一种角膜基质、制备方法与应用与流程

本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种角膜基质、制备方法与应用。

背景技术：

角膜位于眼球的最前端，直接与外界环境接触，易受损伤和感染，如果用眼不卫生，很容易引起角膜发炎甚至混浊，导致视力减退甚至失明。据世界卫生组织报告，角膜病是引起视力丧失的第二位主要病因，仅次于白内障。目前，治疗角膜盲的唯一有效手段就是角膜移植，角膜移植所用的角膜主要有三个来源：同源异体角膜捐献、人工角膜和组织工程角膜。捐献的角膜来源有限，角膜供体严重短缺，无法满足现有众多角膜病盲患者治疗的需要，极大地限制了角膜盲患者脱盲，这也是世界各国亟待解决的问题。人工角膜的材料有硬性人工角膜材料、硅胶材料、phema、pmma材料等，这些材料虽然对缓解角膜病有一定的效果，但是都不能与患者组织形成良好的结合，有些材料甚至会导致患者眼部组织坏死，产生并发症。

基于对人工角膜合成材料与细胞间相互作用的深入了解，科学家们开始对活体细胞外基质构建人角膜等效物进行研究，希望获得与天然角膜结构相似、具备相似理化性能的组织工程器官，可用于临床治疗角膜盲病。人类对组织工程角膜的研究，进行了各种尝试，如在胶原上培养牛角膜细胞、利用羊膜培养自体角膜缘上皮细胞成功修复眼表损伤、利用温度敏感培养基体外培养自体口腔粘膜细胞修复眼表、利用自体角膜缘干细胞体外培养角膜上皮细胞膜片等，这些研究为组织工程角膜的研究奠定了理论基础，但是仍不能满足临床使用要求，比如胶原韧性差，无法抵抗眼内压作用及缝线的机械牵拉作用，人们对角膜创伤愈合机制仍需深入研究。经过多年的研究，发现了一种理想的组织工程角膜材料，免疫原去除猪角膜基质材料，其与人角膜基质具有极为相似的结构，并且具有免疫原性低、来源丰富的特点。免疫原去除的异种组织主要成分为胶原、弹力纤维等，形态与韧性变化较小。免疫原去除可以降低异种组织的炎症反应和免疫排斥反应，与人体的生物相容性好，于此同时基质中的生长因子可以诱导人角膜边缘细胞分化成相应的角膜细胞，免疫原去除猪角膜基质材料已成为治疗角膜盲病的不二选择。

对于组织工程角膜的研究，中国走在世界的前沿。深圳艾尼尔角膜工程有限公司于2015年4月22日推出了全球首个上市的生物工程角膜，该角膜产品取材于猪眼角膜，经病毒灭活与免疫原去除等工艺制备而成，是猪角膜的细胞外基质，细胞外基质的主要成分为胶原蛋白。本产品具有天然角膜的胶原纤维结构，保留了天然角膜的前弹力层和部分基质层。广东冠昊生物科技股份有限公司控股的广州优得清生物科技有限公司的专利，专利号cn201310527550.4，公开了一种角膜材料的制备方法，以动物角膜为原料，制备出透明性高、低免疫原性、生物活性和生物相容性好的异种角膜材料，且保持胶原三维结构与新鲜角膜相近，并通过胶原交联进一步降低胶原的抗降解性和免疫原性。

技术实现要素：

本发明提供一种以动物的眼角膜为原料，利用反复冻融法和酶溶液免疫原去除的方法，制备出抗拉强度大、无免疫原性、生物相容性好的角膜基质。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种角膜基质，采用动物的眼角膜为原料，去除角膜上皮层、角膜基质中的细胞成分和dna成分，保留前弹力层和部分厚度角膜基质，保留完整的细胞外基质成分(检测其力学性能、其化学性能、生物性能和降解性能)。

所述动物为哺乳动物，优选猪或牛。

所述部分厚度角膜基质为与前弹力层相连的具有一定厚度的角膜基质。

所述细胞外基质成分为胶原蛋白、糖胺聚糖。

所述胶原蛋白为i型胶原蛋白和iv型胶原蛋白，i型胶原蛋白和iv型胶原蛋白的含量为85-90％。

所述糖胺聚糖为硫酸软骨素和硫酸角质素。

本发明上述的角膜基质，其为直径7-10cm、厚度0.1-0.2mm的圆片。

所述去除角膜上皮层、角膜基质中的细胞成分和dna成分是以细胞残留量、dna残留量、半乳糖苷酶清除率评价的，即生物性能为细胞残留量、dna残留量、半乳糖甘酶(α-gal)清除率。

