通过调控Shh信号通路抑制白血病干细胞更新和增殖的一种药物的制作方法

本发明涉及抗癌药物
技术领域：
，具体涉及一种通过调控shh信号通路抑制白血病干细胞更新和增殖的一种药物。
背景技术：
：莱菔硫烷（sulforaphane，sfn）是一种存在于西兰花和其它十字花科蔬菜中的异硫氰酸盐物质，具有抗增殖能力，目前研究发现sfn对卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤细胞的生长具有抑制作用，是一种新型的抗癌成分。但是，sfn对造血肿瘤细胞的作用及机制则报道较少。急性白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，白血病细胞因为增殖失控、分化障碍、凋亡受阻等机制在骨髓和其它造血组织中大量增殖，并浸润其它组织和器官，同时正常造血受到抑制。近年来研究发现在白血病患者体内除了含有大量白血病细胞外，也存在着一群比例极少的白血病干细胞（leukemiastemcells，lscs），能够自我更新、无限增殖、分化为白血病原始细胞。白血病干细胞的免疫标志有cd34+、cd38-、cd71-、hla-dr-、cd90-、cdll7-和cdl23+，且公认的cd34+、cd38-、cdl23+是lsc表面的主要标志。白血病细胞在特定条件下可逆转为lscs，lscs的多少是影响患者育后的重要因素之一。目前的观点认为白血病复发、耐药及育后不良与lscs相关。化疗仅能杀伤白血病原始细胞，而对lscs无效，这部分干细胞便是复发耐药及育后不良的根源。只有清除lscs才有可能根治白血病。在各类成人白血病中，以急性髓系白血病（acutemyeloidleukaemia，aml）发病率最高，且化疗缓解率较低。并且化疗具有严重的毒副作用，这些化疗的局限性促使研究者一直努力寻找一种更加有效、特异性更高且毒副作用低的能够替代或联合治疗白血病的药物。hedgehog信号通路与细胞的自我更新有关。正常情况下，该信号通路处于关闭状态。该信号的缺失可导致多个脏器的畸形，而其异常激活则与多种肿瘤形成有关。sonichedgehog（shh）作为hedgehog基因家族成员之一，与多种恶性肿瘤发生、发展有密切的关系，另有多项研究表明shh信号通路维持肿瘤干细胞的自我更新特性。kgla细胞来源于男性急性髓系白血病耐药的细胞株，其高表达cd34和cd123，低表达cd38，处于白血病干祖细胞早期发育阶段，其具有白血病干细胞的特征，是目前研究白血病干细胞的理想模型。本发明以不同浓度的sfn作用kg1a细胞，观察其对kg1a细胞自我更新和增殖能力的的影响，分析sfn抑制kg1a细胞增殖的作用和机制。技术实现要素：本发明解决的技术问题是提供了一种通过调控shh信号通路抑制白血病干细胞更新和增殖的药物。本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，通过调控shh信号通路抑制白血病干细胞更新和增殖的一种药物，其特征在于：该药物的功能成分为莱菔硫烷。进一步优选，所述的白血病干细胞为急性白血病干细胞kg1a。本发明首次探讨了sfn对急性白血病干细胞kg1a的自我更新和增殖的作用，结果表明sfn通过调控shh信号通路抑制急性白血病细胞的自我更新和增殖，这不仅是理论上的突破，而且具有潜在的临床意义，sfn可以作为一种治疗白血病的潜在候选药物，为急性白血病的治疗提供了新的思路。附图说明图1是sfn作用kgla细胞后对cd34+/cd38-、cd34+/cdl23+和cdl23+/cd38-表达影响图；图2是sfn作用kgla细胞后对kgla细胞增殖能力影响图；图3是sfn作用kgla细胞不同时间对kgla细胞增殖能力影响图；图4是sfn作用kgla细胞后对kgla细胞自我更新与增殖能力影响图；图5是qpcr技术检测sfn作用kgla细胞后shh信号通路中的正向调控因子shh、smo和gli1变化图；图6是westernbloting技术检测sfn作用kgla细胞后shh信号通路中的正向调控因子shh、smo和gli1变化图。具体实施方式以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。实施例实验材料：莱菔硫烷（批号28911701）购自美国lktlaboratories公司，纯度98%。1640培养液和胎牛血清为美国gibco公司产品。cck-8试剂盒购自日本dojindo公司，pemouseanti-humancd34、fitcmouseanti-humancd123和apcmouseanti-humancd38为美国bd公司产品，甲基纤维束细胞克隆培养基为美国干细胞公司，rna提取试剂盒、逆转录试剂盒、superrealpremax（sybrgreen）购自上海天根生物公司，兔抗人shhmab、smomab、gli1mab均为美国abcam公司产品，抗人gapdhpab，及hrp-羊抗兔pab为世纪康为公司提供。流式细胞仪（facscaibur型）为美国bd公司产品，mk3酶标仪、abi7300型实时荧光定量pcr仪和nd2000超微量分光光度计系美国thermo公司产品，凝胶图像分析系统由英国genegenius公司生产，流式细胞仪为美国bd公司。eclipseti-s倒置显微镜购自日本nikon公司，为美国thermal公司产品。实验步骤：1、细胞培养人急性髓系白血病细胞kgla细胞株由本室保存，以含10wt%胎牛血清rpmi1640培养基培养，培养基中预先加入青霉素l00u/ml、链霉素100ug/ml、谷氨酰胺100μmol/l，置于体积分数为5%的co2培养箱中于37℃培养，根据细胞生长状态及时换液传代，取对数生长期细胞做后续试验。2、流式分析收集对数生长期细胞，1500r/min离心5min，pbs洗涤3次，用1mlpbs重悬细胞，计数，取50ul细胞悬液，加入cd38apc1ul、cd123fitc1ul、cd34pe1ul，避光反应20min，用pbs洗掉未反应的荧光，加入500ulpbs重悬细胞，每管获取10000个细胞，用cellquest分析软件分析。