一种可溶性微针贴片及其制备方法与流程
本发明属于生物技术领域，涉及一种可溶性微针贴片及其制备方法。
背景技术：
接种疫苗是预防控制传染病最经济、最有效的措施。近现代疫苗的广泛接种已有效的控制了乙肝、脊髓灰质炎、流感等疾病，甚至消灭了天花等传染病。然而，目前疫苗的接种方式主要是以液体制剂的肌肉注射。肌肉注射需要专业培训的医疗人员操作，产生疼痛，注射后针头处理不当会造成意外刺伤并引起交叉感染，针头和注射器等医疗废物需要特殊处理，此外这些方式的疫苗剂量大。这些缺点导致接种速率慢，接种率低，难以实现传染病大流行快速有效应对，而且容易造成一些血液性传染病传播，造成医疗废物处理的麻烦。此外，大部分疫苗形式是液体制剂，此制剂形式需要冷链系统保存及运输且保存时间短，造成疫苗的成本高，难以实现偏远地区的疫苗接种。因此，亟需建立新的免疫接种方式以改善传统疫苗接种方式的缺点，快速大规模应对传染病大流行。
皮肤含有大量的朗格汉斯细胞和真皮树突状细胞，是一个理想的接种疫苗器官。近几年，以皮肤为免疫靶点的疫苗接种是研究热点。研究者发展大量的以皮肤为靶点的疫苗接种方法。为了突破皮肤角质层的屏障，研究者建立喷射性注射器、超声法、化学促透法等方法。相比上述的疫苗接种方式，以微针为基础的疫苗接种具有独特的优势，其中可溶性微针最具有发展潜力。可溶性微针可精确递送至表皮层或真皮层，研究显示可溶性微针疫苗贴片经皮免疫可实现与肌注射相当或更强的免疫应答。微针刺入后，角质细胞的损伤释放危险相关分子模式增强免疫应答水平。此外，可溶性微针可实现自我接种，且无医疗废物的产生，用完即可弃去。
技术实现要素：
本实验室前期的研究显示单独的以蛋白聚糖如硫酸软骨素(含或不含二糖)为基质材料的微针脆性高，随着放置时间的延长，针体会裂，但具有较好的稳定疫苗的活性的功能。本实验为了解决目前可溶性微针的缺点，提供一种制备简单，疫苗递送效率高，高长期稳定性且具有较好的硬度和韧性的可溶性微针疫苗贴片及其制备方法，实现疫苗皮内免疫。本发明所提供的可溶性微针疫苗贴片可直接贴于皮肤上，产生体液免疫和细胞免疫应答反应并提供免疫保护力。
本发明所提供的可溶性微针贴片，为如下(a)或(b)：
(a)一种可溶性微针疫苗贴片，由背衬、不含疫苗的基底部分和含有疫苗的针体部分组成；
所述针体部分由蛋白聚糖水溶性材料、纤维素类水溶性材料、保护剂和疫苗组成；
在所述针体部分中，所述蛋白聚糖水溶性材料、所述纤维素类水溶性材料和所述保护剂的质量配比为(1-3)：(5-7)：(0.5-2)，具体如2：6：0.8；
(b)一种可溶性微针药物贴片，由背衬、不含药物的基底部分和含有药物的针体部分组成；
所述针体部分由蛋白聚糖水溶性材料、纤维素类水溶性材料、保护剂和药物组成；
在所述针体部分中，所述蛋白聚糖水溶性材料、所述纤维素类水溶性材料和所述保护剂的质量配比为(1-3)：(5-7)：(0.5-2)，具体如2：6：0.8。
所述蛋白聚糖水溶性材料包含但不限于硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、透明质酸。
所述纤维素类水溶性材料包含但不限于羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素。
在本发明的一个实施例中，所述针体部分由硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素、保护剂和疫苗组成。在所述针体部分中，所述硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素和所述保护剂的质量配比为(1-3)：(5-7)：(0.5-2)，具体如2：6：0.8。
更加具体的，本发明中所选用的所述硫酸软骨素的分子量范围是10-1000kda；所述羟丙基甲基纤维素的标记黏度为5-50mpa·s；所述聚乙烯醇的分子量范围是10-1000kda。
其中，硫酸软骨素能减少微针制备过程中疫苗的活性损失，保护疫苗的活性。羟丙基甲基纤维素能增强微针的硬度。本发明中硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素和海藻糖三种材料配伍形成的微针针体具有较高的硬度和较好的疫苗稳定性。
本发明的发明人研究发现所述硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素和所述保护剂的质量配比在“(1-3)：(5-7)：(0.5-2)”范围外时，硫酸软骨素含量多则微针保存时间短，羟丙基甲基纤维素含量多则疫苗活性损失多，海藻糖多则针体硬度低载药量低。
所述疫苗包含但不限制于流感病毒疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、狂犬病疫苗、蓖麻毒素疫苗、卡介苗、鼠疫疫苗、炭疽疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗、乙肝疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、霍乱疫苗、麻腮风疫苗、、肉毒菌毒素疫苗、脊髓灰质炎疫苗、甲肝疫苗、流脑疫苗、乙脑疫苗、其他dna疫苗、减毒活疫苗，特别优选的是流感病毒疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、蓖麻毒素疫苗和狂犬病疫苗。
