一种脱钙骨基质骨修复材料的制备方法与流程

本发明涉及骨组织生物材料，具体涉及一种脱钙骨基质骨修复材料的制备方法。

背景技术：

随着我国人口老年化，脊柱退行性变融合手术和关节翻修手术病例日益增多，此外，由创伤、骨质疏松症、骨肿瘤或骨病所造成的骨缺损病例较多，这些病患需要大量骨组织修复填充材料。骨修复材料的社会需求量日益增多，自体骨无法满足用量要求，并且存在增加病患疼痛、同种异体骨免疫排斥反应较严重等问题。因此，近年来兴起的组织工程骨已经成为解决骨修复材料问题的研究热点。

脱钙骨基质(decalcifiedbonematrix，dbm)是通过一系列化学方法对骨进行脱钙、去脂和去非胶原蛋白成分等处理得到的产物。dbm具有良好骨传导和骨诱导性能，免疫排斥反应较低，已经被广泛应用于骨科、神经外科和牙科等领域。dbm分为块状和粉末状，块状dbm可塑形性差，而dbm粉也存在聚合性差及术中不宜填充操作缺点，以及植入骨缺损部位的dbm粉容易被流动体液带离原部位。因此，dbm粉需要合适的支架承载，市面上已有羟基磷灰石、透明质酸钠、壳聚糖等材料承载的dbm复合骨修复替代产品。良好骨修复材料需在一定时间范围内完成骨修复过程，达到骨愈合目的，而富含bmp等多种成骨因子的dbm粉既可发挥生物活性成分作用，又可作为具备骨传导的支架材料之一。

海藻酸盐作为一种天然高分子材料，具有生物相容性好、高吸湿性和多空隙结构等特点，是组织工程领域备受关注的特殊生物材料。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种脱钙骨基质骨修复材料的制备方法。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种脱钙骨基质骨修复材料的制备方法，包括以下步骤：

1)将海藻酸盐加入到ph为6～9的磷酸盐缓冲液中，搅拌混合均匀，得到重量体积比为0.5～3％的海藻酸盐溶液；

2)将脱钙骨基质粉加入到海藻酸盐溶液中，充分搅拌，制成脱钙骨基质粉浓度为20～100mg/ml的混悬液，置于4℃保存备用；

3)用双蒸水制备重量浓度为0.5～3％的cacl2溶液，将步骤2)中的混悬液置于模具中，向混悬液中滴加cacl2溶液，直到混悬液发生胶凝，然后静置1～3小时后从模具中取出条状凝胶；

4)将条状凝胶进行冷冻干燥，即得。

优选地，步骤1)中，所述磷酸盐缓冲液的ph为7。

优选地，所述海藻酸盐溶液的重量体积比为1％。

优选地，步骤2)中，所述混悬液中脱钙骨基质粉的浓度为25mg/ml。

优选地，步骤3)中，cacl2溶液的重量浓度为2％。

优选地，所述冷冻干燥的程序为：先-80℃深低温冷冻12h，再立即转入真空冷冻干燥仪，设置温度为-50℃，抽真空状态持续6h后取出。

与现有骨缺损修复材料技术相比，本发明具有以下有益效果：

1)本发明制备工艺流程简便，没有添加其他具有氧化性、毒性和排斥反应等不易于生物相容性的化学成分，随着海藻酸盐在体内逐步降解，以及诱导骨组织成分的形成，病灶部位将快速以脱钙骨基质为支架形成新骨，达到骨修复和填充的目的。

2)本发明既保留了脱钙骨基质粉良好的骨诱导和骨传导性能，用海藻酸盐天然支架材料承载脱钙骨基质粉，有效解决了脱钙骨基质粉不易在骨填充部位保持固定形态的缺陷问题。

3)本发明所用海藻酸盐成分在低温冷冻干燥过程中能形成大量孔隙结构，具备良好的溶胀膨量和降解性能，利于骨髓间充质干细胞向成骨分化，可作为组织工程骨支架材料。

4)本发明所述方法可通过体外模具成型或裁剪等方式解决修复不规则骨缺损问题。

附图说明

图1是脱钙骨基质骨修复材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化的试验结果。

图2是脱钙骨基质骨修复材料促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因alp和ocn的表达的蛋白印迹实验检测结果。

图3是脱钙骨基质骨修复材料的肌肉包埋异位成骨x线检测结果。

图4是脱钙骨基质骨修复材料的颅骨缺损模型修复实验结果。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行详细地说明。

各实施例中所使用的脱钙骨基质均由湖北联结生物材料有限公司提供，其制备方法如下：取sd大鼠四肢长骨骨干，去掉干骺端及骨膜，取皮质骨，在冰上研磨粉碎，分别经1000μm和100μm不锈钢筛筛除＞1000μm和＜100μm的骨粉，得到直径为100μm-1000μm鼠骨粉，对骨粉进行一系列脱脂、脱钙、去免疫非胶原蛋白处理，即得。

