无外源支架血管化组织工程骨及其制备方法与流程

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种由成骨细胞膜片和成血管内皮细胞膜片构建的无外源支架血管化组织工程骨及其制备方法。

背景技术：

严重创伤、肿瘤切除、感染、先天性畸形等所造成的大块骨缺损的治疗是现代医学面临的难题和巨大挑战,一直是人类几个世纪以来不断深入研究和探索的重要课题。目前临床上常用的修复手段有自体骨移植、异体骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷。自体骨移植是公认的骨组织修复的金标准，但是患者要经受自体组织移植手术的创伤，而且供区有限，因此，自体骨移植不能视为理想的大面积骨缺损的修复方法；异体骨移植存在免疫排斥反应、疾病传播等风险，有时甚至危及病人生命；人工骨植入容易导致异物排斥反应、感染等。因此,有必要寻找一种新的大块骨缺损的修复手段。

在此情况下，组织工程学的兴起和发展,为骨缺损的修复提供了新的可能，为弥补目前骨缺损治疗方法的缺陷带来了希望。

近年来,骨组织工程的研究取得了很大进展,应用组织工程技术在小型哺乳动物体内构建骨组织,修复小尺寸的骨缺损的方法已基本成熟，但是对于大型哺乳动物大范围或受区血供不佳的骨缺损，由于移植物早期没有独立的血液供应，营养渗透不足，骨痂形成缓慢等原因，成骨效果仍不稳定。有研究表明,决定和制约组织工程骨修复骨缺损疗效的关键是其在体内血管化的速度和程度。sahota等也认为组织工程植入物失败的主要原因在于血管化的迟滞。因此，如何建立有效的血液供应,在体内构建能及时血管化的组织工程骨,缩短骨愈合时间是目前骨组织工程研究的一个重要方向，也是制约组织工程骨大规模临床应用的关键。

目前组织工程骨的血管化策略主要包括：支架的设计开发、应用生长因子、体内埋植、体内动脉小室和整体培养系统等。尽管这些方法在一定程度解决了组织构建时的血管化问题，但均存在不足。比如，在支架的制作过程中，对材料内部的孔隙大小和相互连接进行修饰,可有利于血管网的长入，但存在炎症反应、潜在的免疫原性风险等,而且血管化速度不理想；促血管生长因子应用时存在调控问题，生长因子在体内半衰期较短,大剂量应用又有致畸可能，并且可能加速某些病理过程，如血管瘤的发生等；体内埋植和体内动脉小室均需二次手术，供体选择困难，有潜在的疾病传播风险等，限制了临床应用；整体培养系统为完善的“人造器官”，但技术难度高，实现困难。

近年，国内外研究人员通过血管内皮细胞与成骨细胞联合培养的技术方法，构建出血管化组织工程骨，即可形成骨组织又可同时血管化。但传统的“细胞－支架”策略的不足之处在于：种子细胞在种植到支架材料的过程中，有30-40％的细胞不能粘附于支架而流失，细胞附着率低、利用率差；细胞之间相互作用少，难以形成体内细胞应有的微环境，细胞支架复合物植入体内后，骨形成总是发生在支架的外周，影响成骨的大小和质量。为了解决上述问题，人们研究出细胞膜片技术。它是通过体外对细胞进行高密度培养,使细胞生长成为多层并分泌大量细胞外基质,形成由细胞和细胞外基质构成的细胞膜片。细胞膜片技术应用于组织工程中主要有三方面优势:一、膜片的形成能够减少组织构建过程中细胞的流失和损伤,提高细胞利用率；二、细胞膜片具有一定的机械强度,能够在无支架的情况下进行组织构建,避免了支架材料引起的组织相容性问题,且易于操作、价格低廉；三、丰富的细胞外基质为细胞提供适合的生长环境,并在发育过程中储存和激活生长因子,为组织的发育提供结构和功能帮助。所以，如能将成骨细胞膜片联合内皮细胞膜片，通过合适的方法构建血管化组织工程骨，预计将较成骨细胞与内皮细胞共培养更具血管化和成骨优势。

