本发明涉及一种生物酶法丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备方法，其特征是借助于漆酶催化氧化丝素蛋白中丝氨酸和酪氨酸残基，并与含氨基的羧甲基壳寡糖反应，结合仿生矿化，制备丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料，属于纺织生物技术领域。
背景技术：
丝素来源于脱胶后的桑蚕丝，其光泽优雅，机械性能与吸湿性优良，是较为理想的纺织纤维原料。与此同时，丝素蛋白本身还具有良好的生物相容性和环境友好性，以丝素为原料加工的再生材料具有无毒、无刺激性、低免疫原性等优点，是一种性能优良的天然生物制品与医用生物材料。
丝素基生物材料的性能与其分子量、蛋白二级结构有较大的相关性。丝素纤维经钙盐或锂盐溶解后，丝素蛋白大分子发生溶解和部分水解，通过透析去除盐离子，可得到丝素蛋白溶液。在此过程中，丝素的溶解条件影响体系中蛋白分子量大小、二级结构和极性基团(如羧基、氨基等)数量，即分子量较小的丝素蛋白体系中羧基和氨基数较多；分子量较大的丝素蛋白中羧基和氨基数较少。分子量较大的丝素蛋白有利于再生丝素蛋白材料的制备，能显著增加材料的力学性能，但由于负电性羧基含量较少，在仿生矿化中丝素对钙离子络合能力下降，影响丝素表面磷酸钙盐沉积与矿化效果。与之相比，分子量较小的丝素分子中羧基含量多，对钙离子络合能力较强，利于通过仿生矿化制备丝素/磷酸钙盐复合材料，其缺点是低分子量丝素影响丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的力学性能。因此，在制备丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的过程中，如何在获得较好仿生矿化效果的同时，提升复合材料的力学性能，是亟待解决的问题。
目前，丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备中，多采用化学交联法提升丝素分子量，再结合sbf模拟体液或钙离子-磷酸盐矿化液进行仿生矿化处理。化学交联法多借助戊二醛、碳化二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)等，使丝素大分子间共价交联，此类方法在增加材料力学性能的同时，也存在一定的不足，如交联反应中易产生化学有害物质残留、或交联后丝素中羧基数量减少，仿生矿化性能下降等问题。近年来，随着生物技术应用研究的发展，借助酶法进行丝素基再生材料制备日趋成为热点。酶法较传统化学方法具有高效、专一、作用条件温、环境友好的优点，日益成为材料学科领域研究的热点。漆酶(laccase)是一种具有催化氧化活性的氧化酶，不仅能催化氧化l-酪氨酸的酚羟基，形成反应性较强的醌类活性基；而且对l-丝氨酸的醇羟基也有一定氧化功效，能产生反应性醛基。上述醌类活性基、醛基均能与含有氨基的化合物发生席夫碱反应，形成分子间交联，这为基于酶法的丝素蛋白接枝改性和仿生矿化提供了新方法。
本发明中通过漆酶催化氧化丝素，产生反应性较强的醌类活性基和醛基，并与羧甲基壳寡糖分子链中的氨基反应形成共价键。通过此方法，不仅形成了以羧甲基壳寡糖为连接方式的丝素分子间交联，增加了丝素分子量和力学性能，而且通过引入较多负电性羧基，提升了丝素诱导矿化性能，有利于丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的制备，可应用于医用仿生骨基质支架材料的构建。
技术实现要素：
本发明的目的旨在提供一种生物酶法丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备方法，使用本发明可在温和条件下提高催化丝素蛋白分子间交联，同时改善丝素的仿生矿化效果，提高丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的性能。
本发明的技术方案：一种生物酶法丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备方法，其特征是借助漆酶催化氧化丝素蛋白中丝氨酸和酪氨酸残基，将羧甲基壳寡糖接枝到丝素分子上，改善丝素的仿生矿化性能，制备丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料，具体工艺与步骤如下：
(1)丝素蛋白溶液制备：以溴化锂或氯化钙溶解脱胶后的桑蚕丝，制备丝素溶液；
处理工艺处方及条件：将脱胶后的桑蚕丝加入到溴化锂或氯化钙的水溶液中，在60～80℃溶解后，以去离子水中透析8～36小时后过滤，制得浓度为10～50g/l丝素溶液；
(2)漆酶催化丝素接枝羧甲基壳寡糖：在步骤(1)处理后的丝素蛋白溶液中加入漆酶和羧甲基壳寡糖处理；
处理工艺处方及条件：漆酶1～10u/ml，羧甲基壳寡糖0.5～5g/l，处理温度20～60℃，ph范围4.0～7.0，处理时间2～24小时；然后以去离子水中透析8～36小时，去除未反应的羧甲基壳寡糖，制得浓度为20～50g/l的改性丝素溶液；
(3)改性丝素蛋白膜成型：将步骤(2)反应后的丝素溶液在-50～-20℃条件下冷冻干燥，制成丝素蛋白膜；然后将该丝素蛋白膜在50～80％乙醇溶液中浸渍0.25～1小时，在30℃烘干；
(4)丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备：将步骤(3)处理后的丝素膜浸渍在1.5倍sbf模拟体液中，在37℃条件下仿生矿化1～7天，期间每天更换一次模拟体液；仿生矿化结束后以去离子水清洗，在-50～-20℃条件下再次冷冻干燥得到丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料。
一种生物酶法丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备方法，所述漆酶来源于动物、植物或微生物；所述羧甲基壳寡糖为壳寡糖单体中c6羟基上的氢被羧甲基取代的6-o-羧甲基壳寡糖。
本发明的有益后果
本发明利用漆酶催化羧甲基壳寡糖与丝素蛋白接枝，赋予丝素蛋白较好的诱导仿生矿化效果，制备丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料。与传统化学法交联接枝相比，本发明具有以下优点：
