专利名称：一种制备脱细胞基质的方法
技术领域：
本发明属于组织工程领域，具体地说是涉及一种制备脱细胞基质的方法。
技术背景来源于脱细胞基质的各种生物支架材料，在动物实验的临床前研究和人种疾病的临床应 用中，己经取得了成功。通过去除各种组织器官中异种或同种异体细胞，保留其中复杂的结 构和功能蛋白，即可得到相应组织器官的脱细胞基质。不同的脱细胞方法直接影响所得脱细 胞基质的成分和超微结构，最终影响移植后宿主对脱细胞基质的反应。现行脱细胞基质的制备方法主要包括l物理法；2化学法；3酶法。物理法指的是通过冷冻，高压，超声波，渗透压改变等物理方式破坏细胞，其优点在于得到的脱细胞基质没有其他外加成分的残留，但这种方法的最大缺点是在破坏细胞的同时也不同程度的破坏了细 胞外基质的超微结构，同时破裂的细胞碎片一定要通过其他方式予以清除，这种清除过程会 进一步破坏细胞外基质的超微结构。化学法包括使用某些酸、碱、表面活性剂等化学方法裂 解细胞。这种方法其优点在于脱细胞过程短，速度快，但这种方法同样会破坏细胞外基质的 超微结构，并且还会造成某些基质成分(如蛋白多糖)的丢失。酶法主要使用各种蛋白酶(如 胰蛋白酶，中性蛋白酶)核酸酶(核酸外切酶，核酸内切酶)，通过水解细胞蛋白成分和核酸 成分达到破坏细胞的目的。蛋白酶可以有效地去除细胞成分，但由于胰蛋白酶和中性蛋白酶 的作用底物比较广泛，造成细胞外基质中的结构和功能蛋白大量降解。核酸酶选择性的降解 核酸，不会造成细胞外基质成分的破坏，但其分子量过大，极易引起免疫反应。在组织工程中良好的支架材料应具有以下技术要求:①良好的生物相容性，自身及其降 解产物对机体无毒性,不引起排斥反应和炎性反应，不致突变、畸变;②材料携带具有生物诱导 性的多种细胞生长因子，诱导自体细胞生长繁殖;③支架材料的降解速率与植入脱细胞基质 的细胞形成组织器官的速率相匹配。在支架完成其功能后可被完全吸收或与新生的组织融合; ④可按各组织的特点和缺损情况进行塑形，达到完善修复;⑤具有一定的韧性和可加工性，能 形成三维立体结构，为细胞进行物质代谢提供足够空间。现有研究表明利用脱细胞基质作为 组织工程的支架材料具有来源广泛，可降解，有良好的生物相容性的特点，特别是材料可预先 按修复组织大小和厚薄设计，更适于各种组织病变的修复重建。因此，如何获得具有以上5项技术要求的脱细胞基质成为组织工程亟待解决的重大课题。 发明内容本发明需要解决的技术问题是提供一种制备脱细胞基质的方法，该方法可制备到具有较 好物理学性状和生物学功能的脱细胞基质。 解决上述技术问题的技术方案如下 一种制备脱细胞基质的方法，包括以下步骤-a. 将待用组织器官预处理；b. 将经过预处理的待用组织器官加入到包含有磷脂酶的溶液中,通过低渗或等渗液 浸泡制备脱细胞基质，其中，磷脂酶的浓度小于10000U/ml;c. 洗涤制备的脱细胞基质本发明一种利用磷脂酶制备脱细胞基质的方法的技术方案是选择专一性更强的包含有磷 脂酶的溶液特异性水解待用组织器官中细胞的磷脂成分，达到脱去细胞而不损伤细胞外基质 的目的。同时也可以辅以化学法，使用对细胞外基质成分影响很小的一种或一种以上表面活 性剂，以加快磷脂酶的脱细胞作用。另外，根据各种组织的脱细胞要求的不同，可以再辅以 物理方法进一步加快磷脂酶的脱细胞速度。所述的待用组织器官包含有异种或同种异体或自体组织器官。可为皮肤，心瓣膜、血管、 膀胱、韧带、软骨、神经中的任一种，也可以为角膜、巩膜、结膜中的任一种或其任意组合 体。 '所述的预处理指的是使用包含抗生素的生理缓冲液对待用组织器官进行常规清洗、消毒、 分离。还可以包括低渗或等渗浸泡，震荡，调节洗涤温度，适当频率和强度的超声波处理所述的磷脂酶包含有磷脂酶Ap A2， Bp B2， C， D中的任一种或一种以上。。所述的磷脂酶的浓度范围小于10000U/ml，优选l-1000U/ml。含有磷脂酶溶液的温度范 围为0-56'C，含有磷脂酶溶液的pH值范围为5-12。在利用低渗或等渗浸泡，震荡时，可以调节反应温度，适当频率和强度的超声波处理等 物理方法进一步加快磷脂酶的脱细胞速度。所述的表面活性剂指的是生物体内可以生成的具有表面活性作用的成分，或指的是人体 内可以生成的具有表面活性作用的成分。所述的表面活性剂包含有聚乙二醇，TritonX-100,胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐， 甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂等种成分或其任意组合。