脂肪间充质干细胞(adipose-derivedstemcells，adscs)是存在于脂肪组织中的成体干细胞。与骨髓间充质干细胞相似，具有向成脂肪、成软骨、成骨、成肌细胞和神经源细胞等分化的多分化潜能,是一种理想的种子细胞。与骨髓间充质干细胞相比，存在来源广泛、获取方式简单，培养要求低，体外扩增能力强，增殖时间短，对机体创伤小等优点，有望成为组织工程更为理想的细胞来源。目前，脂肪来源间充质干细胞已广泛应用于组织再生与修复。scherberich等利用脂肪间充质干细胞来源的内皮细胞及成骨细胞复合三维多孔陶瓷支架植入到裸鼠体内，8周后可观察到血管化组织工程骨形成。papadimitropoulos等利用脂肪来源的内皮细胞，成骨细胞及外周血来源cd14+破骨细胞复合三维多孔陶瓷支架也得到了相似的结论。然而，外源性支架材料的植入可能会对宿主产生炎症、排异等免疫反应，并且“细胞-支架”构建体系中缺乏细胞外基质参与，而细胞外基质在促进内皮细胞形成血管过程中起到至关重要的作用。细胞膜片技术可以弥补这一缺陷，该技术无需胰酶消化细胞，利用细胞间连接相连成片，保留了细胞间及细胞表面蛋白，利用细胞自分泌外基质作为支架，无需外源性支架材料。虽然血管化组织工程骨的构建已有很多的研究，但是利用脂肪来源的成骨细胞和内皮细胞，制备具有成骨和成血管能力的双细胞复合膜片来构建血管化组织工程骨的策略却还很少有人涉及。

技术实现要素：

本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种利用干细胞及细胞膜片技术构建的具有良好的成骨和成血管能力，且细胞来源丰富，易于分离获取，对供体创伤小，培养要求低，有效避免对宿主产生炎症、排异等免疫反应的无外源支架血管化组织工程骨。

本发明的另一目的是提供上述无外源支架血管化组织工程骨的制备方法。

为实现本发明目的所采取的技术方案为：

一种无外源支架血管组织工程骨，其特征在于其是由上层成血管内皮细胞膜片和下层成骨细胞膜片构成。

上述用于制备所述成血管内皮细胞膜片的内皮细胞和用于制备成骨细胞膜片的成骨细胞均来源于脂肪间充质干细胞。

上述无外源支架血管组织工程骨的制备方法，其特征在于其工艺包括：

1)成骨细胞膜片的制备

将第三代或第四代脂肪间充质干细胞先用胰蛋白酶消化至绝大部分细胞变圆，从瓶底脱落，然后用dmem/f12培养基终止消化，按1×10⁶～3×10⁶个/cm²的密度接种至培养皿中，加入含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基上，置于37℃，5％co2恒温培养箱中培养24～48h，然后再用成骨细胞诱导培养液培养10～14天即可；

2)成血管内皮细胞膜片的制备

取第三代或第四代脂肪间充质干细胞按2×10⁶～4×10⁶个/cm²的密度接种于含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基中培养24～48h，然后再用血管内皮细胞诱导液持续培养10～14天即可；

3)无外源支架血管化组织工程骨的构建

将上述过程2)所得的成血管内皮细胞膜片折叠，平铺在上述过程1)所得的已经折叠好的成骨细胞膜片上，静置5min，期间间断滴加含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基，最后折叠卷曲成类圆柱体。

上述过程1)中，所述成骨细胞诱导培养液组成为：dmem/f12培养基170～180ml，胎牛血清17～22ml，双抗(青霉素、链霉素)1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗坏血酸550～580ul，β-甘油磷酸钠2～3ml，地塞米松15～25ul。

上述过程1)中，用成骨细胞诱导培养液培养时，隔日换液培养。

上述过程2)中，所述血管内皮细胞诱导液组成为：内皮细胞生长培养基(egm-2)90～110ml，胎牛血清4.5～5.5ml,维生素c0.09～0.11ml,庆大霉素-两性霉素b(ga-1000)0.09～0.11ml,氢化可的松(hydrocortisone)0.036～0.044ml,人表皮生长因子(hegf)0.09～0.11ml,人成纤维细胞生长因子(hfgf-b)0.45～0.55ml,类胰岛素一号增长因子(igf-i)0.09～0.11ml,血管内皮细胞生长因子(vegf)0.09～0.11ml。