本发明上述的角膜基质，所述细胞残留量为0个，所述dna残留量小于10ng/mg，所述半乳糖甘酶(α-gal)清除率为99％以上。

本发明还提供一种上述角膜基质的制备方法，其特征在于：通过冻融溶胀和免疫原去除的方法制备所述角膜基质。

具体的，本发明上述的角膜基质的制备方法，步骤包括：

(1)原料处理：取动物的眼球，取角膜(例如使用环钻钻取)，清洗后浸泡于纯化水中；

(2)冻融溶胀：角膜用水浸泡，然后冷冻；取出、待完全解冻后用纯化水冲洗，然后浸泡；重复该冷冻解冻过程多次，得到吸水膨胀的角膜；

(3)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡角膜进行病毒灭活；

(4)清洗过程：分别用pbs溶液和纯化水在超声装置中处理角膜；

(5)免疫原去除：免疫原去除液为含有胰蛋白酶和edta的pbs溶液，免疫原去除过程在多频超声装置中进行，其中多频超声装置能够提供至少两个超声频率；

(6)清洗过程：分别用pbs溶液和纯化水在超声装置中处理角膜；

(7)重复步骤(5)和(6)多次，然后将角膜浸泡在纯化水中；

(8)切削取材：在解剖镜下使用角膜板层刀，切取角膜前弹力层和部分基质，然后将其浸泡于纯化水中；

(9)烘干干燥：将角膜平展在支撑件表面，放置在烘箱中进行干燥。

步骤(3)所述的过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的浓度(体积百分比)为0.1-5％、乙醇的浓度(体积百分比)为5-40％，过氧乙酸-乙醇溶液与角膜的比例(体积比)为(30-60)︰1，灭活时间2-4小时，温度范围为10-40℃。

所述步骤(4)中清洗液为ph6-8的pbs溶液，pbs溶液温度为10-40℃，pbs溶液与角膜的比例(体积比)为(30-60)︰1，清洗2-4次，每次10-30min，然后采用10-40℃的注射用水即纯化水清洗，纯化水与角膜比例(体积比)为(30-60)︰1，至检测电导率为10μs/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行。

所述步骤(5)中的免疫源去除液包括：溶解有胰蛋白酶和edta的ph值为6-8的pbs溶液；所述免疫源去除液中胰蛋白酶质量百分比浓度为0.01-0.2％，edta的浓度0.1-1mmol/l；进一步的：免疫源去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.02-0.05％，edta的浓度为0.4-0.8mmol/l，免疫源去除液ph值为7.0-8.0，优选为7.2-7.5；所述免疫源去除液与角膜体积比为(30-60)︰1；多频超声至少包括两个超声频率，低频频率范围为20-40khz，高频频率为60-90khz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，温度范围为20-35℃。

所述步骤(6)中清洗液为ph6-8的pbs溶液，pbs溶液温度为10-40℃，pbs溶液与角膜的比例(体积比)为(30-60)︰1，清洗2-4次，每次10-30min，然后采用10-40℃的注射用水清洗，注射用水与角膜比例(体积比)为(30-60)︰1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μs/cm终止。

所述步骤(9)烘干干燥在热循环烘箱中进行：先将烘箱预热至25-40℃后，然后将步骤(8)所得的材料放于烘箱中干燥，通过热循环风将水分风干，时间12-24小时。

上述制备方法还包括步骤(10)包装和步骤(11)灭菌解析，包装步骤具体为：烘干材料采用特卫强包装纸与吸塑盒封装；灭菌解析步骤具体为：先温度20-40℃保温时间2-4小时，湿度30-70％，然后通入浓度300-1000mg/l环氧乙烷，灭菌4-8小时；然后解析，解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在10-30℃之间，时间14-28d。