所述的洗涤指的是使用可以包含抗生素的生理缓冲液对所得脱细胞基质进行常规清洗。本发明选用磷脂酶对待用组织器官进行脱细胞处理，其优点在于1. 是一种高活性的、特异性的水解磷酯键的酶。而构成细胞膜的主要成分就是各种磷脂，因 此使用磷脂酶脱细胞特异性强，对细胞外基质中的结构和功能蛋白没有损伤作用。2. 磷脂酶分子量小，微量残留时能够引起免疫反应的可能性极小。此外残留微量的磷脂酶还 具有广谱的抗感染，抑制炎症作用，因此对人体无害。3. 磷脂酶对于完整细胞膜的作用大于对细胞膜碎片的作用。因此可以优先裂解完整的细胞。4. 表面活性剂可以明显地促进磷脂酶的水解反应。各种表面活性剂本身也具有脱细胞功能， 但其在脱细胞的同时可不同程度的破坏细胞外基质中的蛋白成分，造成各种具有重要功能 的蛋白质丧失其生物学功能。但是表面活性剂在本发明中可以明显促进磷脂酶的水解反 应，加快了水解反应速度。本发明优选的表面活性剂具有以下特征(1)能明显促进磷脂 酶的脱细胞效果。(2)本身对细胞外基质中的结构和功能蛋白造成的损伤较小。如 TritonX—100和脱氧胆酸钠，有一个大而且刚性的极性基因，较难进入蛋白质表面的裂缝， 使得细胞外基质蛋白四级结构受到较小影响。(3)在使用表面活性剂时，在保证提高磷脂酶 活性，促进磷脂酶水解反应的前提下，最大限度的降低表面活性剂的使用浓度，本领域的 技术人员根据现有理论可以灵活的加以实施。(4)优先选用来源于生物体或人体的表面活性 齐U，这种表面活性剂最大的优点在于其微量的残留物不影响人体正常的生理功能。因此本 发明更优先选用胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐，甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐， 牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一种或一种以上。5. 为了进一步增强磷脂酶的脱细胞效果，可以采用物理方式对待用组织器官进行处理。本发 明主要采用物理法中低渗或等渗浸泡，震荡，调节温度，适当频率和强度的超声波等常规 方式，增加磷脂酶的脱细胞效果。6. 磷脂酶在不同pH值、温度、浓度条件下具有不同的水解速度，因此，可以通过调节这些 参数来灵活控制磷脂酶的水解速度，以适应不同组织器官的脱细胞要求。综上所述，本发明选用磷脂酶对待用组织器官进行脱细胞处理，根据各种组织器官的脱 细胞要求，可以采用以磷脂酶为主的方式，也可以采用磷脂酶加表面活性剂以提高磷脂酶水 解速度的方式，还可以进一步加入某些物理方式强化磷脂酶的脱细胞效果。并可随时调整反 应体系的pH值、温度、磷脂酶浓度，高度灵活的控制磷脂酶的脱细胞程度和速度。通过本6发明所述方法，可获得具有良好物理学性状和生物学功能的脱细胞基质，不但是组织工程的 重大突破，也直接为临床疾病的治疗开拓了新途径。本发明原理可靠，工艺简易灵活，产品 重现性好，极易实现产业化。
图1 a为新鲜猪角膜组织苏木素一伊红(HE)染色照片；图1 b为猪角膜脱细胞基质HE染色照片；图2 a为新鲜猪角膜缘组织HE染色照片；图2 b为猪角膜缘组织脱细胞基质HE染色照片；图3 a为新鲜猪结膜组织HE染色照片；图3 b为猪结膜脱细胞基质HE染色照片；图4 a为新鲜猪巩膜组织HE染色照片；图4 b为猪巩膜脱细胞基质HE染色照片；图5 a为新鲜猪主动脉组织HE染色照片；图5 b为猪主动脉脱细胞基质HE染色照片；图6 a为新鲜猪皮肤组织HE染色照片；图6 b为猪皮肤脱细胞基质HE染色照片；图7 a为以猪角膜脱细胞基质为供体的兔眼板层角膜移植术后1天照片； 图7b为以猪角膜脱细胞基质为供体的兔眼板层角膜移植术后80天照片。
具体实施方式
a. 待用组织器官预处理室温下，按常规无菌操作原则，取待用组织器官，依据所取组织器 官的不同，其预处理方式可以不同。基本包括常规无菌取材，低渗或等渗液浸泡，或用 适当频率和强度的超声波处理。其目的是为了让磷脂酶更好的渗透到组织内，提高磷脂酶 的脱细胞效果。b. 待用组织器官加入到包含有磷脂酶的溶液中，依据所取组织器官的不同，可选用的磷脂酶可以包含有磷脂酶Ai， A2， Bp B2， C， D中的任一种或一种以上，可选用的磷脂酶的浓 度范围小于10000U/ml,优选l-1000U/ml，控制包含有磷脂酶的溶液的温度范围为0-56°C， pH值范围为5-12。通过对磷脂酶种类，浓度，溶液温度，反应PH值等参数的调节，可 以达到加快或减慢磷脂酶脱细胞速度的目的。依据所取组织器官的不同，和对各种脱细胞基质质量要求的不同，可以在包含有磷脂酶的 溶液中，加入一种或一种以上表面活性剂，以加快磷脂酶的脱细胞速度。