3、细胞增殖实验将传代培养的对数生长期kg1a细胞，计数，按照每孔细胞密度为1×105/l接种于96孔培养板内，分别加入终浓度分别为0、2、4、6、8、10、12μmol/l的sfn（0.9%ns溶解稀释为2×103μmol/l），37℃培养24h、48h、72h后，每孔加入cck-8试剂10ul继续孵育4h，在酶联免疫检测仪od值为450nm处测量各孔的od值，实验重复3次，取平均值。细胞相对存活率=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%。同时，在光学显微镜下观察拍照。根据kg1a细胞存活率，绘制细胞生长曲线，选取合适sfn浓度做后续实验。4、肿瘤球实验将甲基纤维素细胞克隆形成培养基放在4℃冰箱中过夜，次日取出，摇动混匀，分别取出3ml培养基放置于离心管中，将对数生长期细胞用pbs洗涤，按照1×10³cells/ml浓度接种至甲基纤维素细胞培养集中.震荡混匀后，移至培养皿中，置于体积分数为5%的co2培养箱中于37℃继续培养。7天后观察细胞的集落数和集落大小，显微镜下拍照。5、westernbloting分析shh的蛋白收集对数生长期细胞，用冰预冷的sds裂解缓冲液溶解20min，12000×g离心15min，抽提蛋白，bca蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白含量，蛋白上样量为30μg，10wt%sds-page电泳；电转到pvdf膜，5wt%的脱脂奶粉封闭，1:1000一抗4℃过夜，tbst洗膜3次之后，1:5000二抗室温2h，再用tbst洗涤3次，ecl化学发光液显影拍照。用imagej对实验结果进行分析。7、qpcr检测smo、gli1和shh的mrna表达收集对数生长期细胞，用trizol法提取总rna，用核酸蛋白定量仪检测rna纯度和浓度，纯度在1.8-2.0之间，浓度在1-3μg/μl。用逆转录试剂盒进行逆转录合成cdna，转录体系为20ul。shh(f)5’-cgcacctgctctttgtgg-3’，(r)5’-ggagcggttagggctactct-3’；smo(f)5’-tcgctaccctgctgttattc-3’，(r)5’-gacgcaggacagagtctcat-3’；gli1(f)5’-ctggatcggataggtggtct-3’，(r)5’-cagaggttgggaggtaagga-3’；bata-actin为内参基因。pcr反应条件：95℃预变性1min，按95℃5s、55℃30s和72℃延伸1min进行40个循环。扩增结束后，产物从60℃加热至95℃反应20min，以确定pcr产物的特异性，2-∆∆ct作为目的基因的相对表达量。实验结果：表1sfn对kg1a细胞cd34、cd38和cd123表达的影响cd34+cd38-cd34+cd123+cd123+cd38-作用前97.72%78.37%79.2%作用后79.81%*6.14%*3.2%**与作用前相比，p<0.051、流式细胞仪检测结果显示kg1a细胞中富含白血病干细胞，cd34+/cd38-占97.72%，cdl23+/cd38-占79.2%，是一种符合研究白血病干细胞的细胞株。利用8μmol/l的sfn作用于kg1a细胞后发现cd34+/cd38-、cd34+/cdl23+和cdl23+/cd38-的表达明显下降（图1）。表1显示sfn作用于kg1a细胞后cd34+/cd38-、cd34+/cdl23+和cdl23+/cd38-的表达明显下降，与sfn作用前相比*p﹤0.05。2、利用细胞增殖实验cck8试剂盒检测发现sfn具有抑制kg1a细胞增殖的作用，并且kg1a细胞的增殖能力随着sfn浓度和作用时间的增加逐渐呈下降趋势（图2）。在光学显微镜下观察细胞增殖能力也符合以上结果，8μmol/l的sfn作用于kg1a细胞后，随时间延长kg1a细胞的数量减少（图3）。3、细胞克隆实验显示kg1a细胞在甲基纤维素细胞克隆培养基上可以形成集落的能力，进一步说明kg1a细胞的干细胞特性，具有不断的自我更新和增殖能力，利用sfn进行干预后，发现kg1a形成的集落数数和肿瘤球的体积受到抑制（图4）。4、利用qpcr和westernbloting技术检测8μmol/l的sfn作用于kg1a细胞后，shh信号通路中的正向调控因子shh、smo和gli1出现下调现象，实验结果重复三次，*p﹤0.05（图5和图6）。以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。sequencelisting<110>新乡医学院<120>通过调控shh信号通路抑制白血病干细胞更新和增殖的一种药物<130>2017<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>rna<213>人工序列<400>1cgcacctgctctttgtgg18<210>2<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1ggagcggttagggctactct20<210>3<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1tcgctaccctgctgttattc20<210>4<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1gacgcaggacagagtctcat20<210>5<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1ctggatcggataggtggtct20<210>6<211>20<212>rna<213>人工序列<400>1cagaggttgggaggtaagga20当前第1页12