本发明进一步提供上述角膜基质在眼科植入物中的应用，该眼科植入物适用于病变角膜的覆盖，尤其适用于用药无效的尚未穿孔角膜溃疡、需要板层移植治疗的感染性角膜炎患者，以及角膜穿孔的临时性覆盖。首先使用角膜环钻和角膜板层刀将患者病变角膜部位切除干净，剖切深度符合病变深度，保留患者部分角膜基质和后弹力层，彻底清除创面异物，避免烧灼止血，生理盐水冲洗干净。然后打开本发明的外包装，取出内包装袋并剪开，无菌条件下取出内包装盒，向内包装盒中注入无菌生理盐水，使本发明产品复水10-15min，再将本发明产品的凸面(前弹力层面)向上，平整置于创面上缝合固定。手术方法、用药和术后护理与常规板层角膜移植手术相同，术后可使用角膜上皮保护药物。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

(1)通过低温冷冻，角膜中的细胞会在冰晶的作用下裂解破碎，于此同时，由于水转化成冰，体积膨胀，会增加角膜基质板层间距，解冻角膜时，冰转化成水，体积减小，会从外部吸收水分，从而实现角膜溶胀，厚度增加；

(2通过冻融溶胀增加角膜基质层间距，更有利于免疫原去除，有利于遗传物质的清洗；

(3)采用胰蛋白酶和edta，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果；酶法细胞洗脱工艺：采用胰蛋白酶和edta复合溶液，脱除细胞的过程温和，减少对基质结构的破坏，保留基质中的活性生长因子；

(4)高浓度免疫原去除溶液与纯水交替，利用溶液高低浓度的扩散作用，在角膜基质板层间形成冲刷效应，提高遗传物质清洗效率；通过风干的角膜，可以缩小角膜基质板层间距，可以消除角膜在冻融过程中对角膜板层的微观结构的影响，减小角膜厚度，使基质组织更密实，提高了角膜的抗拉强度；

(5)风干后的角膜是平面透明片状薄膜，避免了角膜在自由条件下风干所产生的褶皱和收缩，此种方法制得的角膜，具有一定的内应力，在复水的过程中可以快速的吸收水分，迅速恢复弹性；

(6)本发明角膜基质可用于板层角膜移植。

附图说明

图1所示的是本发明实施例角膜基质前弹力层的正面sem照片；

图2所示的是本发明实施例角膜基质除去前弹力层的正面sem照片；

图3所示的是本发明实施例角膜基质的侧面sem照片；

图4所示的是本发明实施例角膜基质的前弹力层与侧面sem照片；

图5所示的是本发明实施例角膜基质横截面的结构示意图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。

本发明所述猪眼角膜或牛眼角膜均适用于本发明的实施例。

实施例1：

本实施例一种角膜基质的制备方法，包括以下操作步骤：

(1)原料处理：

取死亡4小时以内猪或牛的眼球，用生理盐水将血水冲洗干净，使用直径8.5mm环钻钻取角膜，纯化水冲洗干净后纯化水浸泡。

(2)冻融溶胀：

角膜用少量水浸泡，置于-40℃冰柜中冷冻1小时，取出待完全解冻以后用纯化水冲洗15min，然后充足的纯化水浸泡30min，重复该冷冻解冻过程3次，得到吸水膨胀的角膜。

(3)病毒灭活：

采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡角膜进行病毒灭活，该过程可在不锈钢桶中进行。过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的浓度(体积百分比)为1％、乙醇的浓度(体积百分比)为24％，过氧乙酸-乙醇溶液与角膜的比例(体积比)为40︰1，灭活时间2小时，温度为20℃。

(4)清洗过程：

采用清洗液清洗角膜，清洗液为ph7的pbs溶液，pbs溶液温度为20℃，pbs溶液与角膜的比例(体积比)为40︰1，清洗3次，每次20min，然后采用纯化水清洗，纯化水与角膜比例(体积比)为40︰1，至检测电导率为10μs/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行。

(5)免疫原去除：

免疫原去除液为包含质量百分比浓度为2％胰蛋白酶和质量百分比浓度为0.3％的edta的ph值为7的pbs溶液，免疫原去除液与角膜混合比例(体积比)为40︰1，免疫原去除过程在超声波清洗机中进行，多频超声包括至少两个超声频率，低频频率为30khz，高频频率为70khz，其中低频处理8min，高频处理12min，温度为20℃。

(6)清洗过程：

采用清洗液进行清洗，清洗过程在超声波清洗机中进行，超声波的功率为3000w以下。清洗液为ph＝7的pbs溶液，pbs溶液温度为20℃，pbs溶液与角膜的比例(体积比)为40︰1，清洗3次，每次20min，然后采用20℃的注射用水清洗，注射用水与角膜体积比为40︰1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μs/cm终止。