所述流感病毒疫苗，可为不同来源如人、禽和猪等，可为不同型别的流感病毒如h1n1、h3n2……hxny，b型疫苗。所述流感病毒疫苗可为流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗、流感病毒基因工程疫苗、流感病毒亚单位疫苗、流感病毒通用疫苗或流感病毒核酸疫苗(包含dna疫苗和mrna疫苗)，此外还可为流感病毒plga微球疫苗。特别优选的是，不同型别流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗的一价或多价。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗具体为甲型h7n9流感全病毒灭活疫苗、流感病毒a/california/7/2009(h1n1)裂解疫苗、甲型流感病毒a/hongkong/4801/2014(h3n2)裂解疫苗、流感病毒b/brisbane/60/2008(victoria系)裂解疫苗或四价流感病毒裂解疫苗。其中，所述四价流感疫苗组分为：a/california/7/2009(h1n1)pdm09类似株；a/hongkong/4801/2014(h3n2)类似株；b/brisbane/60/2008(victoria系)类似株；b/phuket/3073/2013(yamagata系)类似株。
所述金黄色葡萄球菌疫苗可为金黄色葡萄球菌灭活疫苗或减毒疫苗，重组亚单位疫苗中的任一种或任几种。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗具体为重组金黄色葡萄球菌肠毒素b蛋白疫苗。
所述蓖麻毒素疫苗可为蓖麻毒素脱毒疫苗和重组蓖麻毒素疫苗中的任一种或任几种。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗具体为蓖麻毒素蛋白疫苗。
所述狂犬病毒疫苗可为不同细胞系狂犬病毒灭活疫苗和狂犬核酸疫苗中的任一种或任几种。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗具体为辽宁成大生物股份有限公司生产的冻干人用狂犬病疫苗(vero细胞)，国药准字s20043089。
所述疫苗可包含佐剂，佐剂包含但不限制于cpg、mpl、壳聚糖、细胞因子、脂质体、rna佐剂中的一种或几种。
所述药物为治疗性药物或预防性药物。其中，所述治疗性药物包含但不限于降糖药如胰岛素、二甲双胍等，抗心律失常药如盐酸美西律等，甾体类抗炎药氢化可的松、氢化泼尼松等，血管扩张剂如盐酸地尔硫卓等，降压剂如盐酸可乐定、盐酸布尼洛尔、卡托普利等，单克隆抗体。
所述保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、白蛋白、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、聚糖、糊精、精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸中的至少一种。特别优选的是海藻糖、蔗糖、葡萄糖酸钙中的至少一种。
所述针体部分中的各组分均匀分布。
本发明中，所述基底部分具体为聚乙烯醇。
本发明中，所述背衬具体为压敏胶贴片。
在本发明中，所述可溶性微针贴片由一个或多个0.5-1平方厘米阵列组合而成(多个阵列可提高贴片的疫苗含量，以满足人和大动物的免疫剂量)，其中每平方厘米含36-324根(如196根)微针，每根微针的高度在100-1000微米之间(如550微米)，针尖的直径为1-10微米之间(如10微米)，微针最大的截面顶角为20-60度(如20度)。
本发明所提供的制备可溶性微针贴片的方法，具体可为如下方法a或方法b：
方法a，包括如下步骤(a1)和(a2)：
(a1)向含有疫苗或药物的溶液中加入质量配比为(1-3)：(5-7)：(0.5-2)(具体如2：6：0.8)的蛋白聚糖水溶性材料、纤维素类水溶性材料和保护剂，混匀后得到针体基质溶液；
其中，所述含有疫苗的溶液中疫苗的蛋白浓度为0-10mg/ml，不含端点值0mg/ml。具体如1mg/ml、3.1mg/ml、3mg/ml。
(a2)将用于制备可溶性微针贴片的模具放置好，抽真空(优选的真空要达到0.05-0.1mpa)，然后将所述针体基质溶液滴加于所述模具内，待所述针体基质溶液填满模具针孔后，再将用于制备微针基底部分的基底溶液滴加于含有所述针体基质溶液的模具上，2-37℃温度下干燥后压敏胶(即背衬)贴于微针基底上脱模，即得所述可溶性微针贴片。
方法b，包括如下步骤(b1)和(b2)：
(b1)向含有疫苗或药物的溶液中加入质量配比为(1-3)：(5-7)：(0.5-2)(具体如2：6：0.8)的蛋白聚糖水溶性材料、纤维素类水溶性材料和保护剂，然后进行冻干处理，再向所得冻干粉中加入减量的注射用水，混匀后得到针体基质溶液；
所述减量是指加入的所述注射用水的量比所述含有疫苗的溶液中的溶剂的量更少；
其中，所述含有疫苗的溶液中疫苗的蛋白浓度为0-10mg/ml，不含端点值0mg/ml。具体如1mg/ml、3.1mg/ml、3mg/ml。
(b2)将用于制备微针贴片的模具放置好，抽真空(优选的真空要达到0.05-0.1mpa)，然后将所述针体基质溶液滴加于所述模具内，待所述针体基质溶液填满模具针孔后，再将用于制备微针基底部分的基底溶液滴加于含有所述针体基质溶液的模具上，2-37℃温度下干燥后压敏胶(即背衬)贴于微针基底上脱模，即得所述可溶性微针贴片。
其中，所述方法b是在所述方法a基础上的改进，适用于部分疫苗或药物浓度低，难以满足较高的免疫剂量或给药剂量需求的情况。
所述蛋白聚糖水溶性材料包含但不限于硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、透明质酸。
所述纤维素类水溶性材料包含但不限于羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素。
