本发明涉及组织工程及再生医学材料
技术领域：
，尤其涉及一种用于硬脑膜缺损部位的修复手术，包括幕上、大脑半球手术，幕下、后颅窝手术，颅底微创手术、锁孔手术和脑脊液漏的修补手术的复层可吸收生物膜的制备方法。
背景技术：
：硬脑膜是脑组织表面一层重要的组织结构，是保护脑组织的一道重要屏障。硬脑膜的完整性对于颅脑手术患者十分重要，脑膜修补材料对于重建硬脑膜完整性，保护脑组织，防止脑脊液漏，颅内感染，脑膨出，癫痫等并发症具有重要意义。创伤、肿瘤侵蚀及手术过程本身等因素均可造成硬脑膜的缺损，故需要其他代替材料来修补缺损的硬脑膜，以使其保持解剖结构的完整。目前，根据材料来源，临床上所用到的人工硬脑膜补片主要分为4类，分别是自体组织修补材料、同种异体修补材料、异种天然生物膜和人工合成材料。自体组织修补材料主要为肌筋膜、膜状腱膜、脂肪等。这些材料具有很好的生物相容性和安全性，不发生排异反应、免疫反应，但其二次损伤、步骤繁琐、容易粘连以及加重病人痛苦等缺点，在临床上应用越来越少；同种异体修补材料主要为冻干的人体硬脑膜。这些材料有正常人体脑膜的超微结构，从结构上看是最好的。然而这种材料存在病毒、传染病等风险，而且供体来源有限，已经被禁用；异种天然生物膜主要为猪腹膜、羊腹膜、牛心包等。这些材料与硬膜结构相似，有助于恢复正常的生理解剖结构，且具有一定的强度。但是这些材料存在细胞残留、抗原抗体反应，病毒、感染及毒性反应，保存及使用步骤繁琐等缺点；人工合成材料主要为聚乙醇酸、聚乳酸、聚已内酯等高分子材料。这些材料取材方便，成本低，无潜在病毒感染，但其降解速率较慢、生物学性能差等缺点限制了其应用；除了以上四种材料，以胶原蛋白为原材料制备人工硬脑膜越来越受到大家的关注。i型胶原蛋白是硬脑膜最主要的细胞外基质成分，独特的三维孔隙结构，为受损硬脑膜的再生和重建提供最佳的介质和支架。既避免了动物源性的潜在危险，又比合成材料具有更好的生物相容性。i型胶原蛋白是由两条α1肽链和一条α2肽链组成，三条肽链以链间的氢键紧密地结合在一起，形成稳定的三股螺旋胶原单体结构。胶原有刺激细胞增殖的作用，尤其是成纤维细胞及上皮细胞。人体内的细胞绝大多数属于贴附依赖性细胞，只有在一定的基质上贴附铺展，才能使细胞增殖周期运行，而胶原是细胞贴附的最重要的基质成分。由于人体的硬脑膜组织属不规则致密结缔组织，主要由成纤维细胞和i型胶原蛋白组成。因此，i型胶原蛋白对硬脑膜的再生和修复起着至关作用，但是，现有技术在力学性能、是否缝合、降解速率等方面还有不足，需要进一步改进和优化。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供一种复层可吸收生物膜的制备方法，以解决现有技术存在的问题。基于上述目的，本发明提供的一种复层可吸收生物膜的制备方法包括以下步骤：配置硫酸软骨素乙酸溶液和胶原乙酸溶胀液；在胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素乙酸溶液，得到胶原-硫酸软骨素浆液，在配置的过程中溶液均匀搅拌并抽真空；将胶原硫酸软骨素溶液进行第一次真空冷冻干燥，得到具有三维结构的胶原膜；将胶原膜压制成致密胶原膜；将胶原硫酸软骨素溶液倒在铺有致密胶原膜的冻干盘中或直接通过胶原-硫酸软骨素浆液将胶原致密层和胶原膜粘附在一起，进行第二次真空冷冻干燥，得到具有疏松层和致密层的复合胶原膜；复合胶原膜进行交联；将交联后的复合胶原膜进行灭菌，得到复层可吸收生物膜。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述硫酸软骨素乙酸溶液由如下方法配置：将2-4克硫酸软骨素加入到500毫升浓度为0.4-0.6％乙酸溶液中，在0-10℃温度条件下，溶解，过滤得到。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述胶原乙酸溶胀液由如下方法配置：将3-5克i型胶原蛋白加入到500毫升浓度为0.3-0.6％乙酸溶液中，混合搅拌，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌时间为1-2小时。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述i型胶原蛋白为牛跟腱中提取的高纯度胶原蛋白，其中i型胶原蛋白占总蛋白含量不小于99％，羟脯氨酸的含量不小于10％。