一种蒲公英氯仿提取物及其制备方法和用途与流程

本发明属于中医药领域，提供了一种蒲公英氯仿提取物的制备方法，该提取物可用于研发治疗二型糖尿病新药。

背景技术：

二型糖尿病，又称非胰岛素依赖型糖尿病。二型糖尿病患者在整个糖尿病人群中占90％～95％。体内糖脂代谢异常是二型糖尿病的主要特征。在二型糖尿病发病的过程中，开始患者的胰岛β细胞还有分泌胰岛素的能力，之后患者机体会产生胰岛素抵抗，导致胰岛β细胞代偿性分泌更多胰岛素来维持正常血糖水平。当患者的胰岛β细胞失去代偿能力之后，血糖水平升高，引起二型糖尿病。二型糖尿病的发病机理十分复杂，尚未完全阐明。目前的研究表明二型糖尿病与遗传和外界环境因素有关。胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗是二型糖尿病的2个主要症状。如果未及时控制，二型糖尿病会导致一系列慢性并发症，例如心血管疾病、视网膜病变、肾功能衰竭等。目前临床已有一系列降糖药物用于改善二型糖尿病患者的血糖水平。目前应用较多的主要有双胍类药物，磺脲类药物和α-糖苷酶抑制剂等药物。而长期服用这些药物有较多副作用，例如肠胃不适和低血糖等。而近年研发的过氧化物酶体增殖物激活物受体γ激动剂噻唑烷二酮类药物也有引起体重增加和水肿等副作用。目前的研究证明二型糖尿病与葡萄糖转运蛋白4(glut4)的表达和转位缺陷有关。因此，可以针对glut4为靶点寻找筛选出治疗二型糖尿病的新药物。

蒲公英，拉丁学名：taraxacummongolicumhand，菊科，属多年生草本植物。在中国黑龙江、吉林、湖北、河南、浙江、安徽等地广泛分布。蒲公英性味甘、微苦、寒，现代医学研究表明蒲公英有利尿、利胆、抗菌、抗肿瘤、抗炎症等功效。而利用蒲公英氯仿提取物促进glut4表达及转运从而治疗二型糖尿病的研究，国内外尚未有相关的报道。

技术实现要素：

本发明提供了一种蒲公英氯仿提取物及其提取方法，并且利用蒲公英氯仿提取物进行了检测细胞glut4表达和转运，为研发蒲公英氯仿提取物药物用于治疗二型糖尿病提供了依据。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种蒲公英氯仿提取物，该物质采用以下方法制备：(1)、选取干燥的蒲公英全草，磨成粉末；

(2)、将所得粉末用乙醇溶液加热回流提取收集提取物；

(3)、对提取物进行离心，然后收集上层液，用旋转蒸发器蒸干，获得乙醇浸膏；

(4)、用超纯水将乙醇浸膏溶解，然后用石油醚萃取，去除油脂；

(5)、用氯仿萃取，将萃取液用旋转蒸发仪蒸干得到浸膏，即获得蒲公英氯仿提取物。

步骤(2)中所述的乙醇溶液的浓度为70-80％，加热温度为65～75度，加热回流提取3-5次。

步骤(4)中采用石油醚萃取3-5次。

步骤(5)中采用氯仿萃取3-5次。

目前在本领域中虽然有采用蒲公英甾醇治疗糖尿病的相关报道，然而蒲公英甾醇是一种单体化合物，与本申请中的蒲公英氯仿提取物不同，本申请中的蒲公英氯仿提取物为混合物。此外，本申请中蒲公英氯仿提取物的药物降血糖机理是促进glut4转位从而增加细胞葡萄糖的摄取，与目前的蒲公英甾醇和蒲公英中药组合物的治疗机理是完全不同的。

本发明中利用蒲公英氯仿提取物进行了检测细胞glut4表达和转运，以及细胞葡萄糖摄取的实验。另外，还研究了蒲公英氯仿提取物的作用机理和相关信号通路。为研发蒲公英氯仿提取物药物用于治疗二型糖尿病提供了依据，因此，本发明所提供的蒲公英氯仿提取物能够应用于制备治疗二型糖尿病药物中。