在本发明中，所述“向含有疫苗或药物的溶液中加入质量配比为(1-3)：(5-7)：(0.5-2)的蛋白聚糖水溶性材料、纤维素类水溶性材料和保护剂”具体为：向含有疫苗或药物的溶液中加入质量配比为2：6：0.8的硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素和海藻糖。
更加具体的，本发明中所选用的所述硫酸软骨素的分子量范围是10-1000kda；所述羟丙基甲基纤维素的标记黏度为5-50mpa·s；所述聚乙烯醇的分子量范围是10-1000kda。
所述疫苗包含但不限制于流感病毒疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、狂犬病疫苗、蓖麻毒素疫苗、卡介苗、鼠疫疫苗、炭疽疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗、乙肝疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、霍乱疫苗、风疹疫苗、麻疹疫苗、肉毒菌毒素疫苗、疱疹病毒疫苗、其他dna疫苗、减毒活疫苗，特别优选的是流感病毒疫苗、金黄色葡萄球菌疫苗、蓖麻毒素疫苗和狂犬病疫苗。
所述流感病毒疫苗，可为不同来源如人、禽和猪等，可为不同型别的流感病毒如h1n1、h3n2……hxny，b型疫苗。所述流感病毒疫苗可为流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗、流感病毒基因工程疫苗、流感病毒亚单位疫苗、流感病毒通用疫苗或流感病毒核酸疫苗(包含dna疫苗和mrna疫苗)，此外还可为流感病毒plga微球疫苗。特别优选的是，不同型别流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗的一价或多价。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗具体为甲型h7n9流感全病毒灭活疫苗、流感病毒a/california/7/2009(h1n1)裂解疫苗、甲型流感病毒a/hongkong/4801/2014(h3n2)裂解疫苗、流感病毒b/brisbane/60/2008(victoria系)裂解疫苗或四价流感病毒裂解疫苗。其中，所述四价流感疫苗组分为：a/california/7/2009(h1n1)pdm09类似株；a/hongkong/4801/2014(h3n2)类似株；b/brisbane/60/2008(victoria系)类似株；b/phuket/3073/2013(yamagata系)类似株。
所述金黄色葡萄球菌疫苗可为金黄色葡萄球菌灭活疫苗或减毒疫苗，重组亚单位疫苗中的任一种或任几种。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗具体为重组金黄色葡萄球菌肠毒素b蛋白疫苗。
所述蓖麻毒素疫苗可为蓖麻毒素脱毒疫苗和重组蓖麻毒素疫苗中的任一种或任几种。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗具体为蓖麻毒素蛋白疫苗。
所述狂犬病毒疫苗可为不同细胞系狂犬病毒灭活疫苗和狂犬核酸疫苗中的任一种或任几种。
在本发明的一个实施例中，所述疫苗具体为辽宁成大生物股份有限公司生产的冻干人用狂犬病疫苗(vero细胞)，国药准字s20043089。
所述疫苗可包含佐剂，佐剂包含但不限制于cpg、mpl、壳聚糖、细胞因子、脂质体、rna佐剂中的一种或几种。
所述药物为治疗性药物或预防性药物。其中，所述治疗性药物包含但不限于降糖药如胰岛素、二甲双胍等，抗心律失常药如盐酸美西律等，甾体类抗炎药氢化可的松、氢化泼尼松等，血管扩张剂如盐酸地尔硫卓等，降压剂如盐酸可乐定、盐酸布尼洛尔、卡托普利等，单克隆抗体。
所述保护剂选自海藻糖、蔗糖、乳糖、白蛋白、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、甘露醇、肌醇、山梨醇、聚乙二醇、聚糖、糊精、精氨酸、脯氨酸、色氨酸、谷氨酸、谷氨酸钠、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸中的至少一种。特别优选的是海藻糖、蔗糖、葡萄糖酸钙中的至少一种。
所述基底溶液为质量百分含量为30-40％的聚乙烯醇水溶液。
在步骤(a1)和(a2)之间，还可包括将所述针体基质溶液静置10-60min(如30min)后，3000-5000rpm(如5000rpm)离心5-60min(如10min)的步骤；在步骤(b1)和(b2)之间，还可包括将所述针体基质溶液静置10-60min(如30min)后，3000-5000rpm(如5000rpm)离心5-60min(如10min)的步骤。静置是为了材料充分溶解，离心的目的是为了赶除气泡。
在步骤(a2)和(b2)中，抽真空的目的是为了促使所述针体基质溶液完全填充针孔。
在本发明中，所述模具具体满足如下条件：利用所述模具制备得到的微针贴片由一个或多个0.5-1平方厘米阵列组合而成(多个阵列可提高贴片的疫苗含量，以满足人和大动物的免疫剂量)，其中每平方厘米含36-324根微针，每根微针的高度在100-1000微米之间，针尖的直径为1-10微米之间，微针最大的截面顶角为20-60度。
本发明微针制备环境条件是2-8℃或室温下制备，湿度维持在20％-60％之间。
由所述方法制备得到的可溶性微针疫苗贴片也属于本发明的保护范围。
本发明制备的可溶性微针具有良好的韧性和硬度，良好的长期稳定性。
本发明的可溶性微针制备材料硫酸软骨素是药用级的，而且硫酸软骨素是机体组织的重要组成成分，而且可以作为药物治疗疾病，具有高安全性，对人无副作用；基底材料的聚乙烯醇、针体材料羟丙基甲基纤维素是药典中批准使用的药用辅料，同样具有高度的安全性；此外，本发明可溶性微针流感疫苗贴片可快速溶于皮内不会产生医疗废物，降低医疗成本。微针贴片占用体积小，运输方便。常温下保存时间较液态制剂流感疫苗长。制作工艺简单，生产成本低，可大规模批量生产。