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述在胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素乙酸溶液，得到胶原-硫酸软骨素浆液，在配置的过程中溶液均匀搅拌并抽真空包括：将200-500毫升硫酸软骨素乙酸水溶液缓慢加入到胶原乙酸溶胀液中，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌时间为1-2小时，将溶液抽真空，得到胶原-硫酸软骨素浆液。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述将胶原硫酸软骨素溶液进行第一次真空冷冻干燥的方法为：将胶原-硫酸软骨素浆液倒到不锈钢冻干盘中，轻摇使其分布均匀，控制其厚度在2-5毫米；在温度为–50-30℃，压力≤0.2兆帕条件下进行真空冷冻干燥，生成孔隙为30-250微米的胶原膜。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述将胶原膜压制成致密胶原膜包括：用压胶原机的压力均匀地分散到胶原膜上，所述压胶原机的所采用的压力为5-15兆帕，时间为1-3分钟，使胶原膜表面平整，胶原膜的压制厚度为1-2毫米，孔隙≤100微米，达到致密胶原层的要求。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述第二次真空冷冻干燥的方法为：将致密胶原层铺在不锈钢冻干盘中，将胶原硫酸软骨素溶液倒在致密胶原膜上或在胶原致密层上刷一层均匀胶原-硫酸软骨素浆液，将胶原膜平整地放在胶原致密层上，控制其总厚度在3-6毫米；在温度为–50-30℃，真空度≤0.2bar的条件下进行真空冷冻干燥，上层的胶原硫酸软骨素溶液生成孔隙为30-250微米的胶原膜，形成上层为胶原膜，下层为致密胶原层的复合胶原膜。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述真空冷冻干燥包括缓冻干燥和速冻干燥两种冷却干燥方式进行冷却干燥。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述缓冻干燥包括以下步骤：预冻阶段，温度：3-5℃，时间：120-180分钟；冷冻阶段，温度：-35--45℃，时间：310-360分钟；抽空干燥阶段，温度：-8--10℃，时间：740-920分钟，真空度：0.2bar；第一干燥阶段，温度：-10.5--13.5℃，时间：380-460分钟，真空度：0.2bar；第二干燥阶段，温度：-5℃，时间：350-420分钟，真空度：0.2bar；第三干燥阶段，温度：0℃，时间：80-90分钟，真空度：0.2bar；第四干燥阶段，温度：20-30℃，时间：70-100分钟，真空度：0.2bar。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述速冻干燥包括以下步骤：冷冻阶段，温度：-38℃，时间：40分钟；抽空干燥阶段，温度：-18℃，时间：720分钟，真空度：0.2bar；第一干燥阶段，温度：-8℃，时间：420分钟，真空度：0.2bar；第二干燥阶段，温度：0℃，时间：180分钟，真空度：0.2bar；第三干燥阶段，温度：10℃，时间：180分钟，真空度：0.2bar；第四干燥阶段，温度：24℃，时间：95分钟，真空度：0.2bar。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述复合胶原膜进行交联包括：首先进行高温真空交联，对胶原膜先进行高温真空的物理交联，交联条件为：温度为90-110℃，时间为24-36小时；然后使用低浓度的戊二醛作为交联剂，对胶原膜进行化学交联，交联条件为：戊二醛的浓度为0.001％-0.01％，温度为0-15℃，时间为10-36小时。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述将交联后的复合胶原膜进行灭菌为使用环氧乙烷、co60辐照、紫外辐照中的至少一种方法进行灭菌。在基于上述复层可吸收生物膜的制备方法的另一个实施例中，所述使用环氧乙烷灭菌包括：环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为40％-60％，温度为50-60℃,湿度为20％-50％rh，时间为2-5小时,换气次数为4-7次。