专利名称：脱细胞结膜基质的制备方法和应用的制作方法
脱细胞结膜基质的制备方法和应用
狱领域
本发明涉及一种作为组会im魏厳架材料的腳鹏膜基质的帝恪施和細。 背景狱
角m^是我国的第二^C盲脚艮病，角，植是复明唯一有效的治疗手段，但角膜f^!W才料的ES
严 响角 植的开展。3fi^来，随^ia织a:禾iS术的，，组织o^呈角鹏各为角,的治疗开辟新 的齒5。组织oa的三大要素包摘中子细胞、支架材料和微环趟。支架材料鄉^^存和行使功能的场 所，同时能引导细ifi^长，决定着所构彰且织的脇。只有选择了良好的^^材料，种子细财能在其 上数子地生长、增殖。a^想的^:架材料应当满足以下^f牛(i)生物相容断，離隹持3隹空间和舰 正常细ia^长和分化而不干扰其他的生ffl:程(2)无不良组织鹏；(3)材料制作简单，并能按不
同的^t和大小翻；(4)禾fiA体内后，材料可被^lf或吸收。由于角ma织沐身的微性，纟imil呈
角膜支架材料同时鹏具有一定的透明性和抗牵拉能力。迄今为腿没有发现一种支架材料完全具备上
已有的组织a^呈角M^架材料如天然高w材料中的胶原、明胶等，生物相容i40，但者隋力学性 能欠佳、,过瞎缺点；Ai合成的高^ 材料如聚f強乙酸、聚乳^^乙麟，酸性,^/则
易堆积在局部，不利于细胞生长；生顿行生材料如"去上皮，羊膜或生物羊膜等，在体内P if^、决，也不
倉織股且织o:程角膜的需要。理想的支架材料一:i^ta织a^呈角膜的研究热点，也是制约组织sif呈角膜
赚的并砂页问题，故寻找一种逸想的支架材料是非常必要的。
发明内容
本发明的目的^f共一种JM胞结膜基质的制备方法，及其作为组纟尸o:禾呈角05:架材料i^于构建 组织a3呈角mi:戯内皮，以弥补现有组织o:禾魏M^架材料的不足。
本发明以动物(主要是屠宰场的猪)的球结膜或目脾中人的球结膜为材料， :#^只分数为0.2%戊
二醛溶蔽联、術只分数为l%tritonX-100、质量柳分数为0.25%月鱖口 0.02%EDTA鹏胞、紫外线
消毒等过程制备ra胞结膜基质，并以自胞结膜基质为组织o:程角M^架材料i歸人角JRh皮或内皮
细胞，人角月EJ:戯内鄉胞^I魏胞结膜基质上形忠紧密雜的细胞单层，构建出组织vT^呈角MJ:皮 或内皮，并可^i力用于人角膜缘干细胞^2^膜内皮细胞功能失代^^角li^的治疗。 本发明M胞结膜基质的制备方法
1. TO宰场的亲賴羊鄉艮球，用PBS反复冲^^，剪去球周组织，再ITf^结膜，置^"妥布霉素 1000UM的PBS中浸泡30併中；若是TO目脾中人的球结膜，直接置^^妥布霉素1000U/ml的PBS 中浸泡30舰
2. ;^g净台内于光学^mM微镜下将J^结膜的Tenon囊尽:M除干净，并用PBS冲洗，浸泡 于#^只分数为0.2%戊二醛溶液中5^中，以进行交耳對，；3. 再用PBS冲冼，以去除残留的戊二醛溶瓶
4. 然后对球结J^i4行MMfcS,在37'C恒SI港床掘^f只分数为1。/。的tritonX-100舰24小时， 然后在37'C， C02浓度为5%的:1§^|中，质量fl^只，为0.25%的^ 和0.02%的EDTA作用2小时， 用PBS震荡冲洗10併中，MS净台内a^干燥，球结膜WE紫外消豁30^I中，艮时穀UMJJS^膜 基质。
本发明的M鹏膜基质作为组织a^呈角膜支架材料而細于构彰且织of魏ah颇内皮。 ,鹏膜基质作为组簡魏敝架材料的鹏方法-
1. 靴为组製魏殿架材料的W鹏膜基鹏鹏前用PBS冲洗，然后放于24子版中， 在无菌超净台内晾干，ffi^固贴在24孑Lfeb
2. 再榭乍为种子细胞的人角Rh^或内MB胞荣,胞悬液，使用含10%FBS的DMEM/F12培
!^种^j^贴有鹏鹏膜基质的24孔板中，3燕ii^，待形戯密雜的角ai^内M
胞单层，即构^HL织a^呈角MJ^内皮；