上述过程2)中，用血管内皮细胞诱导液培养过程中，隔2-3天换液培养。

本发明依据材料优化设计的思想，充分借鉴干细胞及细胞膜片技术和骨组织发育过程技术，利用兔脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能的特性，将其诱导分化，制备了具有成骨能力及成血管能力的双细胞膜片，并用该双细胞膜片构建血管化组织工程骨。此构建策略细胞来源丰富，易于分离获取，对供体创伤小，不违背伦理学原则，培养要求低；构建血管化组织工程骨所需成骨细胞、内皮细胞均来自于脂肪间充质干细胞，无需额外添加不同来源的内皮细胞；利用细胞自分泌细胞外基质作为“内源性支架”，无需额外添加外源性支架材料，避免了机体免疫排异及炎症反应。本发明的无外源支架的血管化组织工程骨制备方法简单，条件温和，具有良好的成骨和成血管性能，符合生物体内应用的要求，作为一种新型血管化组织工程骨具有良好的应用前景。

本发明的无外源支架血管化组织工程骨构建了一种创新性的血管化组织工程骨的思路和方法，为理想的血管化组织工程骨的开发以及大块骨缺损的再生治疗提供实验基础和理论依据，尤其是脂肪干细胞诱导的双细胞膜片的提出与试验，因操作技术相对简单、成本较低、创伤小以及成骨和血管化效果较好，使血管化组织工程骨的应用具有更广阔的前景，以满足修复各种临床硬组织缺损的需要。

将本发明的无外源支架血管化组织工程骨移植至免疫缺陷的裸鼠背部皮下。术后分别进行大体观察、扫描电镜(sem)及组织形态学分析等检测其异位成骨的能力和对血管再生的影响。结果表明：he染色，第8周组织中形成微血管，膜片融合。第12周，组织变致密，微血管变少。masson染色：第12周绿染中出现红染区域，b组最明显。sem结果显示：第12周，a组纤维分层生长排布疏松；b组纤维分层生长排布紧密；c组组织完全融合；d组可见疏松的纤维内有大量血管走行。上述结果充分说明：无外源支架双细胞膜片复合体具备良好的成骨、成血管性能。

附图说明

图1为成骨细胞膜片(左)和内皮细胞膜片(右)的实物图；

图2为成骨细胞膜片(左)和内皮细胞膜片(右)的he染色图；

图3为成骨细胞膜片(左)和内皮细胞膜片(右)的sem图；

图4为双细胞膜片构建的血管化组织工程骨动物体内移植8周观察图；

图5为a组移植8周(左)和12周(右)he染色，黑箭头示血管(×400)；

图6为a组移植8周(左)和12周(右)(×500)的扫描电镜图。

具体实施方式

下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。

一、利用兔adscs(脂肪间充质干细胞)诱导分化分别构建成骨细胞膜片、成血管内皮细胞膜片及表征

(1)主要试剂

alarmarblue(上海，翊圣)，ascrobicacid(北京索莱宝生物科技有限公司)，directred80(美国sigma)，dmem/f-12、pbs、fbs(美国hyclone)。

(2)仪器与设备

infinitem200pro酶标仪(瑞士，nanoquan)，h-7650透射电子显微镜(日本，hitachi)，s-3400n扫描电子显微镜(日本，hitachi)，偏光显微镜dm2500p(德国，leica)，正置荧光显微镜bx-511250ccd(日本，olympus)，co2培养箱(heraeus公司，德国)。

