植实验

用实例2所制备的兔板层角膜基质透镜为医用供体材料（简称供体），选健康的恒河猴为受体进行板层角膜移植术。常规角膜屈光术前准备，盐酸氯胺酮注射液和氯丙嗪对猴进行全身麻醉后，用猴袋固定恒河猴身体，露出头部，铺手术洞巾，置于VisuMax全飞秒激光手术台，使用VisuMax飞秒激光仪在拟行SMILE术式的猴眼角膜基质内进行双层扫描，制作角膜基质板层囊袋。手术由同一经验丰富医师完成。用显微无齿镊及分离铲辅助讲供体植入角膜基质囊袋内，尽可能使透镜展平，将平衡盐溶液用24G冲洗针头冲洗角膜基质层间。术后予以妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。术后6个月观察期间内无排斥反应发生，参见图3，同时利用前段OCT观察，术后6个月内透镜在受体角膜基质中未发生溶解。

综上所述，本发明的实施方式并不受上述实例的限制，本发明旨在为生物工程角膜提供新的方向及新技术，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化等，均应视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内 。