由上面所述可以得出，本发明的有益效果为：(1)以高纯度i型胶原蛋白为原料，制备了由疏松层和致密层组成的复层可吸收生物膜，具有良好的生物相容性、无毒、无抗原反应。(2)采用两次特殊冷冻干燥的方式制备的复层可吸收生物膜，具有良好的力学性能。可根据手术要求进行缝合，在某些情况下可免缝合，节省手术时间防止缝线带来癫痫的危险。(3)应用于硬脑膜缺损的修复手术，其三维多孔结构有利于成纤维细胞、毛管细胞长入，复层可吸收生物膜的再生和支架的降解同步进行，可有效防止脑脊液渗漏，防粘连，减少瘢痕的产生。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供的复层可吸收生物膜的制备方法包括以下步骤：步骤1：配置硫酸软骨素乙酸溶液和胶原乙酸溶胀液；步骤2：在胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素乙酸溶液，得到胶原-硫酸软骨素浆液，在配置的过程中溶液均匀搅拌并抽真空；步骤3：将胶原硫酸软骨素溶液进行第一次真空冷冻干燥，得到具有三维结构的胶原膜；步骤4：将胶原膜压制成致密胶原膜；步骤5：将胶原硫酸软骨素溶液倒在铺有致密胶原膜的冻干盘中或在胶原致密层上刷一层均匀胶原-硫酸软骨素浆液，将胶原膜平整地放在胶原致密层上，进行第二次真空冷冻干燥，得到具有疏松层和致密层的复合胶原膜；步骤6：复合胶原膜进行交联；步骤7：将交联后的复合胶原膜进行灭菌，得到复层可吸收生物膜。步骤1中所述硫酸软骨素乙酸溶液由如下方法配置：将2-4克硫酸软骨素加入到500毫升浓度为0.4-0.6％乙酸溶液中，在0-10℃温度条件下，溶解，过滤得到。步骤1中所述胶原乙酸溶胀液由如下方法配置：将3-5克i型胶原蛋白加入到500毫升浓度为0.3-0.6％乙酸溶液中，混合搅拌，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌时间为1-2小时。所述i型胶原蛋白为牛跟腱中提取的高纯度胶原蛋白，其中i型胶原蛋白占总蛋白含量不小于99％，羟脯氨酸的含量不小于10％。步骤2中所述在胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素乙酸溶液，得到胶原-硫酸软骨素浆液，在配置的过程中溶液均匀搅拌并抽真空包括：将200-500毫升硫酸软骨素乙酸水溶液缓慢加入到胶原乙酸溶胀液中，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌时间为1-2小时，将溶液抽真空，得到胶原-硫酸软骨素浆液。步骤3中所述将胶原硫酸软骨素溶液进行第一次真空冷冻干燥的方法为：将胶原-硫酸软骨素浆液倒到不锈钢冻干盘中，轻摇使其分布均匀，控制其厚度在2-5毫米；在温度为–50-30℃，压力≤0.2兆帕条件下进行真空冷冻干燥，生成孔隙为30-250微米的胶原膜。步骤4中所述将胶原膜压制成致密胶原膜包括：用压胶原机的压力均匀地分散到胶原膜上，所述压胶原机的所采用的压力为5-15兆帕，时间为1-3分钟，使胶原膜表面平整，胶原膜的压制厚度为1-2毫米，孔隙≤100微米，达到致密胶原层的要求。步骤5中所述第二次真空冷冻干燥的方法为：将致密胶原层铺在不锈钢冻干盘中，将胶原硫酸软骨素溶液倒在致密胶原膜上或在胶原致密层上刷一层均匀胶原-硫酸软骨素浆液，将胶原膜平整地放在胶原致密层上，控制其总厚度在3-6毫米；在温度为–50-30℃，真空度≤0.2bar的条件下进行真空冷冻干燥，上层的胶原硫酸软骨素溶液生成孔隙为30-250微米的胶原膜，形成上层为胶原膜，下层为致密胶原层的复合胶原膜。步骤3和步骤5中所述真空冷冻干燥包括缓冻干燥和速冻干燥两种冷却干燥方式进行冷却干燥。所述缓冻干燥包括以下步骤：预冻阶段，温度：3-5℃，时间：120-180分钟；冷冻阶段，温度：-35--45℃，时间：310-360分钟；抽空干燥阶段，温度：-8--10℃，时间：740-920分钟，真空度：0.2bar；第一干燥阶段，温度：-10.5--13.5℃，时间：380-460分钟，真空度：0.2bar；第二干燥阶段，温度：-5℃，时间：350-420分钟，真空度：0.2bar；第三干燥阶段，温度：0℃，时间：80-90分钟，真空度：0.2bar；第四干燥阶段，温度：20-30℃，时间：70-100分钟，真空度：0.2bar。