控制所加入的表:面活性剂的浓度，使其可明显提高磷脂酶的脱细胞速度，而又不损伤细胞外结构和功能蛋 白。本发明优选来源于生物体或人体的表面活性剂，这种表面活性剂最大的优点在于其微 量的残留物不影响人体正常的生理功能，如胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐，甘氨 胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋白，溶血 卵磷脂中的任一种或一种以上。为了进一步提高磷脂酶的脱细胞效果，可以采用物理法中的低渗或等渗浸泡，震荡， 调节温度，适当频率和强度的超声波等常规方式，来辅助磷脂酶更好的发挥脱细胞作用。C.洗涤制备的脱细胞基质，是使用可以包含有抗生素的生理缓冲液对所得脱细胞基质进行常 规清洗。因制备的脱细胞基质的不同，洗涤方式，次数，时间可以不同。但其目的都是为 了最大限度的减少脱细胞试剂的残留量。由于本发明使用的磷脂酶和本发明优选的表面活 性剂在微量时对人体无害，因此本步骤的技术要求可以大幅度降低。实施例l本实施例的目的是用猪角膜制备猪角膜脱细胞基质。(注本实施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶A" A2， Bi， B2， C， D中的任一种或一种以上。所用的表面活性剂可以是生物体内或人体内可以生成的具有表面活性作用的成分，如胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧 胆酸盐，甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一种或一种以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-100,其效果和以下相 同)。1. 在室温，常规无菌操作下，用10.0mm环钻取下新鲜猪眼角膜片。将所取的猪角膜片使 用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 ug/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡2-5次， 每次2-10分钟。2. 将猪角膜片置入10ml无菌纯水中，在37'C水浴中浸泡10-60分钟。3. 将猪角膜片置入10ml无菌磷脂酶溶液I中，在37'C水浴中震荡处理3-10小时。(无菌磷脂 酶溶液I:使用碳酸盐缓冲液配制，pH值范围为8-12,其中，磷脂酶Ai + A2-50 500U/ml， 表面活性剂脱氧胆酸钠的质量百分浓度为0.01-1% )。4. 将猪角膜片取出使用碳酸盐缓冲液洗涤l-3次。5. 将猪角膜片置入10m无菌磷脂酶溶液II中，在37。C水浴中震荡处理l-5小时。(无菌磷脂酶溶液II:使用碳酸盐缓冲液配制，pH值范围为5-8，磷脂酶A^A2-50 500U/ml)6. 将猪角膜片置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G, 100 ii g/ml硫酸链霉素)的碳酸盐 缓冲液中，在37'C水浴中震荡冲洗3-6次，每次10-30分钟。7. 将制成的猪角膜脱细胞基质片在4'C和无菌条件下保存。实施例2本实施例的目的是用猪角膜缘组织制备猪角膜缘脱细胞基质。(注本实施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶A" A2， B,， B2， C， D中的任一种或一种以上，其效果和以下相 同)。1. 在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪眼角膜缘内外各2mm区域组织，将所取的猪角膜 缘组织使用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 lig/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡 2-5次，每次2-10分钟。2. 将猪角膜缘组织置入10ml无菌纯水中，在4X:水浴中浸泡10-60分钟。3. 将猪角膜缘组织置入10ml无菌磷脂酶溶液中，在4'C水浴中震荡处理6-24小时。(无菌磷 脂酶溶液使用碳酸盐缓冲液配制，pH值范围为8-12,磷脂酶A一A2-50 500U/ml)。4. 