(7)重复步骤(5)、(6)6次，使角膜外溶液浓度反复变化，溶液渗透方向变化，形成冲刷效应，反复清洗角膜中的遗传物质，直至将角膜上遗传物质清除干净，然后将角膜浸泡在注射水中。

(8)切削取材：

在解剖镜下使用角膜板层刀，切取角膜前弹力层和部分基质，厚度为2mm，然后将其浸泡于注射水中。

(9)烘干干燥：

在热循环百级烘箱中进行，将烘箱预热至37℃后，将步骤(8)所得材料放于烘箱干燥，通过热循环风将水分风干，风干时间为24小时。风干过程中，需将角膜平展在不锈钢托盘表面，使其风干后可保持平展状态，否则会在风干过程中收缩成不规则状态，甚至出现褶皱变形，影响产品品质。

本实施方式的制备方法可还包括：

(10)包装：

烘干材料采用特卫强包装纸与吸塑盒封装。

(11)灭菌解析：

采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：先温度40℃保温4小时，湿度70％，然后通入浓度500mg/l环氧乙烷，灭菌6小时；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在20℃之间，时间14天。

最终获得的样品角膜，横截面的结构示意图如附图5所示，包括下层的基质层和位于上部的前弹力层；本发明的角膜可以通过将浸泡后的角膜放置于不锈钢筛网等滤水装置上，滤水5分钟以上之后，用称量器具量取。

实施例2：

通过扫描电子显微镜对实施例1中样品进行观察，如附图1和4所示，可以观察到经过免疫原去除处理后，免疫原去除角膜的前弹力层完好，没有受到酶溶液的影响及破坏，有利于角膜上皮细胞的移行、黏附和增殖，有利于角膜快速、完整的上皮化，避免感染。上皮能正常生长覆盖在角膜基质表面，就可以有效隔绝各种水解酶对其胶原成分的降解，延长降解时间，利于角膜基质的改建。

除去前弹力层后如附图2和3所示，可以看到角膜内部呈现三维网络结构，三维网络结构形成生物支架，有利于病人角膜细胞的长入，增加了细胞的附着数量，有利于营养物质的交换，利于免疫原去除角膜基质的改建。

从附图3和4的侧面sem电镜照片可以看到，前弹力层的层状膜结构完整，角膜基质内部呈层状结构，可见胶原板层间空隙，空隙大小为20-150μm。

实施例3：

对本发明制备方法所得样品进行物理性能检测，具体如下：

a.缝合抗拉强度：按照实施例1制备5个样品，用3-0非吸收缝合线在修补片一端边缘2毫米处，将缝合线与修补片的另一端固定在拉力仪上，以20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录最大力值，结果显示，最大值平均值可达3.2n。

b.透光率：按照实施例1制备5个样品，分别测风干样品、溶胀样品、甘油脱水样品的透光率。风干样品制备：将溶胀的样品直接贴比色皿透光一侧的内壁，送入鼓风烘箱中风干24小时；溶胀样品制备：将溶胀的样品直接贴比色皿透光一侧的内壁；甘油脱水样品：将溶胀的样品置于甘油中脱水12-48小时，然后取出样品，清理干净样品表面的甘油，将样品直接贴比色皿透光一侧的内壁。测试时，将样品一侧放于右边，分别测800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm的透光率，记下读数，计算平均值。风干样品透光率平均值为86.6％，溶胀样品透光率平均值为39.05％，甘油脱水样品透光率平均值为80.0％；

c.膨胀率：按照实施例1制备5个样品，将角膜平铺在平板上，上盖载玻片，置于40℃温度鼓风干燥箱中风干24-48小时，取出样品，用手术刀切割成规则长方体，用游标卡尺测量样品的长宽高，记下读数，再将样品浸泡在水中24小时吸水溶胀，用游标卡尺测出溶胀后的长宽高，记下读数，分别计算溶胀前后的体积v1、v2，计算膨胀率为：计算结果平均值为88.5％；

d.含水率：按照实施例1制备样品，将角膜平铺在平板上，上盖载玻片，置于40℃温度鼓风干燥箱中风干24小时，取出样品，称干重w1。再将样品浸泡在水中24小时吸水溶胀，称湿重w2，计算含水率：计算结果平均值为95.9％。

e.降解性能：每个直径为8.5mm、厚度为0.15mm的角膜基质样品，用1ml质量百分比为0.03％的蛋白酶k溶液浸泡，56℃水浴，每隔10min对角膜进行称重，计算角膜剩余质量。测试结果为表1所示：