附图说明

图1.蒲公英氯仿提取物促进l6细胞的葡萄糖摄取；

图2.蒲公英氯仿提取物促进l6细胞glut4转运；

图3.蒲公英氯仿提取物促进l6细胞glut4表达；

图4.蒲公英氯仿提取物促进l6细胞glut4的转运被ampk信号通路抑制剂compoundc抑制；

图5.蒲公英氯仿提取物促进l6细胞ampk的磷酸化。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下实施例。

本实施例中所提供的蒲公英氯仿提取物采用以下方法制备：选取干燥的蒲公英全草，磨成粉末。用75％乙醇溶液加热回流提取3次，收集提取物。对提取物进行离心，然后收集上层液，用旋转蒸发器蒸干，获得乙醇浸膏。用超纯水将乙醇浸膏溶解，然后用石油醚萃取3次，去除油脂。用氯仿萃取3次，将萃取液用旋转蒸发仪蒸干得到浸膏，即获得蒲公英氯仿提取物。

将蒲公英氯仿提取物溶解于3％的dmso中并用于生物活性实验检测，具体步骤如下：

1、细胞葡萄糖摄取实验：

将l6细胞按1×10⁴～5×10⁴的密度种于96孔板内。用含2％fbs的α-mem培养液将l6细胞分化5～7天。然后将细胞饥饿2小时，之后加入含有150μg/ml2-nbdg的30μg/l蒲公英氯仿提取物在37℃培养箱培养30min。30min后对细胞离心5min。去掉上清液，加入葡萄糖检测试剂盒缓冲液离心5min，再去掉上清。再加入试剂盒缓冲液混匀。在485nm激发波长和535发射波长下检测2-nbdg的荧光吸收值。该试验进行了3次独立重复实验，并设立了对照组和胰岛素组。

图1为蒲公英氯仿提取物促进l6细胞的葡萄糖摄取图，如图1所示，蒲公英氯仿提取物显著促进了l6细胞的葡萄糖摄取。而且蒲公英氯仿提取物对l6细胞葡萄糖摄取的促进效果与胰岛素(insulin)相当。

2、激光共聚焦显微镜检测glut4转运：

本发明使用稳定表达irap的l6细胞(irap-morange-l6)作为研究对象。irap是一种跨膜氨基肽酶蛋白，目前研究已证明irap与glut4存在高度共定位关系。因此可以利用观测irap–morange来监控l6细胞内glut4的转运情况。首先将irap-morange-l6用无血清培养液饥饿2小时，之后在激光共聚焦显微镜下观察irap-morange的荧光并检测细胞膜上的荧光强度，从而检测细胞glut4的转运情况。

图2为蒲公英氯仿提取物促进l6细胞glut4转运图，如图2所示，加入蒲公英氯仿提取物后。irap-morange-l6细胞膜的荧光强度明显增强。说明蒲公英氯仿提取物可以促进l6细胞glut4转运。

图4为蒲公英氯仿提取物促进l6细胞glut4的转运被ampk信号通路抑制剂compoundc抑制图，如图4所示，蒲公英氯仿提取物对如图l6细胞glut4转运的促进作用被ampk抑制剂compoundc显著抑制，而胰岛素信号通路抑制剂wortmannin和pkc信号通路抑制剂则无抑制作用。

3、westernblotting：

用无血清培养液饥饿细胞2小时，然后加入相应药物处理，之后立即将细胞置于冰上用冷的pbs洗三遍。加入蛋白酶抑制剂pmsf，将细胞刮起。将细胞分别用27规格和12规格的注射器抽提破碎12次，该操作在冰上进行。将细胞在500g离心10min，取上清加入sds-pageloadingbuffer，混匀后65℃变性10min。所得蛋白样品经过sds-page电泳、转膜、封闭后孵育相应的一抗和二抗。然后用ecl显影检测蛋白条带。

图3为蒲公英氯仿提取物促进l6细胞glut4表达图，如图3所示，加入蒲公英氯仿提取物作用半小时后。l6细胞的glut4表达水平显著高于对照组。表明蒲公英氯仿提取物促进了l6细胞glut4表达。

图5为蒲公英氯仿提取物促进l6细胞ampk的磷酸化图，如图5所示，蒲公英氯仿提取物在作用5分钟和30分钟时，都能使l6细胞ampk磷酸化。因此说明ampk信号通路是蒲公英氯仿提取物促进l6细胞glut4转运的主要信号通路。