附图说明
图1为可溶性微针流感疫苗贴片的制备流程示意图。。
图2为可溶性微针流感疫苗贴片微针图。
图3为负载fitc标记的流感疫苗的微针图。
图4为可溶性微针流感疫苗贴片穿刺皮肤情况。其中，a为组织冷冻切片图，b为荧光显微镜下图。
图5为微针溶解速率和递送效率结果。
图6为微针刺入猪皮肤的刺入深度检测结果。
图7为实施例2中的血凝抑制试验以及血清igg总量水平检测结果。其中，a为血清igg水平结果；b为血凝抑制试验结果。
图8为实施例3中的血凝抑制试验以及血清igg总量水平检测结果。其中，a为血清igg水平结果；b为血凝抑制试验结果。
图9为实施例3中elispot试验检测il-4和ifn-γ分泌细胞水平结果。其中a为il-4分泌细胞；b为ifn-γ分泌细胞水平
图10为实施例3中攻毒后各组小鼠体重变化和生存率变化结果。其中，a为体重变化结果；b为生存率变化结果。
图11为实施例3中攻毒后各组小鼠肺组织病毒载量结果。
图12为实施例3中攻毒后各组小鼠肺组织病变情况。其中，a为攻毒后pbs对照组小鼠；b为肌肉注射组小鼠；c为微针免疫组小鼠。
图13为实施例4中血凝抑制试验以及血清igg总量水平检测结果。其中，a为血清igg水平结果；b为血凝抑制试验结果。
图14为实施例5中血凝抑制试验以及血清igg总量水平检测结果。其中，a为血清igg水平结果；b为血清血凝抑制试验结果。
图15为实施例6中血凝抑制试验结果。其中，a、b、c和d分别对应a/california/7/2009(h1n1)pdm09类似株、a/hongkong/4801/2014(h3n2)类似株、b/brisbane/60/2008(victoria系)类似株和b/phuket/3073/2013(yamagata系)类似株的结果。
图16为实施例6中血清igg水平检测结果。其中，a、b、c和d分别对应a/california/7/2009(h1n1)pdm09类似株、a/hongkong/4801/2014(h3n2)类似株、b/brisbane/60/2008(victoria系)类似株和b/phuket/3073/2013(yamagata系)类似株的结果。
图17为实施例7中血清igg水平检测结果。
图18为实施例7中seb免疫后攻毒小鼠生存率变化。
图19为实施例8中血清igg水平检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量实验均设置3次以上的重复，结果取均值。
本发明中所选用的所述硫酸软骨素为日本化成工业株式会社产品，编号为5-036。所述羟丙基甲基纤维素为阿拉丁试剂(上海)有限公司产品，编号为h108815，黏度15mpa·s。所述聚乙烯醇为sigma-aldrich公司产品，编号为p-1763。
实施例1、可溶性微针流感病毒疫苗贴片的制备及鉴定
一、可溶性微针流感病毒疫苗贴片的制备
供试流感病毒疫苗有如下几种：甲型h7n9流感全病毒灭活疫苗、流感病毒a/california/7/2009(h1n1)裂解疫苗、甲型流感病毒a/hongkong/4801/2014(h3n2)裂解疫苗、流感病毒b/brisbane/60/2008(victoria系)裂解疫苗、四价流感病毒裂解疫苗。其中，四价流感疫苗组分为：a/california/7/2009(h1n1)pdm09类似株；a/hongkong/4801/2014(h3n2)类似株；b/brisbane/60/2008(victoria系)类似株；b/phuket/3073/2013(yamagata系)类似株。
其中，所述甲型h7n9流感全病毒灭活疫苗及其具体的制备方法参见“zhongpengzhao,chuanbofan,yueqiangduan,etal.protectionfrominfectionwithinfluenzaah7n9virusinamousemodelbyequineneutralizingf(ab′)2.internationimmunopharmacology,23(2014):134-138”一文。所述流感病毒a/california/7/2009(h1n1)裂解疫苗、所述甲型流感病毒a/hongkong/4801/2014(h3n2)裂解疫苗、所述流感病毒b/brisbane/60/2008(victoria系)裂解疫苗和所述四价流感病毒裂解疫苗均为北京科兴生物制品有限公司产品。
取蛋白浓度为1mg/ml的流感病毒疫苗溶液，向其中加入硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素和海藻糖，得到针体基质溶液；所得针体基质溶液中硫酸软骨素的含量为2％(w/w)，羟丙甲基纤维素的含量为6％(w/w)，海藻糖的含量为0.8％(w/w)。将所述针体基质溶液于室温下放置30min(使材料充分溶解)，5000rpm离心10min(赶除气泡)，然后取一定量的针体基质溶液滴加于模具上，抽真空(真空达到0.05-0.1mpa)，促使微针针体基质溶液完全填充针孔；配制35％(w/w)的聚乙烯醇溶液(溶剂为水)作为基质溶液，滴加于含有针体基质溶液的模具上。室温下过夜干燥，0-37℃温度下干燥后压敏胶(即背衬)贴于微针基底上脱模，形成针高550微米、196根微针(0.64平方厘米含有196根微针)、针尖的直径为10微米、微针最大的截面顶角为20度的可溶性微针流感疫苗贴片。
为了便于对所得可溶性微针流感疫苗贴片进行可视化鉴定，实验同时设置了经fitc或罗丹明标记的流感病毒疫苗可溶性微针贴片组。