将猪角膜缘组织置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 u g/ml硫酸链霉素)的碳 酸盐缓冲液中，在25。C水浴中震荡冲洗3-6次，每次10-30分钟。5. 将制成的猪角膜缘脱细胞基质在4'C和无菌条件下保存。实施例3本实施例的目的是用猪结膜制备猪结膜脱细胞基质。(注本实施例所用的磷脂酶溶液可 以包含有磷脂酶A!， A2， Bp B2， C， D中的任一种或一种以上。所用的表面活性剂可以是 生物体内或人体内可以生成的具有表面活性作用的成分，如胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧 胆酸盐，甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋 白，溶血卵磷脂中的任一种或一种以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-lOO，其效果和以下相 同)。1.在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪眼球结膜lxlcm范围组织，将所取的猪结膜组织 使用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 u g/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡2-5次，每次2-10分钟。2. 将猪结膜组织置入10ml无菌纯水中，在1(TC水浴中浸泡10-60分钟。3. 将猪结膜组织置入10ml无菌磷脂酶溶液中，在10'C水浴中震荡处理6-24小时。(无菌磷 脂酶溶液使用碳酸盐缓冲液配制，pH值范围为8-12,磷脂酶A^10 300U/m1,表面活 性剂牛磺胆酸盐钠的质量百分浓度为0.1-5%)。4. 将猪结膜组织置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 u g/ml硫酸链霉素)的碳酸 盐缓冲液中，在l(TC水浴中震荡冲洗3-6次，每次10-30分钟。5. 将制成的猪结膜脱细胞基质在4i:和无菌条件下保存。实施例4本实施例的目的是用猪巩膜制备猪巩膜脱细胞基质。(注本实施例所用的磷脂酶溶液可 以包含有磷脂酶A!， A2， B!， B2， C， D中的任一种或一种以上。所用的表面活性剂可以是生物体内或人体内可以生成的具有表面活性作用的成分，如胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐，甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一种或一种以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-lOO，其效果和以下相 同)。1. 在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪眼巩膜lxlcm区域组织，将所取的猪巩膜组织使 用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 ug/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡2-5次， 每次2-10分钟。2. 将猪巩膜组织置入10ml无菌纯水中，在37'C水浴中浸泡3-12小时。3. 将猪巩膜组织置入10ml无菌磷脂酶溶液I中，在37"C水浴中震荡处理6-24小时。(无菌磷 脂酶溶液I:使用碳酸盐缓冲液配制，pH值范围为8-12,其中，磷脂酶At + A2=50~500U/ml， 磷脂酶B一Bf50 500U/ml，表面活性剂脱氧胆酸钠的质量百分浓度为0.01-0.5%,,牛磺胆 酸钠的质量百分浓度为0.1-1%)。4. 将猪巩膜组织取出使用碳酸盐缓冲液洗涤1-3次。5. 将猪巩膜组织置入10m无菌磷脂酶溶液n中，在37'C水浴中震荡处理l-6小时。(无菌磷 脂酶溶液II:使用碳酸盐缓冲液配制，pH值范围为5-8，磷脂酶A! + A2-50 500U/ml，磷 脂酶Bi+Bf50 500U/ml)。6. 将猪巩膜组织置入50ml含抗生素的碳酸盐缓冲液中，在4(TC水浴中震荡冲洗3-6次，每次10-30分钟。7.将制成的猪巩膜脱细胞基质在4'C和无菌条件下保存。实施例5本实施例的目的是用猪胸主动脉制备猪胸主动脉脱细胞基质。