所述速冻干燥包括以下步骤：冷冻阶段，温度：-38℃，时间：40分钟；抽空干燥阶段，温度：-18℃，时间：720分钟，真空度：0.2bar；第一干燥阶段，温度：-8℃，时间：420分钟，真空度：0.2bar；第二干燥阶段，温度：0℃，时间：180分钟，真空度：0.2bar；第三干燥阶段，温度：10℃，时间：180分钟，真空度：0.2bar；第四干燥阶段，温度：24℃，时间：95分钟，真空度：0.2bar。步骤6中所述复合胶原膜进行交联包括：首先进行高温真空交联，对胶原膜先进行高温真空的物理交联，交联条件为：温度为90-110℃，时间为24-36小时；然后使用低浓度的戊二醛作为交联剂，对胶原膜进行化学交联，交联条件为：戊二醛的浓度为0.001％-0.01％，温度为0-15℃，时间为10-36小时。步骤7中，所述将交联后的复合胶原膜进行灭菌为使用环氧乙烷、co60辐照、紫外辐照中的至少一种方法进行灭菌。所述使用环氧乙烷灭菌包括：环氧乙烷占环氧乙烷和二氧化碳混合气体的比例为40％-60％，温度为50-60℃,湿度为20％-50％rh，时间为2-5小时,换气次数为4-7次。实施例1i型胶原溶胀液的制备将从牛跟腱中提取的高纯度i型胶原蛋白解冻，取3克胶原蛋白溶解于500毫升浓度为0.5％乙酸溶液中，搅拌1-2小时，得到胶原乙酸溶胀液。胶原-硫酸软骨素浆液的制备将400毫升浓度为0.4％的硫酸软骨素乙酸水溶液缓慢加入到上述胶原乙酸溶胀液中，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌时间为1-2小时，抽真空去泡，得到胶原-硫酸软骨素浆液。致密胶原膜的制备将150毫升上述胶原-硫酸软骨素浆液倒入到不锈钢冻干盘中，倒入后的厚度为4±2毫米，通过特殊的梯度冷却干燥的方法进行冷冻干燥，得到胶原膜。通过压胶原机将胶原膜压制成厚度为1-2毫米的致密胶原层。复层可吸收生物膜的制备将致密胶原膜平铺在不锈钢冻干盘中，将100毫升的胶原–硫酸软骨素浆液均匀地倒在致密胶原膜上，控制其总厚度在3-6毫米，通过缓冻干燥的方法进行冷冻干燥，得到具有疏松层和致密层的复层可吸收生物膜，具体的冷冻干燥程序如表1所示：表1：步骤号阶段设定温度(℃)时间(分)真空度(bar)1预冻3-5120-180—2冷冻–35-–45310-360—3抽空干燥–8-–10740-9200.24干燥–10.5-–13.5380-4600.25干燥5350-4200.26干燥080-900.27干燥24-3070-1000.2通过此过程得到的孔隙范围为微米。复层可吸收生物膜的交联首先进行高温真空交联，将复层可吸收生物膜放置于真空干燥箱中进行高温真空交联，条件为：温度为100℃，时间为12小时。其次，低浓度的戊二醛作为交联剂，其中，戊二醛的浓度为0.001％，温度为5℃，时间为24小时。复层可吸收生物膜的灭菌将复合胶原膜切割成不同规格，双层包装，利用环氧乙烷灭菌。实施例2i型胶原溶胀液的制备将从牛跟腱中提取的高纯度i型胶原蛋白解冻，取4克胶原蛋白溶解于600毫升浓度为0.5％乙酸溶液中，搅拌1-2小时，得到胶原乙酸溶胀液。胶原-硫酸软骨素浆液的制备将500毫升浓度为0.4％的硫酸软骨素乙酸水溶液缓慢加入到上述胶原乙酸溶胀液中，搅拌速度为15000-20000转/分，搅拌时间为1-2小时，抽真空去泡，得到胶原-硫酸软骨素浆液。致密胶原膜的制备将150毫升的胶原-硫酸软骨素浆液倒入到不锈钢冻干盘中，倒入后的厚度为4±2毫米，通过梯度冷却干燥的方法进行冷冻干燥，得到胶原膜。通过压胶原机将胶原膜i型压制成厚度为1-2毫米的致密胶原层。复层可吸收生物膜的制备将致密胶原膜平铺在不锈钢冻干盘中，在胶原致密膜上刷一层均匀胶原-硫酸软骨素浆液，将胶原膜平整地放在胶原致密层上，控制其总厚度在3-6毫米，通过速冻干燥的方法进行冷冻干燥，得到具有疏松层和致密层的复层可吸收生物膜，具体的冷冻干燥程序如表2所示：表2：步骤号阶段设定温度(℃)保持时间(分)真空度(bar)1冷冻–3840—2抽空干燥–187200.24干燥–84200.25干燥01800.26干燥101800.27干燥24950.2通过此过程得到的孔隙范围为30-150微米。复层可吸收生物膜的交联首先进行高温真空交联，将复层可吸收生物膜放置于真空干燥箱中进行高温真空交联，条件为：温度为95℃，时间为24小时。其次，低浓度的戊二醛作为交联剂，其中，戊二醛的浓度为0.005％，温度为10℃，时间为12小时。复层可吸收生物膜的灭菌将复层可吸收生物膜切割成不同规格，双层包装，利用环氧乙烷灭菌。以上对本发明所提供的一种复层可吸收生物膜的制备方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12