实施例1

1)将海藻酸钠1g加入到ph为7的磷酸盐缓冲液100ml中，搅拌混合均匀，得到重量体积比为1％的海藻酸钠溶液；

2)将脱钙骨基质粉加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌，制成脱钙骨基质粉浓度为25mg/ml的混悬液，置于4℃保存备用；

3)用双蒸水制备重量浓度为2％的cacl2溶液，将步骤2)中的混悬液置于圆筒形的模具中，向混悬液中缓慢滴加cacl2溶液，直到混悬液发生胶凝(cacl2溶液的加入量为混悬液体积的3.5％)，然后静置1小时后从模具中取出条状凝胶；

4)将条状凝胶进行冷冻干燥，所述冷冻干燥的程序为：先-80℃深低温冷冻12h，再立即转入真空冷冻干燥仪，设置温度为-50℃，抽真空状态持续6h后取出，即得条状骨修复材料。

本步骤所得材料可根据实际应用进一步裁剪后使用，填充不规则骨缺损。

实施例2

1)将海藻酸钠0.5g加入到ph为6.5的磷酸盐缓冲液100ml中，搅拌混合均匀，得到重量体积比为0.5％的海藻酸钠溶液；

2)将脱钙骨基质粉加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌，制成脱钙骨基质粉浓度为20mg/ml的混悬液，置于4℃保存备用；

3)用双蒸水制备重量浓度为1％的cacl2溶液，将步骤2)中的混悬液置于模具中，向混悬液中滴加cacl2溶液(cacl2溶液的加入量为混悬液体积的5％)，直到混悬液发生胶凝，然后静置2小时后从模具中取出条状凝胶；

4)将条状凝胶进行冷冻干燥，即得。

实施例3

1)将海藻酸钠2g加入到ph为8的磷酸盐缓冲液100ml中，搅拌混合均匀，得到重量体积比为2％的海藻酸钠溶液；

2)将脱钙骨基质粉加入到海藻酸钠溶液中，充分搅拌，制成脱钙骨基质粉浓度为50mg/ml的混悬液，置于4℃保存备用；

3)用双蒸水制备重量浓度为3％的cacl2溶液，将步骤2)中的混悬液置于模具中，向混悬液中滴加cacl2溶液，直到混悬液发生胶凝，然后静置1小时后从模具中取出条状凝胶；

4)将条状凝胶进行冷冻干燥，即得。

实施例4

1)将海藻酸钠1.5g加入到ph为7.5的磷酸盐缓冲液100ml中，搅拌混合均匀，得到重量体积比为1.5％的海藻酸盐溶液；

2)将脱钙骨基质粉加入到海藻酸盐溶液中，充分搅拌，制成脱钙骨基质粉浓度为30mg/ml的混悬液，置于4℃保存备用；

3)用双蒸水制备重量浓度为0.5％的cacl2溶液，将步骤2)中的混悬液置于模具中，向混悬液中滴加cacl2溶液，直到混悬液发生胶凝，然后静置2小时后从模具中取出条状凝胶；

4)将条状凝胶进行冷冻干燥，即得。

试验例

1.脱钙骨基质骨修复材料的表征

1.1电镜观察：电镜观察结果表明，本发明制备的脱钙骨基质骨修复材料呈疏松孔隙结构，脱钙骨基质粉均匀分布在海藻酸表面积内部。

1.2溶胀膨量试验：将本发明制备的骨修复材料置于pbs中，在4、8、12、16小时时间点取出，电子秤称量，计算溶胀率(％)，溶胀率可代表复合材料吸水性的强弱和材料空隙结构大小，溶胀率越高，则材料吸水性越强。计算公式如下：

溶胀率＝(w2-w1)/(w1)％

w1＝复合物质量(溶胀前)

w2＝复合物质量(溶胀后)

溶胀膨量试验结果表明，本发明制备的骨修复材料在pbs中16小时的溶胀率可达到20％。

1.3体外降解速率：体外降解速率测定是组织工程材料的重要表征手段之一，可模拟体复合材料内生理环境或组织酶降解环境中的降解情况。将复合材料置于磷酸盐缓冲液(pbs)和胶原蛋白酶中，在1、3、6、9、12、15天时取出复合材料，干燥后称量，计算每个时间节点的剩余质量，即代表降解率。

剩余质量(％)＝(w1-w2)/(w1)％

w1＝复合物质量(降解前)

w2＝复合物质量(溶胀后)

体外降解实验表明，本发明制备的骨修复材料在磷酸盐缓冲液中15天内的降解速率均小于15％。在胶原蛋白酶中的降解速率快于pbs中降解速率，其中实施例1在15天内可完全被胶原蛋白酶降解，实施例2在15天时可被胶原蛋白酶降解30％左右，实施例3在15天内可被胶原蛋白酶降解40％左右，实施例4在15天内可被胶原蛋白酶降解40％左右。