(3)实验方法

①成骨细胞膜片的制备

将增殖状态良好的第四代adscs(脂肪间充质干细胞)常规用1％胰蛋白酶消化，至绝大部分细胞变圆，从瓶底脱落，然后用dmem/f12培养基终止消化。调整细胞密度至1×10⁶～3×10⁶个/cm²，接种于预先用1％明胶包被的培养皿中，加入含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基，置于37℃，5％co2恒温培养箱中培养，24～48h后更换为成骨细胞诱导培养液(dmem/f12培养基170～180ml，胎牛血清17～22ml，双抗(青霉素、链霉素)1.7～2.7ml，谷氨酰胺2～3ml，抗坏血酸550～580ul，β-甘油磷酸钠2～3ml，地塞米松15～25ul)，隔日换液一次，观察膜片的形成过程和形成情况，持续培养10～14天，皿底可见半透明乳白色薄膜样物，膜内有多个白色大小不等的结节时，用细胞刮刀轻轻刮擦，使膜状物与皿底分离，可获得成骨细胞膜片。

②成血管内皮细胞膜片的制备

取第三代或第四代脂肪间充质干细胞按2×10⁶～4×10⁶个/cm²的密度接种于含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基中培养24～48h，后更换成血管内皮细胞诱导液(内皮细胞生长培养基(egm-2)90～110ml，胎牛血清4.5～5.5ml,维生素c0.09～0.11ml,庆大霉素-两性霉素b(ga-1000)0.09～0.11ml,氢化可的松(hydrocortisone)0.036～0.044ml,人表皮生长因子(hegf)0.09～0.11ml,人成纤维细胞生长因子(hfgf-b)0.45～0.55ml,类胰岛素一号增长因子(igf-i)0.09～0.11ml,血管内皮细胞生长因子(vegf)0.09～0.11ml)，观察记录细胞形态变化，隔2-3天换液。持续培养14天，可获得内皮细胞膜片。

③细胞膜片的表征

将获得的细胞膜片进行组织学、扫描电镜、透射电镜及特殊染色检测。4％多聚甲醛固定膜片，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片厚度5μm，脱蜡至水，分别行h&e、alp染色、茜素红和vonkossa组织学染色、膜片活性检测等。h&e染色：切片置于苏木素中浸染5min，盐酸酒精中分色30秒，自来水冲洗，伊红1min，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察膜片组织结构。vonkossa染色：滴染5％硝酸银，日光或紫外光曝晒10min，蒸馏水洗涤，5％硫代硫酸钠溶液滴染2min，蒸馏水漂洗，l％中性红衬染10min，充分水洗，酒精系列脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察。选取部分膜片，2％戊二醛4℃前固定2h后，换0.1m二甲砷酸钠缓冲液三次，每隔2h换一次(4℃)，过夜，1％锇酸4℃后固定2h，0.1m二甲砷酸钠缓冲液冲洗两次，每次15min，30％、50％、70％、80％、90％、100％酒精梯度脱水，分别行sem及tem检测膜片表面形貌及内部超微结构。

④结果

结果显示，成骨、成血管内皮细胞膜片均呈半透明，乳白色，可自皿底整片提起；镜下观察成骨、成血管内皮细胞膜片均似“薄纱样”，二者膜片下均可见皿底贴附一层细胞，说明细胞膜片活性良好。he染色可见成骨、成血管内皮细胞膜片由复层细胞和丰富的细胞外基质构成，膜片两侧均分布有细胞。天狼猩红饱和苦味酸染色，光镜下可见大面积红染，说明成骨、成血管内皮细胞主要表达胶原纤维。tem结果显示,成骨细胞膜片，胞内胞外均可见“针状”或“结节状”钙盐结晶。内皮细胞膜片胞质内可见内皮细胞的特征结构w-p小体形成。sem结果显示成骨细胞膜片细胞、基质相互交融，膜片表面有大量“蜂窝样”矿化结节。膜片活性检测结果显示：成骨细胞膜片与内皮细胞膜片活性差异无统计学意义(t＝0.83，p>0.05)，说明进行用此方法获得的成骨、成血管内皮细胞膜片具备一定活性，且二者活性一致。成骨细胞膜片特异性检测von-kossa染色可见膜片被染成棕褐色，说明膜片存在矿化现象。内皮细胞膜片阳性表达cd31细胞表面分子，说明膜片内含有大量cd31+细胞。