表1实施例样品降解性能

实施例4：

对本发明制备方法所得样品进行性能检测，具体如下：

a.酸碱度：按照实施例1制备样品，依据gb/t14233.1-2008中5.4.1规定的方法进行，样品检验液与空白对照液的ph值之差应不超过1；

b.重金属含量：按照实施例1制备样品，铅、铬按gb/t14233.1-2008中5.9.1规定的原子吸收分光光度计法试验，汞、砷按gb/t14233.1-2008中5.9.3规定的原子荧光光谱法试验，检测结果显示，重金属含量低于0.1μg/g。

c.炽灼残渣：按照实施例1制备样品，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)0841规定的方法测定，炽灼残渣为1.0％。

d.细菌内毒素测定：按照实施例1制备样品，按gb/t14233.2-2005规定的方法进行操作，结果显示细菌内毒素小于2eu/g。

e.细胞残留检查：取3个产品分别进行he染色，每个切片选3个视野，在400倍光学显微镜下观察完整细胞数量除以3，结果显示，平均每个视野完整细胞数量为0。

f.dna残留量：按照实施例1制备样品，依据生物制剂残留dna检测方法(《中国药典》2010，附录ix-b外源性dna残留量测定法)，采用荧光染色法检测实施例1所提供的样品的dna残留量。结果显示，样品中的dna残留量小于4.56±0.01ng/mg。

g.半乳糖苷酶(α-gal)清除率：取动物源性生物材料gal阳性参考品，gal抗原阴性参考品各2mg，加裂解液1ml，裂解30-90min，配制成20、10、5、2.5、1.25、0.625μg的gal标准曲线样品，测试免疫原去除前后的测试品各取50mg，加裂解液2ml，裂解30-90min；取裂解液与m86抗体反应后的上清液，加入96孔板，加二抗，加显色剂，采用elisa方法450nm检测吸光度值，按标准曲线计算出样品的gal值，免疫原去除处理前材料的gal值为25.69±2.72×10¹⁴/mg，实施例1中样品的gal值为0.12±0.01×10¹⁴/mg，半乳糖苷酶(α-gal)清除率在99.52％以上。

h.胶原蛋白亚型鉴别：采用免疫组化染色法检测i型和iv型胶原蛋白，3μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。将切片移入电饭煲水浴中(内含0.01mol/l，ph6.0的枸橼酸三钠缓冲液)，温度保持在95-100℃，煮20min，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤，5min×3次。二步法免疫组化：分别滴加i型和iv型胶原蛋白单克隆抗体一抗，浓度1：100，4℃冰箱过夜室温下孵育60min，pbs洗涤3次。滴加envision反应液，室温下孵育30min。pbs洗涤3次。0.05％的3，3一二氨基联苯胺+0.03％的h2o2显色5-10min。流水洗，苏木精衬染。递增梯度乙醇脱水，二甲苯透明，常规树脂封固。结果表明，显微镜下观察四种染色标本皆可见棕黄染色，为阳性，表明样品中可检测到i和iv型胶原蛋白。

i.糖胺聚糖含量检测：取10个样品，取样，浸提，用biocolor硫酸软骨素、硫酸角质素检测试剂盒测试硫酸软骨素和硫酸角质素含量，样品中硫酸软骨素含量平均值为573±83μg/g；硫酸角骨素含量平均值为132±13μg/g。

实施例5：

对本发明制备方法所得样品进行生物学检测，检测项目包括：热原、细胞毒性、迟发型超敏反应、皮内反应、急性全身毒性、ames试验、小鼠淋巴瘤细胞突变试验、染色体畸变、植入、亚慢性毒性。

1)热原

按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水。按gb/t14233.2-2005规定的方法进行，产品无热原反应。

2)细胞毒性

按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质：含血清的mem培养基。取试验液按照gb/t16886.5-2003中规定的试验方法进行试验，结果产品的细胞毒性反应不大于1级。