2复合材料与细胞培养实验结果

2.1细胞毒性实验:细胞毒性实验是检测复合材料是否有细胞毒性的重要指标，本试验例中采用mtt比色法，提取培养sd大鼠骨髓间充质干细胞，将骨修复材料与细胞共培养12、24、36、48小时，加入mtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h，终止培养，小心吸去孔内培养液，加入二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，将二甲基亚砜处理后的细胞上清液转移至96孔板。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光度值。同时设置调零孔(培养基、mtt、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、mtt、二甲基亚砜)。吸光度值越大，表明细胞活性越强，吸光度值越小，表明复合材料对细胞的毒性越大。mtt实验结果表明，本发明制备的脱钙骨基质骨修复材料没有细胞毒性作用。

2.2复合材料可促进骨髓间充质干细胞成骨分化：alp染色、茜素红染色和vonkossa染色是检测干细胞成骨分化能力的重要指标，alp染色越深，茜素红及vonkossa染色显示的钙结节越多，表明细胞成骨分化现象越明显。本试验例中，将本发明制备的脱钙骨基质骨修复材料(adbm组)、市售脱钙骨基质粉(dbm组)与骨髓间充质干细胞培养9天，经alp染色、茜素红染色及vonkossa染色结果显示，alp染色深度adbm组＞dbm组＞对照组，茜素红染色及vonkossa染色显示钙结节数目adbm组＞dbm组＞对照组，差异有统计学意义，因此，本发明制备的脱钙骨基质骨修复材料和市售脱钙骨基质粉均能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，高于空白对照组，并且本发明制备的骨修复材料促进骨髓间充质干细胞的作用强于市售脱钙骨基质粉。(图1)

2.3复合材料可促进骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因表达：alp和ocn基因是参与干细胞成骨过程的重要基因，本发明制备的脱钙骨基质骨修复材料、市售脱钙骨基质粉(作为阳性对照)处理骨髓间充质干细胞9天后，采用蛋白印迹实验检测alp和ocn基因的蛋白表达水平，灰度值比越高，表明蛋白表达水平越高，结果表明adbm、dbm处理组细胞的alp和ocn基因蛋白表达水平均高于对照组，并且adbm组的alp和ocn基因蛋白表达水平高于dbm组，表明本发明制备的脱钙骨基质骨修复材料能促进骨髓间充质干细胞成骨基因表达，且其成骨能力优于单纯脱钙骨基质粉。(图2)

3动物实验结果

3.1肌肉包埋实验结果：将同等质量的adbm与dbm分别植入sd大鼠背部肌肉袋中，3个月后取标本行x线检查，结果表明，adbm组异位成骨量高于dbm异位成骨量，表明adbm成骨性能更好，以及adbm在成骨方面比单纯植入dbm粉可能更加节约所需要的脱钙骨基质的量。(图3)

3.2sd大鼠颅骨缺损修复实验：在sd大鼠颅骨左侧造4mm直径的圆形骨缺损模型，剥离周围骨膜，实验分为三组:空白对照组(不植入任何材料)、dbm组和adbm组，3个月后取sd大鼠颅骨，行x线检测及microct检测，结果显示adbm组大鼠颅骨缺损部位出现新生骨，颅骨缺损被部分修复，adbm组(14.1±6.9mm²)颅骨剩余缺损面积小于dbm组(36.3±4.7)和空白造模组(45.6±5.8mm²)，这表明本试验的复合材料在动物体内具备骨修复能力，并且修复颅骨缺损作用强于dbm组。(图4)

4.结果分析

首先，对本发明制备的脱钙骨基质骨修复材料(adbm)进行了一系列材料表征测试，电镜检测表明，该复合材料具备疏松空隙结构，溶胀试验表明该材料对磷酸盐缓冲液可产生超过20％吸湿性，体外模拟降解实验表明，复合材料的支架成分(海藻酸盐)可被胶原蛋白酶降解，而脱钙骨基质成分不易被完全降解。因此，体外表征实验表明该复合物作为骨填充修复材料可被体内生理环境液体渗透，利于体内成骨分化相关细胞的长入。

其次，将本发明制备的复合物材料与骨髓间充质干细胞共培养，mtt结果表明该材料无细胞毒性，能促进骨髓间充质干细胞成骨分化及相关基因表达。人体骨髓及其周围组织中存在大量骨髓间充质干细胞，干细胞首先向成骨细胞分化，并产生大量的钙盐沉积，部分成骨细胞继而分化为骨细胞，从而参与人体骨缺损部位修复过程。因此，该复合物材料可能通过促进肝细胞成骨分化而产生骨修复作用。

最后，将本发明制备的复合物材料植入大鼠背部肌肉，发现该材料具备异位成骨能力，并且成骨能力优于单纯脱钙骨基质粉，这可能是因为，第一，该复合物材料具备空隙结构，利于体液及细胞与复合物材料中的脱钙骨基质粉接触；第二，该复合物材料能保持固定形态，而脱钙骨基质粉呈粉末状，一方面复合物材料在植入过程中比粉末状脱钙骨基质粉容易操作，另一方面复合物材料一旦植入体内，则不易被体液循环分散，而粉末状脱钙骨基质则不能耐受体液及肌肉运动对其产生的分散作用。