(1)酶催化反应效率高，借助漆酶催化丝素蛋白产生醌类活性基和醛基，将羧甲基壳寡糖接枝到丝素分子上，具有专一性强和反应效率高的优点；
(2)接枝反应条件缓和，在低温近中性条件下完成丝素蛋白的酶促接枝改性，避免了化学整理时容易造成交联剂残留、或反应条件剧烈影响丝素基复合材料的性能等问题；
(3)复合材料性能优良，借助酶法形成以羧甲基壳寡糖为连接的丝素分子间交联，同时羧甲基壳寡糖上羧酸基增加了对钙离子络合能力，增强了丝素仿生矿化效果，提高了丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的性能。
具体实施方式
采用漆酶酶催化氧化丝素，接枝含氨基的羧甲基壳寡糖，结合仿生矿化制备丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料的具体实施例如下：
实施例1
以本发明述及的方法进行丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备；
(1)丝素溶液制备：将脱胶后的桑蚕丝加入到溴化锂溶液中，在70℃溶解后，以去离子水透析24小时后过滤，制得浓度为20g/l丝素溶液；
(2)漆酶催化丝素接枝羧甲基壳寡糖：在步骤(1)处理后的丝素蛋白溶液中加入漆酶和羧甲基壳寡糖处理，其中漆酶5u/ml，羧甲基壳寡糖2g/l，处理温度45℃，ph5.5，处理时间12小时；反应以去离子水中透析24小时，去除未反应的羧甲基壳寡糖，制得浓度为25g/l的改性丝素溶液；
(3)改性丝素蛋白膜成型：将步骤(2)反应后的丝素溶液在-50℃条件下冷冻干燥成膜；然后将该丝素膜材料在70％乙醇溶液中浸渍0.5小时，在30℃烘干；
(4)丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备：将步骤(3)处理后丝素膜浸渍在1.5倍sbf模拟体液中，在37℃条件下仿生矿化5天，期间每天更换一次模拟体液；仿生矿化结束后以去离子水清洗，经-50℃冷冻干燥制得丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料。
试样1：经步骤(1)、(3)和(4)处理，不经过步骤(2)处理；
试样2：经步骤(1)、(2)、(3)和(4)处理；
试样3：经步骤(1)、(2)、(3)和(4)处理，但步骤(2)处理中以化学交联剂2g/ledc和1.5g/lnhs代替5u/ml漆酶进行处理。
经上述工艺处理后，试样1表面钙、磷含量分别为12.5％和8.6％，弹性模量为9.7mpa；试样2表面钙、磷含量分别为15.5％和10.6％，弹性模量为14.8mpa；试样3表面钙、磷含量分别为11.9％和7.1％，弹性模量为12.5mpa。
实施例2
以本发明述及的方法进行丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备；
(1)丝素溶液制备：将脱胶后的桑蚕丝加入到溴化锂溶液体系中，在72℃溶解后以去离子水透析20小时后过滤，制得浓度为25g/l丝素溶液；
(2)漆酶催化丝素接枝羧甲基壳寡糖：在步骤(1)处理后的丝素蛋白溶液中加入漆酶和羧甲基壳寡糖处理，其中漆酶7.5u/ml，羧甲基壳寡糖2.5g/l，处理温度45℃，ph5.0，处理时间8小时；反应以去离子水中透析20小时，去除未反应的羧甲基壳寡糖，制得浓度为25g/l的改性丝素溶液；
(3)改性丝素蛋白膜成型：取步骤(2)反应后的溶液，在-50℃条件下冷冻干燥成膜；然后将该丝素膜材料在75％乙醇溶液中浸渍1小时，在30℃烘干；
(4)丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料制备：将步骤(3)处理后丝素膜浸渍在1.5倍sbf模拟体液中，在37℃条件下仿生矿化7天，期间每天更换一次模拟体液；仿生矿化结束后以去离子水清洗，经-50℃冷冻干燥制得丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料。
试样4：经步骤(1)、(3)和(4)处理，不经过步骤(2)处理；
试样5：经步骤(1)、(2)、(3)和(4)处理；
试样6：经步骤(1)、(2)、(3)和(4)处理，但步骤(2)处理中以化学交联剂2.5g/ledc和2g/lnhs代替7.5u/ml漆酶进行处理。
试样7：以5u/ml漆酶与1g/ll-丝氨酸在45℃、ph5.5处理2小时；再加入等体积的新配制蓝色的氢氧化铜悬浊液，在90℃加热10分钟后，生成砖深红色氧化亚铜沉淀，表明漆酶能催化氧化l-丝氨酸及丝素中丝氨酸残基产生醛基；这一结果也表明漆酶能氧化丝素中丝氨酸与含氨基的羧甲基壳寡糖发生希夫碱反应。
经上述工艺处理后，试样4表面钙、磷含量分别为13.0％和8.7％，弹性模量为10.2mpa；试样5表面钙、磷含量分别为15.5％和10.9％，弹性模量为15.1mpa；试样6表面钙、磷含量分别为10.5％和7.5％，弹性模量为13.9mpa。
通过对实施例数据分析：与未接枝羧甲基壳寡糖的丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料(试样1、试样4)相比，以本发明述及的方法制备的丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料(试样2、试样5)弹性模量明显增加，材料表面钙和磷含量较高，表明获得了较好矿化效果；与edc/nhs化学交联法接枝羧甲基壳寡糖制得的丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料(试样3、试样6)相比，以本发明述及的方法制备的丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料(试样2、试样5)弹性模量较高，仿生矿化效果更好。由此可见，以本发明述及的方法催化丝素接枝羧甲基壳寡糖，结合仿生矿化，制备的丝素蛋白/磷酸钙盐复合材料具有较好的性能。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。