图1为可溶性微针流感疫苗贴片的制备流程示意图。图2为可溶性微针流感疫苗贴片微针图。
二、可溶性微针流感病毒疫苗贴片的鉴定
图3为负载fitc标记的流感疫苗的微针图。将fitc标记的流感病毒疫苗负载于可溶性微针的针体上，观察微针内疫苗的分布，如图3所示，fitc标记的疫苗主要分布于微针的针体，基底无荧光。
图4显示的是可溶性微针流感疫苗贴片穿刺皮肤情况。由于猪皮肤的组织结构与人皮肤组织结构相近，因此以猪皮肤代替人皮肤，检测微针的硬度。将负载有罗丹明的可溶性微针，用大拇指按压于猪皮肤上30s，揭下贴片，使用o.c.tcompound冷冻包埋剂包埋放置-20℃固定，使用冷冻组织切片机切取9μm的组织切片，观察微针刺入情况。如图4所示，可见猪皮组织切片具有针孔，说明微针具有足够的硬度可刺穿皮肤角质层进入皮内实现疫苗的递送。
图5显示的是微针的溶解速率检测和递送量测定。将fitc标记的流感病毒疫苗负载于可溶性微针，微针贴于小鼠腹部皮肤上分别于0min、1min、3min和6min揭下贴片，显微镜下观察微针溶解情况，然后pbs溶解测定微针贴片的残余荧光强度，从而计算皮内进入量。结果如图5所示，可见负载疫苗的微针针体部分在6min内已完全溶解，且皮内递送量70％。
图6显示的是微针刺入猪皮肤的刺入深度检测。将负载有罗丹明的可溶性微针贴于猪皮上30s后，揭下后固定于载玻片上，放置于激光共聚焦显微镜载物台上，以猪皮肤表面为扫描的起点(z＝0)，以无可见的荧光为扫面的终点，沿垂直于皮肤表面的xy平面的z轴，间隔20μm进行逐层扫描，如图6所示，微针刺入皮肤后可刺入的深度为320微米。
实施例2、以实施例1的方法制备的负载甲型h7n9流感全病毒灭活疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果检测
本实施例对以实施例1的方法制备得到的负载甲型h7n9流感全病毒灭活疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果进行了检测，具体如下：
一、实验方法
1、免疫
将balb/c小鼠分为微针免疫组、肌肉注射组和空白对照组，每组6只小鼠。预先将小鼠的腹部皮肤剃去，再用脱毛膏除去残余的毛发。将贴片贴于小鼠腹部皮肤上，固定6min。每只小鼠一次免疫贴两片微针贴片，每片贴片含流感疫苗蛋白含量2μg；肌肉注射组给予小鼠同等剂量疫苗；空白对照组注射磷酸盐缓冲液100μl/只。
免疫程序：共免疫两次，分别在第0天和第21天免疫balb/c小鼠。
2、血凝抑制试验检测血清中血凝抑制效价
①4个血凝单位的配制
a、血凝试验判定抗原的血凝效价；
b、抗原的血凝效价除以8，获得的数即为抗原的稀释倍数，其中50μl中含有8个血凝单位，25μl则含有4个血凝单位；
c、血凝单位进行验证，稀释好的4个血凝单位，第一孔加入100μl稀释好后液体，然后依次倍比稀释，加入50μl鸡红细胞，红细胞凝集4个孔。
②血凝抑制试验
a、眼底静脉丛采血约200μl于离心管内，37℃，放置30min；
b、将凝固后的血液放置于离心机内，3000rpm，离心10min；
c、吸取6μl血清和18μlrde(受体破坏酶，为日本生研株式会社产品，编号为340122)，混匀后，放置37℃孵育18-20h；
d、调温度至56℃，孵育30min-60min；
e、取出后离心30s，加入36μlpbs溶液，混匀后，吸取50μl至96孔v型血凝板第一排；
f、其余各孔均加入25μl生理盐水，然后从第一孔吸取25μl混合液加入第二孔混匀，然后再加入第三孔依次进行倍比稀释，最后一孔吸出25μl弃去；
g、每孔均加入配制好的4个血凝单位的抗原25μl；
h、混匀后，室温下孵育30min；
i、每孔加入50μl新鲜配置好的鸡红细胞，室温下放置30min；
j、判定血抑效价，以完全抑制红细胞沉积的血清最高稀释度的倒数作为血清的血抑效价。
3、酶联免疫吸附试验检测igg总量
①将抗原稀释至一定浓度后，每孔加入50μl，放置4℃过夜；
②然后加入封闭液100μl，37℃封闭2h；
③分离好小鼠血清，在ep管中稀释100倍，然后加到96孔酶联板中第一列，其余各孔均加50μltsta(稀释液)，然后从第一孔吸出50μl，加入第二孔混匀，然后依次倍比稀释，最后一孔弃去50μl；
④封口膜封闭，放置37℃，孵育40min；
⑤每孔加入pbst洗涤液，洗去残余血清，洗涤2-3次，每次3-5min；
⑥hrp酶标二抗稀释液稀释10000倍，每孔加入50μl，37℃孵育20min；
⑦弃去酶标二抗液，加入pbst洗涤液洗涤2-3次，每次放置3-5min；
⑧加入显色液50μl，放置15min；
⑨加入终止液(2mol/l的硫酸)终止反应
⑩放置酶标仪中，调波长至450nm，测定od值。
二、实验结果
1、血凝抑制试验结果
初次免疫和加强免疫后两周眼底静脉丛采集血液并分离血清，进行血凝试验，结果如图7中a所示，微针皮内免疫与肌肉注射免疫血凝抑制效价与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)；微针免疫组血抑效价与肌肉注射组无统计学差异(p>0.05)；说明可溶性微针皮内免疫可实现与肌肉注射免疫相当的免疫应答水平。
2、血清igg水平
血清分离后，进行elisa试验检测血清特异性抗体总量水平及抗体亚型水平。如图7中b所示，微针皮内免疫与肌肉注射免疫igg水平与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)，微针免疫组抗体效价与肌肉注射组无统计学差异(p>0.05)。
实施例3、以实施例1的方法制备的负载流感病毒a/california/7/2009(h1n1)裂解疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果检测