(注本实施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶A!, A2， Bp B2， C， D中的任一种或一种以上。所用的表面活性 剂可以是生物体内或人体内可以生成的具有表面活性作用的成分，如胆酸盐，脱氧胆酸盐， 鹅脱氧胆酸盐，甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖， 脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一种或一种以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-100，其效果和以 下相同)。1. 在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪胸主动脉5cm，剥去血管外膜，将所取的猪胸主动 脉使用含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 Pg/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡2-5 次，每次2-10分钟。2. 将猪胸主动脉置入50ml无菌纯水中，在25'C水浴中浸泡6-24小时。3. 将猪胸主动脉置入50ml无菌磷脂酶溶液中，在25'C水浴中震荡处理6-24小时。(无菌磷 脂酶溶液使用碳酸盐缓冲液配制，pH值范围为8-12，磷脂酶Ai + A^50 500U/ml，磷 脂酶Bi+Bf50 500U/ml，磷脂酶C浓度为50-500 U/ml，表面活性剂牛磺胆酸钠质量百 分浓度为0.1-1%，溶血卵磷脂的摩尔浓度为10-100umol/L)。4. 将猪胸主动脉置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 P g/ml硫酸链霉素)的碳酸 盐缓冲液中，在25。C水浴中震荡冲洗3-6次，每次10-30分钟。5. 将制成的猪胸主动脉脱细胞基质在4'C和无菌条件下保存。实施例6本实施例的目的是用猪皮肤制备猪皮肤脱细胞基质。(注本实施例所用的磷脂酶溶液可以包含有磷脂酶Ai， A2， B" B2， C， D等种中的任一种或一种以上。所用的表面活性剂可 以是生物体内或人体内可以生成的具有表面活性作用的成分，如胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅 脱氧胆酸盐，甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖， 脂蛋白，溶血卵磷脂中的任一种或一种以上，也可以是聚乙二醇，TritonX-lOO，其效果和以下相同)。1. 在室温，常规无菌操作下，取下新鲜猪皮肤3x3cm2，将所取的猪皮肤使用含抗生素(100U/ml青霉素G， lOOug/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓冲液浸泡2-5次，每次2-10分钟。2. 将猪皮肤置入50ml无菌纯水中，在45'C水浴中浸泡12-24小时。3. 将猪皮肤置入50ml无菌磷脂酶溶液中，在45 。C水浴中震荡处理6-24小时。 (无菌磷脂酶溶液使用碳酸盐缓冲液配制，pH值范围为8-12,磷脂酶A一A2 =50~500U/ml，磷脂酶B!+Bf50 500U/ml，磷脂酶C浓度为50-500 U/ml，磷脂酶D浓度 为50-500 U/ml，表面活性剂脱氧胆酸钠的质量百分浓度为0.01-0.5%,,牛磺胆酸盐钠的质 量百分浓度为0.1-1%,溶血卵磷脂的摩尔浓度为10-100umol/L)。4. 将猪皮肤置入50ml含抗生素(100U/ml青霉素G， 100 p g/ml硫酸链霉素)的碳酸盐缓 冲液中，在45"C水浴中震荡冲洗3-6次，每次10-30分钟。5. 将制成的猪皮肤脱细胞基质在4'C和无菌条件下保存。实施例7实施目的本发明所制备的各种脱细胞基质，以角膜脱细胞基质的技术要求最高，不但 要满足生物相容性和机械强度要求，还要满足活体透明性要求。因此，通过本实施例——脱 细胞角膜基质的异种移植，来证实本发明所获脱细胞角膜基质在异种移植中不但满足了生物 相容性和机械强度的要求，还充分满足活体透明性的要求。以实施例1方法制备获得的猪角膜脱细胞基质为供体材料(以下称供体)，选健康新西 兰兔为受体行板层角膜移植术，氯胺酮肌注全麻后，术眼常规消毒，铺巾，开睑器开睑，做上下直肌固定缝线，用6.5mm环钻在受体角膜中央钻至约1/3角膜深度后，分离角膜前板层， 得到受体植床。