本发明属于生物制剂技术领域，涉及白花菜巴布剂的抗炎、镇痛活性及其制备方法。
背景技术：
白花菜(cleomegynandral.)为白花菜科白花菜属一年生草本植物，在我国田野路边常有分布，茎叶可食用，生物学名称为花柳菜，也称花菜或菜花，别名五梅草、羊角菜、臭菜等，主要含挥发油、三萜和黄酮等成分，富含对人体有益的多种微量元素和氨基酸。本发明将白花菜地上部分用甲醇提取后利用乙酸乙酯精制，得到的浸膏用水溶性高分子材料作为基质制备成外用的巴布剂，并对其外观性状、初黏力、均匀性等进行了考察，测试了体内抗炎镇痛活性作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供白花菜巴布剂的抗炎、镇痛活性及其制备方法。
本发明研究发现白花菜巴布剂具有抗炎、镇痛活性。
白花菜巴布剂的制备方法：称取处方量羧甲基纤维素钠(cmc-na)，加入适量蒸馏水，水浴加热溶解，使成20％溶液，再加处方量甘油，搅匀，为a相；同法制得10％pva水溶液和10％明胶水溶液，分别为b相和c相；先将b相和c相混匀，再加入到a相，搅拌均匀后加研细的微粉硅胶和预热的白花菜浸膏，趁热涂布于无纺布上，置于电热恒温干燥箱中，70℃干燥2h，得白花菜巴布剂。
白花菜浸膏的制备方法：取白花菜地上部分20kg，阴干、粉碎，过筛后甲醇冷浸72h，过滤，残渣继续用甲醇提取3次，合并滤液与提取液，回收甲醇；将得到的浸膏用乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得白花菜浸膏。
进一步，羧甲基纤维素钠1.0g、明胶0.8g、聚乙烯醇0.5g和微粉硅胶2.0g。
进一步，载药量为处方中基质总量的40％，保湿剂甘油的用量为处方中加入水总体积的1/3。
本发明的有益效果是白花菜巴布剂具有明显的抗炎镇痛活性，可用于治疗或缓解关节肿痛。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
1材料
1.1仪器
re-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，sg-301初粘性测试仪(苏州市金戈检测设备有限公司)，202-o电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，电子天平(bs224s，京制000000249号，北京赛多利斯仪器系统有限公司)，kdm型调温电热套(山东省鄄城光明仪器有限公司)，pv-200足趾肿胀仪(成都泰盟软件公司)，rb-200智能热板仪(成都泰盟软件有限公司生产)。
1.2药品
白花菜(2015年8月上旬采自湖北省孝感，经甘肃医学院程亚青教授鉴定为白花菜cleomegynandral.)，甲醇(分析纯，天津市百世化工有限公司)，乙酸乙酯(分析纯，天津市百世化工有限公司)，15cm×10cm无纺布(扬州洋生医药科技有限公司)，聚乙烯醇(实验试剂，天津市东丽区天大化学试剂厂)，羧甲基纤维素钠(分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心)，明胶(生化试剂，天津市致远化学试剂有限公司)，微粉硅胶(青岛海洋化工分析厂)，甘油(分析纯，天津市百世化工有限公司)，硫化钠(分析纯，天津市福晨化学试剂厂)，甲醛(分析纯，成都市科龙化工试剂厂生产)，云南白药消炎镇痛膏(云南白药集团股份有限公司生产，批号zla1520)。
1.3动物
雄性wistar大鼠，体重180～220g；清洁级昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，均购于中国农业科学院兰州兽医研究所动物实验中心，生产许可证号：(甘)2015-0001。
2白花菜浸膏的制备
取白花菜地上部分20kg，阴干、粉碎，过筛后甲醇冷浸72h，过滤，残渣继续用甲醇提取3次，合并滤液与提取液，回收甲醇；将得到的浸膏用乙酸乙酯提取3次，合并提取液，旋转蒸发仪除去乙酸乙酯，得白花菜浸膏1kg。
3白花菜巴布剂处方筛选
3.1白花菜巴布剂制备
称取处方量cmc-na，加入适量蒸馏水，水浴加热溶解，使成20％溶液，再加处方量甘油，搅匀，为a相；同法制得10％聚乙烯醇(pva)水溶液和10％明胶水溶液，分别为b相和c相；先将b相和c相混匀，再加入到a相，搅拌均匀后加研细的微粉硅胶和预热的白花菜浸膏，趁热涂布于无纺布上，置于电热恒温干燥箱中，70℃干燥2h，得白花菜巴布剂。
3.2白花菜巴布剂处方筛选