3. 驗teJ^i且织a^角Rh戯内皮分别移艇u角^^干细胞^^膜内卿胞功能失代偿 本发明首次将i^ffl,膜基质作为一种实用的组mi程角^:架材料，其帝恪方法简单，生辦目容
'附子，透明并具有一定的屈光力和一定的弹性和抗牵拉能九种子细胞容易4W鹏膜基质上生糊
增殖；i)tm性很低；^S慢，有利于种子细胞增殖和^SI力能在培f^i程中和移t躯始^f其 透明度；且球结11*源广泛，具有广阔的細开发前景。
本发明以动物(主要魏宰场的猪)的球结膜，或H脾中人的球结膜为原材料，制备出鹏鹏膜 基质，并以Mffi^膜基质作为组织Tl呈角Mi架材料，构建出可用于移植的组织vH呈角J^i:皮或内皮。 鹏鹏膜基质的制备方法
1. Wf宰场的辦羊鄉艮球，用PBS反复州5fe/g，剪去球周组织，再剪T^结膜，置于含妥布霉素 1000U/ml的PBS中浸泡30併中；
2. SS净台内于光学^E^微镜下将J^结膜的Tenon囊尽 除干净，并用PBS冲洗'放于 術只分数为0.2%戊二醛溶液中5併喊行交KW;
3. 再用PBS冲〗先，以去除残留的戊二醛溶液；
4. 然后刘球结J^fi行raMtH，在37。C恒i^岳床iffl^f只微为l%tritonX-100作用24小时., 然后在37'C， C02浓度为5%的*|#箱中，质量ft!R分数为0.25°/。月繊口 0.02。/。EDTA作用2小时，用 PBS震荡冲洗10规方MiS净台内鹏千燥，球结膜顾紫外消豁30恤得到鹏胞结膜翻。
本发明方馳可用屠宰场中其它动物的球结膜制备，方法同上。
若是鹏目脾中人的球结膜，在步骤1中直接置雅妥布霉素1000U/ml的PBS中浸泡30併中，
其后步骤相同。
在AM织vEg角J^l:皮或内鹏用于临i^前，做了媳的动物实验，证明其完全^^应用于l临床。Mm膜基质作为组织vifM^^:架材料构建出的Affl^a^M^ahM内^^于i1^，移植
到AH让，具体顿施如下
(1) 鹏^3a^膜基劂柳前用PBS冲洗，然后放于24孑版中，在无菌超净台内晾干，ffiK^固贴 在24孑USJ:;
(2) S^^外i歸的人角RhjM内卿胞制鹏脱悬液，舰含10%FBS的DMEM/F12 接种在贴有M鹏膜基质的24孔板中，3^^ig#^， 7鄉忠紧密连接的角ah^内細m^层， 即构建出组织vll魏mi^内皮；
(3) fch^且织Ol魏RJb鹏内皮分别移丰鼓桷膜缘干细胞^2^膜内皮细胞功能失代偿的人 目吐，结舰示AB鹏且会ra魏mhJ^内颇免翻诉鹏，组织vEf呈角ahi^内鹏移齢30 天仍未,，m角I^T细胞^^ft膜内Mii胞功能失代H^有显著的fim。
为了保跟; 构建的AlilPa^呈角mi:iM内皮能^^的l顿，通常翻取其进fi^下检测 細台盼蓝-歸红鹏，结縣 鹏界清晰，与正常人角Rh^或内鹏胞的^^相同，
有极 驗SM胞结膜基质生长的人角ai:颇内飾胞有活性；
，细WfeS荧光方法能检测至i认角mi:JSIffl胞的新己物K3/12或内^ffl胞的牛斜己物NSE， M^在
月細鹏膜基质生长的人角Rh皮或内鄉胞有功能。
鹏鹏膜基质可細以下;u中方鄉存
(1) 方烛含10r。FBS的DMEM7F12培鎌中，4。C密封保^^用；
(2) 直^^封于无菌塑料包装袋中，常温保存j顿前置矜10T。FBS的DMEM/F12JtM中浸 泡12小时以上备用；
G)置于纯甘油中一20。C保存；4柳前用PBS反复冲洗后，再放于含10%FBS的DMEM/F12培养 液中浸泡12小时以上备用；
(4) 置于DMEM与纯甘油^KR混合液中一2(TC保存i^fl^"法同(3)
(5) 置于FBS与纯甘油^f只混合液中一20。C保存j挑前用PBS反复冲洗。 以下列多个实施例，详细说明本发明。
鄉例l
以鄉艮球结膜为材料制备月細鹏膜基质
屠宰厂取回§ #猪眼球，用PBS反复冲洗后，剪去球周组织，再剪下球结膜，置矜妥布霉素