本实施例对以实施例1的方法制备的负载流感病毒a/california/7/2009(h1n1)裂解疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果进行了检测，具体如下：
一、实验方法
1、免疫
同实施例2。
2、血凝抑制试验检测血清中血凝抑制效价
同实施例2。
3、酶联免疫吸附试验检测igg水平
同实施例2。
4、固相酶联免疫斑点实验检测il-4和ifn-γ分泌细胞水平
①将捕获抗体用pbs溶液按1:200稀释，每孔加入100μl稀释后的捕获抗体至elispot板子内，4℃过夜放置；
②弃去包被液，每孔加入200μl封闭液清洗一次，然后每孔加入200μl封闭液，室温下放置2h；
③将抗原和非特异性刺激剂(pma或cona)用10％1640完全培养基稀释到一定浓度后，每孔加入100μl；
④将分离后的脾细胞计数后，调浓度至2×106/ml，每孔加入细胞悬液100μl，并作细胞对照，培养基对照和阳性对照；
⑤将加好的板子小心放置于细胞培养箱内，37℃，5％co2放置36h，避免震荡或晃动，培养过程中避免移动板子而造成拖尾现象；
⑥弃去细胞培养液，加入去离子水洗涤两次，每次放置3-5min；
⑦弃去去离子水，每孔加入200μlpbst洗涤液，洗涤3次；
⑧含10％血清pbs溶液按1:250稀释检测抗体，每孔加入100μl，室温放置2h；
⑨弃去检测抗体，每孔加入pbst洗涤液洗涤3次；
⑩使用10％血清pbs溶液按1:100稀释酶标亲和素，每孔加入100μl，室温下放置1h；
5、本实施例攻毒后肺病毒载量检测
①攻毒后第4天，摘除眼球放出多余的血，处死小鼠，消毒后取出小鼠肺脏放置于无血清dmem培养基中；
②使用匀浆器将肺组织匀浆，释放出流感病毒，5000rpm，离心10min，去除细胞和组织碎片；
③将提前一天给mdck细胞换培养基；
④将细胞液弃去后，pbs溶液清洗两次，加入胰酶将细胞消化下来；
⑤加入一定量的完全培养基抑制胰酶活性终止消化，1000rpm，离心5min；
⑥弃去上清，加入无血清dmem培养基，重悬细胞，调细胞浓度至2.2×105/ml，每孔加入100μl，放置细胞培养箱中8h；
⑦弃去培养基，每孔加入dmem无血清培养基(含8ng/mltpck)100μl，第一列再补加31.4μl培养基，然后加入14.6μl肺脏匀浆液上清；
⑧混匀后，从第一孔吸出46μl加入第二孔混匀，然后在吸出46μl，依次进行半对数稀释；
⑨放置细胞培养箱中，培养5d，每孔吸出50μl加入96孔血凝板中，然后加入50μl新鲜配制的1％鸡红细胞，室温放置45min，判定每组凝集孔；
⑩通过reed-muench法计算tcid50。
6、攻毒后肺组织病变情况
①攻毒后第4天，处死小鼠后，取出小鼠肺脏；
②肺脏放入4％甲醛溶液中固定；
③固定后的肺脏石蜡包埋，切片he染色，显微镜下观察肺组织病变情况。
7、攻毒后小鼠体重变化情况和生存率变化
攻毒后，从第0天开始检测小鼠病变情况及体重变化和生存率变化，检测14天。
二、实验结果
1、血凝抑制试验结果
初次免疫和加强免疫后两周眼底静脉丛采集血液并分离血清，进行血凝试验，结果如图8中a所示，微针皮内免疫与肌肉注射免疫血凝抑制效价与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)；微针免疫组血抑效价与肌肉注射组无统计学差异(p>0.05)；说明可溶性微针皮内免疫可实现与肌肉注射免疫相当的免疫应答水平。
2、血清igg总量和特异性抗体亚型水平
血清分离后，进行elisa试验检测血清特异性抗体总量水平及抗体亚型水平。如图8中b所示，微针皮内免疫与肌肉注射免疫igg水平与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)，微针免疫组抗体效价与肌肉注射组无统计学差异(p>0.05)。
3、elispot试验检测il-4和ifn-γ分泌细胞水平
第二次免疫后14天处死小鼠，分离脾细胞，进行elispot试验，结果如图9所示，微针皮内免疫和肌肉注射免疫il-4和ifn-γ分泌细胞水平均高于空白对照组，微针免疫的ifn-γ分泌细胞水平明显高于肌肉注射组且有统计学差异；il-4分泌细胞水平两种免疫方式水平相当，无统计学差异。
4、攻毒后体重变化和生存率变化
为了检测微针经皮免疫的保护效果，流感h1n1裂解疫苗第二次免疫后14天攻毒，每只小鼠给予10ld50h1n1(bj501)流感病毒(参考文献“guangyuzhao,shihuisun,lanyingdu,etal.researchanh5n1m2e-basedmultipleantigenicpeptidevaccineconfersheterosubtypicprotectionfromlethalinfectionwithpandemic2009h1n1virus.virologyjournal,2010,7:151”中的a/beijing/501/09)，检测攻毒后小鼠体重变化和生存率变化。如图10所示微针组和肌肉注射组体重降低均小于10％，而且全部生存。说明微针疫苗经皮免疫引起了有效的免疫反应抵抗致死剂量的病毒感染。未免疫小鼠在7天以内全部死亡。说明可溶性微针免疫与肌肉注射均能实现相当的保护水平。
5、攻毒后肺组织病毒载量
攻毒后第4天，取肺放置于dmem培养基中，研磨后离心后取上清。使用mdck细胞检测肺脏中流感病毒tcid50。结果如图11所示，未免疫小鼠肺病毒tcid50为103.5，肌肉组小鼠肺病毒tcid50明显降低为101，微针组tcid50小于101，说明免疫后小鼠能有效清除流感病毒，且微针经皮免疫效果更好。
6、攻毒后肺组织病变情况