采用单因素实验考察白花菜巴布剂的处方组成及用量，对比了不同比例甘油的保湿效果，测试了不同剂量白花菜浸膏对于巴布剂性能的影响，结果显示甘油用量为处方基质需水总量的1/3，白花菜浸膏为基质总重40％时，涂展性和保湿性良好并且皮肤残留少；以初黏力、均匀性、涂展性、皮肤追随性、气泡状态、透布程度等作为巴布剂质量考察指标，利用spss统计软件安排正交试验并进行分析(表1-5)，由表4、5可知，各因素用量的改变对结果都有显著影响，具有统计学意义，其中因素b即pva的用量影响最大，巴布剂最佳处方为a3b2c2d3，cmc-na：pva：明胶：微粉硅胶重量比为1.0：0.8：0.5：2.0。
表1白花菜巴布剂正交实验因素水平表
表2白花菜巴布剂质量考察指标及评分标准
表3白花菜巴布剂正交实验结果
表4白花菜巴布剂正交实验方差分析
r平方＝0.972(调整的r平方＝0.959)
表5白花菜巴布剂正交实验单因素分析
4白花菜巴布剂药理活性研究
4.1方法
4.1.1造模与分组
大鼠110只，测量给药前右后足趾容积，于皮下注射2.5％甲醛0.1ml，筛选足趾肿胀度0.3ml以上的大鼠(足趾肿胀度＝致炎后足趾容积-致炎前足趾容积)分为6组，分别为白花菜巴布剂高、中、低剂量组，阳性对照组，阴性对照组和空白对照组，每组至少10只，采用随机法进行染色编号。
利用智能热板仪在55±0.5℃条件下，选取舔足时间5-30s之间的小鼠50只，随机分为5组，分别为白花菜巴布剂高、中、低剂量组，阳性对照组和空白对照组，每组10只。
4.1.2脱毛
用剪刀将鼠背部毛剪短，用脱脂棉蘸取10％硫化钠溶液，轻轻擦拭在剪毛部位，待被毛变为稀软淡黄色后用纱布蘸取清水擦拭2-3次，直至皮肤裸露，脱毛皮肤面积约2cm2。
4.1.3给药与测量
将载有白花菜甲醇提取物40％、60％和90％的巴布剂分别剪成1cm2小片，作为高、中、低剂量药物黏贴于对应组大小鼠脱毛背部，用医用胶带固定，阳性对照组给予消炎镇痛膏1cm2，阴性对照组和空白对照组不给药。
大鼠每日背部敷贴白花菜巴布剂12小时，于同一时间段测量各组大鼠右后足趾容积，每只大鼠测量5次，取平均值，统计每只大鼠右后足趾容积减小0.3ml需要的时间；小鼠分别于给药1、2、3小时用热板法测定舔足时间作为痛阈值，大于60s的按照60s记录。
利用spss统计软件进行单因素方差分析，对比、考察药物的抗炎镇痛作用。
4.2结果与分析
阴性对照组致炎大鼠后右后足趾容积减小0.3ml的天数明显长于白花菜巴布剂给药组和阳性对照组，阳性药物组、白花菜巴布剂各剂量组与阴性对照组均有显著性差异(表6)，说明白花菜巴布剂对甲醛所致大鼠足肿胀有明显抑制作用。
表6致炎大鼠足趾容积减小0.3ml的时间
注：与阴性对照组相比，ap<0.05。
由表7可见，白花菜各剂量组痛阈随着给药时间延长逐渐升高，3小时舔足时间最长，并且白花菜各剂量组、阳性药物组较空白对照组均有显著性差异，表明白花菜巴布剂能够发挥一定的镇痛作用。
表7给药后各时间点小鼠舔足时间
注：与阴性对照组相比，ap<0.05,bp<0.01。
5讨论与结论
预实验表明，白花菜甲醇提取物经乙酸乙酯萃取后得到的浸膏具有一定的抗炎镇痛作用，考虑用于缓解关节炎引起的肿痛，因关节处血流少，口服给药需时较长、需药量大，而局部敷贴给药可以使药物快速达到病灶，给药方便，因此决定将白花菜浸膏制备成外用的巴布剂。基质配方是巴布剂研究的基础和核心，是制成优良巴布剂的关键[24]，实验首先通过对比确定了基质组成，后又利用正交实验确定其最佳配比，最终得到膏面平整、色泽均匀，气泡少，粘性适宜的白花菜巴布剂。
甲醛溶液注射属于化学性刺激，可使局部组织血管通透性增强，炎症液体和蛋白质外渗造成水肿，同时致使白细胞产生白细胞介素ⅰ、肿瘤坏死因子及前列腺素e等引起发热。实验通过大鼠右后足趾皮下注射2.5％甲醛建立关节炎肿胀模型，背部敷贴白花菜巴布剂后考察右后足趾的消肿时间，与阴性组和空白组对比，揭示白花菜巴布剂的抗炎作用；并采用热板法对比白花菜给药组和未给药组小鼠的痛阈值，评价其镇痛效果。结果表明，白花菜巴布剂具有明显的抗炎镇痛活性，可用于治疗或缓解关节肿痛。
本发明将白花菜地上部分的甲醇提取物制备成巴布剂，优选最佳处方组成及配比，并对其体内抗炎镇痛活性进行考察。以初粘力、均匀性、涂展性、皮肤追随性、气泡状态、透布程度综合得分为考察指标，采用单因素和正交实验筛选处方组成及最佳配比，并测试白花菜巴布剂对甲醛所致大鼠足肿胀的抗炎作用和对小鼠舔足时间的影响。药理活性实验证明，白花菜巴布剂给药组与未给药组相比能够明显缩短大鼠肿胀足趾体积减小的时间，提高小鼠痛阈，差异具有显著性意义。结论：最佳处方制备的白花菜巴布剂外观平整，各项质量评价指标均合格，具有显著的抗炎镇痛活性，可用于缓解关节肿痛。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。