3)迟发型超敏反应

按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验方法规定进行试验，结果产品无迟发型超敏反应。

4)皮内反应

按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。按照gb/t16886.10-2005第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验试验方法规定进行试验，结果：试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。

5)急性全身毒性

按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和棉籽油。取试验液按照gb/t16886.11-2011规定的试验方法进行试验，结果：产品无急性全身毒性反应。

6)ames试验

按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso。按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的ames试验为阴性。

7)小鼠淋巴瘤细胞突变试验

按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso。按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的小鼠淋巴瘤细胞突变试验为阴性结果。

8)染色体畸变试验

按6cm²样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水和dmso，按gb/t16886.3-2008规定的方法进行，结果：产品的染色体畸变试验为阴性。

9)植入

按gb/t16886.6-1997规定的方法进行，结果：肌肉植入1周：样品周围可见嗜中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞浸润，应无囊腔形成；肌肉植入4周：样品周围可见少量巨噬细胞和淋巴细胞，胶原纤维和纤维母细胞增生，有纤维囊腔形成；肌肉植入12周：样品周围可见少量淋巴细胞、胶原纤维、纤维囊腔较致密规整。

10)亚慢性毒性

按gb/t16886.11规定的方法进行，结果：对材料亚慢毒性进行评价，无亚慢性毒性反应。

实施例6：

对本发明制备方法所得样品进行动物实验，具体如下：

将实施例1中样品用1：4000庆大霉素生理盐水清洗角膜15min复水，用环钻制直径7mm角膜移植片。家兔12只，体重1-2kg，左眼行手术，右眼空白对照。1％异戊巴比妥钠按30mg/kg体重腹腔注射，0.5％卡因表面麻醉，2％奴佛卡因1ml球后注射，并按摩眼球，降低眼压，术前30min滴加1％新福林、1％阿托品和托品酰胺滴眼，使瞳孔充分散大。常规消毒铺布，剪去眼周睫毛，作四条直肌索引缝线，暴露和固定眼球，用6.5环钻置于角膜中央，向下轻压旋转，当有房水流出时停止，用角膜剪完成未钻穿的角膜，之后将复水后的实施例1中角膜移植于缺损处，用9/0尼龙线作四点间断固定，再作连续缝合固定。术后每日检查滴加0.4％庆大霉素、0.5％考地松及1％阿托品液。12只动物植入片，1周内透明3只，2周内透明5只，1只死亡，3周透明3只。11只动物中有3只透明时间43天、56天、58天，其余8只透明时间在90天以上。眼角膜保持透明，角膜无水肿、无感染，角膜无新生血管。取材测量移植角膜厚度为330±20μm，正常角膜厚度为304±11μm，两者无统计学差异。术眼眼压为11±1mmhg，正常眼压为10±1mmhg，两者无统计学差异。

综上可见，本发明一种角膜基质及的制备方法，具有如下优势：

(1)保留角膜细胞外基质中胶原蛋白纤维的三维空间网络结构；

(2)保留角膜细胞外基质中活性生长因子；

(3)通过低温冷冻，角膜中的细胞会在冰晶的作用下裂解破碎，于此同时，由于水转化成冰，体积膨胀，会增加角膜基质板层间距，解冻角膜时，冰转化成水，体积减小，会从外部吸收水分，从而实现角膜溶胀，厚度增加；

(4)增加角膜基质层间距，更有利于免疫原去除，有利于遗传物质的清洗；

(5)高浓度免疫原去除溶液与纯水交替，利用溶液高低浓度的扩散作用，在角膜基质板层间形成冲刷效应，提高遗传物质清洗效率；

(6)dna残留能够达到10ng/mg以下，半乳糖苷酶去除率较高，能够达到99％以上；

成型部分：

(1)通过风干的角膜，可以缩小角膜基质板层间距，可以消除角膜在冻融过程中对角膜板层的微观结构的影响，减小角膜厚度，使基质组织更密实，提高了角膜的抗拉强度；

(2)风干后的角膜是平面透明片状薄膜，避免了角膜在自由条件下风干所产生的褶皱和收缩，此种方法值得的角膜，具有一定的内应力，在复水的过程中可以快速的吸收水分，迅速恢复弹性；

灭菌工艺：

通过控制灭菌工艺，能够有效的使环氧乙烷气体渗透进角膜内部，达到灭菌效果。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。