第二次免疫后14天，以10ld50h1n1(bj501)流感病毒(参考文献“guangyuzhao,shihuisun,lanyingdu,etal.researchanh5n1m2e-basedmultipleantigenicpeptidevaccineconfersheterosubtypicprotectionfromlethalinfectionwithpandemic2009h1n1virus.virologyjournal,2010,7:151”中的a/beijing/501/09)，通过滴鼻感染小鼠，在感染后第4天处死小鼠取肺组织进行病理检查。大体观：对照组肺脏明显水肿，呈现暗红色；免疫组均未见明显的病理变化。肺组织经甲醛固定，石蜡包埋切片，he染色，攻毒后pbs对照组镜下观察如图12中a所示，发现肺组织表现为中重度炎症，大量的炎性细胞浸润，部分肺组织已实变，无正常结构，肺泡间隔明显增厚，水肿；肺泡可见浸润的炎性细胞，主要为巨噬细胞和淋巴细胞，此外还可见纤维素；气管管壁细胞发生脱落、不完整。肌肉注射组肺组织病理如图12中b显示肺组织仅表现轻度的间质炎症，肺间质观察到炎性细胞浸润和炎性渗出物。微针免疫组肺组织病理如图12中c所示，肺组织仅表现轻微的炎症，仅有少量的炎性细胞和炎性渗出液，组织病变轻微。
实施例4、以实施例1的方法制备的负载甲型流感病毒a/hongkong/4801/2014(h3n2)裂解疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果检测
本实施例对以实施例1的方法制备的负载甲型流感病毒a/hongkong/4801/2014(h3n2)裂解疫苗的可溶性微针贴片进行了免疫效果检测，具体如下：
一、实验方法
1、免疫
同实施例2。
2、血凝抑制试验检测血清中血凝抑制效价
同实施例2。
3、酶联免疫吸附试验检测igg总量及亚型
同实施例2。
二、实验结果
血凝抑制试验结果如图13中a所示，微针皮内免疫与肌肉注射免疫血凝抑制效价与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)；微针免疫组血抑效价比肌肉注射组水平高且有统计学差异(p<0.05)；说明可溶性微针皮内免疫可实现与肌肉注射免疫更高的免疫应答水平。
elisa结果如图13中b所示，微针皮内免疫与肌肉注射免疫igg水平与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)，微针免疫组抗体效价高于肌肉注射组且有统计学差异(p<0.05)。
实施例5、以实施例1的方法制备的负载流感病毒b/brisbane/60/2008(victoria系)裂解疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果检测
本实施例对以实施例1的方法制备的负载流感病毒b/brisbane/60/2008(victoria系)裂解疫苗的可溶性微针贴片进行了免疫效果检测，具体如下：
一、实验方法
1、免疫
同实施例2。
2、血凝抑制试验检测血清中血凝抑制效价
同实施例2。
3、酶联免疫吸附试验检测igg总量及亚型
同实施例2。
二、实验结果
血凝抑制试验结果如图14中a所示，微针皮内免疫与肌肉注射免疫血凝抑制效价与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)；微针免疫组血抑效价比肌肉注射组水平高且有统计学差异(p<0.05)；说明可溶性微针皮内免疫可实现与肌肉注射免疫更高的免疫应答水平。
elisa结果如图14中b所示，微针皮内免疫和肌肉注射免疫igg水平与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)，微针免疫组抗体效价高于肌肉注射组且有统计学差异(p<0.01)。
实施例6、以实施例1的方法制备的负载四价流感病毒裂解疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果检测
本实施例对以实施例1的方法制备的负载四价流感病毒裂解疫苗的可溶性微针贴片进行了免疫效果检测，具体如下：
一、实验方法
1、免疫
同实施例2。
2、血凝抑制试验检测血清中血凝抑制效价
同实施例2。
3、酶联免疫吸附试验检测igg总量
同实施例2。
二、实验结果
血凝抑制试验结果如图15所示，微针皮内免疫中四价疫苗中每一单价均产生免疫应答，且血凝抑制效价水平和肌肉注射免疫血凝抑制效价与空白对照组相比均有统计学差异(p<0.001)；微针免疫组四价流感疫苗各单价疫苗血抑效价与肌肉注射组水平相当或更高；说明负载四价流感疫苗可溶性微针贴片皮内免疫可实现与肌肉注射免疫相当或更高的免疫应答水平。
elisa结果如图16所示，微针免疫组四价流感疫苗中各单价疫苗的抗体效价水平与肌肉注射组水平相比相当或更高。
实施例7、以实施例1的方法制备的负载重组金黄色葡萄球菌肠毒素b(seb)疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果检测
一、实验方法
1、微针制备
制备浓度为3.1mg/ml的重组金黄色葡萄球菌肠毒素b蛋白疫苗溶液，然后参照实施例1的方法制备负载重组金黄色葡萄球菌肠毒素b蛋白疫苗的可溶性微针贴片。
其中，重组金黄色葡萄球菌肠毒素b蛋白疫苗及其具体的制备方法记载于“赵莉群.重组金黄色葡萄球菌肠毒素b蛋白疫苗的制备及免疫效果评价”一文。
2、免疫
以实施例1方法的制备负载10μg金黄色葡萄球菌疫苗的可溶性微针疫苗贴片，一次免疫每只小鼠贴两片，免疫程序0d，14d，28d各免疫一次，于第一次免疫后14天和35天采血分离血清，检测特异性抗体效价。实验同时设置肌肉注射组(给予小鼠同等剂量疫苗)和空白对照组(注射磷酸盐缓冲液100μl/只)。