二、双细胞膜片构建无外源支架的血管化组织工程骨以及动物体内异位移植实验

(1)主要试剂

速眠新ii注射液(吉林，圣达)，苏3号注射液(吉林，圣达)，powerdryhetoll3000真空冷冻干燥机(美国thermofisher)，其余试剂均为分析纯。

(2)仪器与设备

shz-d(iii)循环水式真空泵(巩义，予华)。

(3)实验方法

①双细胞膜片(doublecellsheet,dcs)复合体构建血管化组织工程骨

将培养好的内皮细胞膜片轻轻用细胞刮刀刮起一侧，使膜片与皿底完全分离，用镊子夹起进行折叠，缓慢平铺在另一培养皿所培养的折叠好的成骨细胞膜片上，静置5min间断滴加含10～12％胎牛血清和1～1.5％双抗(青霉素、链霉素)的dmem/f12培养基，收获dcs复合体。用细胞刮刀沿培养皿底部刮擦，使之脱离皿底，用镊子缓慢将其折叠卷曲成类圆柱体。内皮细胞膜片在上，成骨细胞膜片在下记为膜片复合体a，为实验组。单纯成骨细胞膜片记为膜片复合体b，单纯内皮细胞膜片记为膜片复合体c，为对照组。

②无外源支架血管化组织工程骨异位移植实验

将36只裸鼠，随机分为a组、b组、c组，于双细胞膜片复合体裸鼠皮下植入术后8周和12周进行检测(n＝6/组/时间点)。裸鼠皮下植入：将稀释速眠新液按照0.1ml-0.2ml/20g肌肉注射麻醉，于背部做横切口，皮下植入构建物。实验组为膜片复合体a，对照组为膜片复合体b和膜片复合体c。

③表征

大体观察：组织工程骨植入后观察裸鼠生活状态和切口愈合情况和移植物变化；取材前观察真皮、周围组织与移植物关系。组织学检测：将取出的移植物分成两份，一份使用2.5％戊二醛固定24h，sem样品制备，观察标本剖面结构。一份常规石蜡包埋，制作5μm连续切片，选取组织块中心部位4张切片行he染色，并按照weidner等报道方法进行微血管计数，用spss20.0对结果进行统计分析；选取4张切片行masson染色，观察纤维矿化状况。

④结果

结果显示，植入裸鼠皮下后，切口处未见组织红肿、未见分泌物，缝合线10天左右自行脱落。取样时可见植入物与周围组织相连，表面被一层纤维膜覆盖，扁椭圆形，色白，质韧。he染色结果显示：第8周时，三组移植物中出现数量不等的微血管，dcs融合。可见膜片部分区域纤维聚集细胞丰富，部分区域组织致密细胞较少。第12周微血管数量明显减少，组织更加致密，细胞数量减少，染色偏粉红色。说明移植物随时间延长血管数目先增多后减少，矿化度在增加。masson染色结果显示：第8周，各组移植物均被染成蓝绿色，说明组织主要表达新生胶原纤维。第12周可见移植物绿染区域中央出现红染，其中a组效果最佳。说明细胞膜片植入后，胶原纤维发生矿化，逐渐成熟。sem结果显示：第8周时，各组移植物主要以纤维化结构为主，纤维疏松，走行无规律，偶可见血管，肉眼未见明显差异。第12周时，各组表现发生变化：a组组织呈现分层生长，层层排布紧密；b组可见组织完全融合，未见分层结构，可见无纤维分布的空缺部分；c组可见疏松的纤维内有大量血管走行，管腔内可见红细胞。说明a组复合体逐渐发生矿化，类骨样层状生长，b组矿化进程更快。c组矿化过快，形成的大量无机矿物质集结后呈现无组织结构形态。经过weidner方法对组织切片进行微血管计数，结果显示：第8周和12周时，c组与a、b组微血管数目差异均有统计学意义，而ab组均数之间比较，差异无统计学意义，说明单纯内皮细胞膜片组(c组)具备成血管能力，并且明显高于其他三组。该双细胞膜片复合体构建的血管化组织工程骨具备良好的成骨、成血管性能。