1000U/ml的PBS中浸泡30併巾；，净台内于光学^IES微镜下将i^结膜的Tenon囊尽量剪除千 净，并用PBS冲洗，放于fti口、分数为0.2。/o戊二醛溶液巾5粥+it行交駒跟；再用PBS冲洗，以去除 残留的戊二醛溶液；然后对球结膜I行M胞处理，在37。C恒温摇床J^I^只分数为l%tritonX-100作 用24小时.,然后在37°C ， CO2浓度为5°/。的±辯箱中，质量^^口、分数为0.25%月繊口 0.02%EDTA作用2 小时，用PBS震荡冲洗10倂中，方jfffi0净台内SM千燥，球结膜丽紫外消豁30併中'得到鹏胞 结膜基质。方爐含10%PBS的DMEM/F12 itf^中，4"密封保#^用^1^魏封于无菌塑料^^^中， 在常温下保存。鄉例2
以人的球结勵材料W,鹏膜驗
聊脾中人的球结膜，置^^妥布霉素1000U/ml的PBS中浸泡30併中；S^净台内于^^^见 显微镜下将Jd^结膜的T画囊尽翻除干净'并用PBS冲洗，放于鹏分数为0.2%戊二醛溶液中5 ^H中进行交TO^再用PBS冲洗，以去除残留的戊二醛溶液；然后对球结鹏行MMfcS,在37。C 恒温摇床J^^i^只^m为l%titonX-100作用24小时.,然Jg在37。C， 浓度为5%的@^|中，质量体 积分数为0.25o/cJRRf口0.02。/。EDTA作用2小时，用PBS震荡冲冼IO倂中， ^净台内3^千燥，球 结膜Mffi紫外消豁30併中，《躬IJM鹏膜基质。置预甘油中，在—20'C保存，體于DMEM与 纯甘油^KR混合液中，在一20。C保存，驢于FBS与纯甘油^^只混合液中，在一2(TC保存。 鄉例3
以MM^膜基质为雜/口a^呈角厳架材料构^M织a^ai^内皮
取出^M例i制备的作为组织a^魏E5:架材料的鹏^^膜基质，pbs冲^/g伸顾于24孑版中，
在无菌超净台内晾干，使雜固贴附于24孑L板的地面。将体外歸的兔角mi:喊内鄉胞消^^细 胞悬液，{顿含15%FBS的DMEM/F12 土"§#^接种于贴有 6^膜基质的24孑版中，3殘i"g^， 5天角^]:]^内自胞可在 胞结膜基质上形 密 的细胞单层，即构W^且织v0呈角mi: 皮或内皮。 鵷例4
以ME^膜基质为组mif呈角^:架材料构^Affl织a:程角ai:鹏内皮 取出实lfi例2制备的作为组织a:程角^:架材料的raa^膜基质，PBs冲船伸繊于24孑版中，
在无菌超净台内B京干，使僻固贴附于24孑版的地面。将体外i鎌的人角Rh皮或内鄉胞消化鹏细 胞悬液， <姚含10°/。FBS的DMEM/F12 i^t接种于贴有月胸胞结膜基质的24 版中，3 ^^i^M， 7天角 皮或内自胞可在 ^^膜基 形忠紧密连接的细胞单层，即构^UM织vT^角ai:
鄉例5
制作角月徵干细胞败(如鹏先)的兔动辦難，取实施例3构建的勉织03魏 皮移翻 兔动物M目让。结果显示剣欧il组纟尸a:程角ai:皮无免翻诉反应，且移植后组织vX程角JU三皮25
天仍未降解，并能^4、角膨新tt管及角膜白斑的形成，证明其^r嫩。
鄉例6
制作角膜内皮细胞功能失代偿(如撕除角月躯弹力层)的兔动jtM，取实施例3构建的勉且纟io:
程角膜内皮移l赶晚动4辦莫型眼t。结果显，歐寸组织03呈角膜内皮无免翻诉反应，且移净躯组织
Xg角膜内皮25天仍未降解，并微灰复角膜的透明14M免角膜大泡的形成，其疗5划子。 实施例7
取鄉例4构建的旭虹程角數皮移翻患有角膜缘干细胞阪的Aflai:。结^M示細寸组 虹程角fc皮无免翻诉鹏，且移職且虹程角IIi:皮30天仍未糊牟，并能齡角職她管及 角膜白斑的形成，其疗效好。魏例8
取^s例4构建的Aia织a^魏膜内皮移丰鼓隨有角膜内^igmr力能失代偿的As吐。结魏示人 目g)啦且织aB角膜内^fe^诉反应，且移s/g组织o:程角膜内皮3o天仍未降解，并能咴魏膜的透 明14M免角馱泡的形成，其,子。
例9