3、酶联免疫吸附试验检测igg总量
具体操作参见实施例2。
4、攻毒试验
取野生型seb用pbs溶液配置成50μg/ml，同时取脂多糖(lps)配置成375μg/ml；免疫后每只小鼠腹腔注射200μl配制的seb溶液，4小时后每只小鼠再注射200μl配置成的lps溶液，然后观察小鼠生存率变化。
二、实验结果
如图17所示负载金黄色葡萄球菌疫苗的可溶性微针引起的特异性抗体水平与肌肉注射同等剂量的金黄色葡萄球菌疫苗的水平均高于pbs对照组小鼠的免疫水平且有统计学差异(p<0.001)，微针组与肌肉注射组相比无统计学差异。
如图18所示对照组小鼠3天内全部死亡，负载金黄色葡萄球菌疫苗的可溶性微针和肌肉注射组小鼠均生存。
实施例8、以实施例1的方法制备的负载蓖麻毒素蛋白疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果检测
一、实验方法
1、蓖麻毒素疫苗的制备
取去壳蓖麻籽，加入pbs溶液匀浆后，去除残渣，离心取上清后即可获得粗制品，使用离子交换层析、凝胶过滤层析和离子交换树脂纯化获得纯化后的蓖麻毒素蛋白，然后加入1:1000至1:8000浓度的甲醛溶液室温下放置48-120小时进行脱毒，0.22微米的滤膜除菌获得纯度91％，浓度为3mg/ml的脱毒纯化蓖麻毒素抗原。
2、微针制备
以上述的浓度为3mg/ml的蓖麻毒素蛋白疫苗溶液参照实施例1制备负载蓖麻毒素疫苗的可溶性微针贴片，用于后续的实验。
3、动物免疫
分为微针免疫组和肌肉注射组：微针免疫组每只小鼠贴两片微针，每片微针含蓖麻毒素蛋白10μg；肌肉注射组接种免疫20μg。免疫程序为0、14天免疫。与最后一次免疫后14天采血分离血清进行elisa实验检测血清igg水平。elisa具体操作参见实施例2。
二、实验结果
如图19所示负载蓖麻毒素蛋白的可溶性微针免疫小鼠引起的特异性抗体水平与肌肉注射同等剂量的蓖麻毒素蛋白的特异性抗体水平均高于pbs对照组小鼠的免疫水平且有统计学差异(p<0.001)，微针组与肌肉注射组相比无统计学差异。
实施例9、以实施例1的方法制备的负载狂犬疫苗的可溶性微针贴片的免疫效果检测
一、实验方法
1、狂犬疫毒疫苗的获得
冻干人用狂犬病疫苗(vero细胞)购自辽宁成大生物股份有限公司(国药准字s20043089)。当然也可以按照中国药典2014年版第三部p136培养、收获、浓缩、灭活病毒、纯化后制成狂犬疫毒疫苗。
2、可溶性微针狂犬疫苗贴片的制备
以上述的狂犬疫毒疫苗溶液参照实施例1制备负载狂犬病疫毒苗的可溶性微针贴片，用于后续的实验。
3、暴露后免疫动物
18只3月龄比格犬(购自军事医学科学院实验动物中心)，将cvs标准攻毒株(cvs,kisslingre.growthofrabiesvirusinnon-nervoustissueculture[j].procsocexpbiolmed.1958,98(2):223-225.)接种于后肢肌肉，每只动物攻毒0.1ml。随机分为感染对照组，免疫组1，免疫组2。并于攻毒暴露后6h于暴露位置同侧进行后肢免疫，感染组接种pbs。免疫程序为0，3，7，14，28天免疫五次。
组1和组2，每组9只；将组1和组2又进一步分为a、b、c三个小组，每组3只比格犬；a、b、c三组的剂量分别为0.5iu、1.0iu和2.5iu上述狂犬病毒疫苗；
组1：采用分别载有0.5iu、1.0iu、2.5iu狂犬病疫苗的可溶性微针贴片，在第0、3、7、14、28天进行免疫，免疫方式为以将微针贴于比格犬内耳廓，命名为微针0.5iu、微针1.0iu、微针2.5iu。
组2：采用传统0.5mm*20mm为规格的有针注射器进行免疫，在第0、3、7、14、28天进行皮内免疫0.5iu、1.0iu、2.5iu上述狂犬病毒疫苗，免疫方式为以每剂0.5ml的体积施用于大腿外侧肌肉区域中，命名为有针0.5iu、有针1.0iu、有针2.5iu。
4、暴露后中和抗体效价测定
在各组动物免疫后收集血清，通过快速荧光灶抑制试验，测定待测血清效价。将待测血清与标准品(由国家药品检定机构提供)各稀释度50μl于96孔板中，加入中和用病毒(cvs,kisslingre.growthofrabiesvirusinnon-nervoustissueculture[j].procsocexpbiolmed.1958,98(2):223-225.)50μl/孔，同时设置空白对照(100μl/孔dmem培养基)以及中和用病毒对照(50μl/孔5％牛血清的dmem与50μl/孔中和用病毒)，混匀后置于37℃中和1小时，每孔加入一定量的bhk-21细胞悬液50μl，置于37℃，5％co2培养箱中培养24小时。后吸出培养液，加入pbs清洗并吸出后，每孔加入预冷的浓度为80％的丙酮50μl，4℃固定30分钟，弃丙酮，待挥发干燥后每孔加入工作浓度的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体50μl，37℃孵育30分钟，弃掉液体后，用pbs洗板3次，弃液体，每孔加入80％甘油50μl，置于荧光显微镜下观察，计算公式见2015年版《中国药典》第三部。
二、实验结果
结果见表1所示，不同组别暴露后免疫比格犬血清中和抗体的水平，可以看出pbs对照组与有针0.5iu免疫组在7天内全部死亡，对暴露后比格犬无法产生良好的保护效果。而在注射后第7天其他各免疫组均产生保护效果，在各个时间点各微针注射狂犬病疫苗系统接种的中和抗体效价与肌肉注射2.5iu的抗体效价持平，均对暴露后的比格犬产生了良好的保护效果。
表1比格犬cvs肌内感染后血清抗体效价
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