供体角膜置于人工前房上，使用虹膜恢复器分离供体角膜前层(200pm)，使 用6.0环钻钻取供体植片，取供体植片置于受体植床上，以10-0尼龙线做8针间断缝合。术 毕除去上下直肌固定缝线和开睑器，复方妥布霉素眼膏涂眼。术后给予每天一次妥布霉素眼 膏涂眼。观察角膜新生血管情况，上皮化完成状况和角膜透明度改变等指标。移植后发现， 完全上皮化时间为9天，80天后植片完全恢复透明，未见角膜新生血管。无需进一步阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发 明。因此，前面的实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
权利要求
1.一种制备脱细胞基质的方法，其特征在于，包括以下步骤a.将待用组织器官预处理；b.将经过预处理的待用组织器官加入到含有磷脂酶的溶液中，通过低渗或等渗液浸泡制备脱细胞基质，其中，磷脂酶的浓度小于10000U/ml；c.洗涤制备的脱细胞基质。
2. 根据权利要求1所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的磷脂酶为磷脂酶Ap A2, B!， B2， C， D中的任一种或一种以上。
3. 根据权利要求1所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的磷脂酶的浓度范围为l-1000U/ml。
4. 根据权利要求1所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于步骤b中含有磷脂酶的溶液中还含有表面活性剂。
5. 根据权利要求1一4任一项所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于步骤b中在浸泡时进行震荡，或超声波处理。
6. 根据权利要求1一4任一项所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于步骤b中溶液的温度范围为0-56°C， pH值范围为5-12。
7. 根据权利要求4所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的表面活性剂为生物体内或人体内可以生成的具有表面活性作用的成分。
8. 根据权利要求4所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的表面活性剂为聚乙二醇，TritonX-lOO,胆酸盐，脱氧胆酸盐，鹅脱氧胆酸盐， 甘氨胆酸盐，甘氨鹅脱氧胆酸盐，牛磺胆酸盐，牛磺鹅脱氧胆酸盐，脂多糖，脂蛋 白，以及溶血卵磷脂中的任一种或一种以上。
9. 根据权利要求1所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的待用组织器官 为异种或同种异体或自体组织器官。
10. 根据权利要求9所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的待用组织器官为皮肤，心瓣膜、血管、膀胱、韧带、软骨、神经中的任一种。
11. 根据权利要求9所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于所述的待用组织器官为角膜、巩膜、结膜中的任一种或其任意组合体。
12. 根据权利要求1项所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于步骤a中所述的预处理指的是对待用组织器官进行常规清洗，消毒，分离或进行常规清洗，消毒，分离后低渗或等渗浸泡，并震荡或超声波处理。 13.根据权利要求1所述的制备脱细胞基质的方法，其特征在于步骤C中所述的洗涤 指的是使用可以包含有抗生素的生理缓冲液对所得脱细胞基质进行常规清洗。
全文摘要
本发明公开了一种利用磷脂酶制备脱细胞基质的方法，其特征在于待用组织器官预处理；待用组织器官加入到包含有磷脂酶的溶液中，在受控条件下制备脱细胞基质；洗涤制备的脱细胞基质。本发明可获得具有良好物理学性状和生物学功能的脱细胞基质，不但是组织工程的重大突破，也直接为临床疾病的治疗开拓了新途径。本发明原理可靠，工艺简易灵活，产品重现性好，极易实现产业化。
文档编号A61L27/36GK101274106SQ20081002697
公开日2008年10月1日 申请日期2008年3月24日 优先权日2008年3月24日
发明者征 武, 王智崇, 冬 陈 申请人:中山大学中山眼科中心