律怖角Ri:皮斷员(如lflM刮除)的^t^M，分别将^M例2制备的M胞结膜基质和已有的
组织a^M^材料"去上皮，羊鹏鄉植拽动辦翻目吐。结殿示，虽然娜纖鹏质和
"去嫂'羊膜均无免翻诉鹏，但'去嫂，羊^&移蹄10天,，而MMg膜S^移f躯25 天仍未,。
制作角膜缘干细胞败(如 1方)的兔动槲翻，将以"去上皮，羊膜为组织o:禾魏JlS^材料构
建的爐虹程角耻皮移挺晚动榭趣社，观察其疗效。结*^，虽然剣,会)m呈角JEi:
^Efe^诉鹏，但'去嫂'羊^s移f躯io天,，而不倉離i鹏桷膨新tt管和角膜白a^成
的作用。
鄉例ll
制作角膜内鹏胞功能失代偿(如 角11^弹力层)的兔^tf题，将以"去J^'羊，纟1IRX
程角膜支架材料构建的^^形iin魏膜内皮移植到兔动tra目吐，观察其^st结m^，虽然剣艮
对组织o:程角膜内皮无免翻诉ffi，但'去上皮，羊驗移卞躯io天,军，麻會鹏,魏膜的透明
性和抑制角膜力包形成的作用。
权利要求
1、脱细胞结膜基质的制备方法(1)取屠宰场的新鲜猪眼球，用PBS反复冲洗后，剪去球周组织，再剪下球结膜；或眼库中人的球结膜，置于含妥布霉素1000U/ml的PBS中浸泡30分钟；(2)在超净台内于光学体视显微镜下将上述球结膜的Tenon囊尽量剪除干净，并用PBS冲洗，放于体积分数为0.2％戊二醛溶液中5分钟以进行交联保护；(3)再用PBS冲洗，以去除残留的戊二醛溶液；(4)然后对球结膜进行脱细胞处理，在37℃恒温摇床上用体积分数为1％tritonX-100作用24小时，在37℃，co2浓度为5％的培养箱中，质量体积分数为0.25％胰酶和0.02％EDTA作用2小时，用PBS震荡冲洗10分钟，放在超净台内通风干燥，两面紫外消毒各30分钟，得到脱细胞结膜基质。
2、 脱细胞结膜基质作为组织工程角膜支架材料应用于构建组织工程 角膜上皮或内皮。
3、 脱细胞结膜基质作为组织工程角膜支架材料的应用方法-(1) 将作为组织工程角膜支架材料的脱细胞结膜基质在使用前用PBS 冲洗，然后放于24孔板中，在无菌超净台内晾干，使其牢固贴在24孔板 上；(2) 再将体外培养的人角膜上皮或内皮细胞制成细胞悬液，使用含 10%FBS的DMEM/F12培养液接种在上述贴有脱细胞结膜基质的24孔板 中，3天换培养液，7天形成紧密连接的角膜上皮或内皮细胞单层，即构建 成组织工程角膜上皮或内皮；(3) 最后把上述组织工程角膜上皮或内皮分别移植到角膜缘干细胞缺乏或角膜内皮细胞功能失代偿的人眼上。
4、 制备好的脱细胞结膜基质的保存方法(1) 放在含10%FBS的DMEM/F12培养液中，在4。C密封保存；或(2) 直接密封于无菌塑料包装袋中，在常温下保存；或(3) 置于纯甘油中，在一20。C保存；或(4) 置于DMEM与纯甘油等体积混合液中，在一2(TC保存；或(5) 置于FBS与纯甘油等体积混合液中，在一2(TC保存。
全文摘要
本发明涉及一种作为组织工程角膜支架材料的脱细胞结膜基质的制备方法和应用。本发明首次将球结膜中的细胞成份除去，制备出脱细胞结膜基质，并以其作为组织工程角膜支架，兔角膜上皮或内皮细胞可在支架上形成良好的细胞单层，构建出组织工程角膜上皮或内皮，并成功移植于兔动物模型眼上。本发明所构建的组织工程角膜降解时间较长，兔眼对其无明显免疫排斥反应，且对角膜缘干细胞缺乏或角膜内皮细胞功能失代偿的治疗效果均显著。本发明制备方法简单；生物相容性好；抗原性很低；种子细胞容易在其上生长和增殖；降解较慢；在培养过程中和移植后始终保持其透明度；且球结膜来源广泛，具有广阔的应用开发前景。
文档编号A61L27/00GK101590292SQ20091001634
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者史伟云, 周庆军, 杨玲玲, 赵海峰, 彦 高, 高美丽 申请人:山东省眼科研究所