一种槐耳醇提物的用途及制备方法与流程

本发明涉及一种中药活性成分，特别涉及一种槐耳醇提物的用途及制备方法。

背景技术：

槐耳是我国民间重要的药用真菌，槐耳为多孔菌科真菌槐栓菌trametesrobiniophilamurr.的干燥子实体，别名槐檽、槐菌、槐鸡、槐蛾、赤鸡等，主要分布于陕西、山东、河北等地。《新修本草》记载：槐耳，此槐树上菌也，当取坚如桑耳者良。桑、槐、楮、榆、柳，此为五耳，软者并堪啖，楮耳人常食，槐耳治痔。依此可见，坚硬的入药用的槐耳应该并非作为食用的木耳。槐栓菌的菌盖为半圆形，似耳样，生长在古中国槐上，所以古称“槐耳”，由于整个子实体形似蛾，所以又叫“槐菌”、“槐蛾”。综上所知，历代本草所记录描述的“槐耳”，应是生长在古老中国槐上的槐栓菌。

槐耳性平，味苦、辛，具有止血、止痢、抗癌等作用。槐耳的功效在历代医书中早有记载，《药性论》记载：“能治风，破血，益力。”《本草图经》云：“治大便血及五痔、脱肛等。”作为在中国已应用了1600余年的传统中药槐耳，无论是单味药物及其提取物还是已用于癌症辅助治疗的槐耳颗粒，商品名“金克”在近年来都受到了学界的广泛关注，尤其是抗肿瘤方面^[2]。

迄今为止，对槐耳化学成分进行分离与细致的研究鲜有报道，大部分研究将目光聚焦在其粗提物槐耳清膏上，其良好的抗癌疗效与极低的副作用已得到临床广泛的肯定。槐耳颗粒的制备是槐耳用热水、乙醇提取清膏，浓缩到相对密度1.33以上，加人适量糊精、糖粉等辅料，混合均匀后制成颗粒，烘干后的棕黄色颗粒，每袋20g即槐耳颗粒剂，主要活性成分为多糖蛋白。经小鼠肉瘤s180抑瘤试验，抑瘤率达40％～47％，说明多糖蛋白具有抗癌活性，是槐耳菌质和槐耳清膏的有效作用部位。它是一种棕褐色粉末，没有明显的熔点，易溶于水，微溶于低浓度的乙醇，不溶于高浓度乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。其水溶液透明呈黏稠状，ph值为5.5，无旋光性。经高效液相色谱和电泳分析表明其主成分基本为均一多糖，并由光谱和气相层析方法证明槐耳多糖为一蛋白结合杂多糖，其中多糖质量分数为41.53％，氨基酸质量分数为12.93％，水分8.72％，其水解产物含l-阿拉伯糖(arabinose)，d-木糖(xylose)，d-甘露糖(mannose)，d-半乳糖(galactose)，d-葡萄糖(glucose)等6种单糖，以及脯氨酸(proline)，甘氨酸(glycine)，丙氨酸(alanine)，胱氨酸(cystine)，异亮氨酸(isoleucine)，天冬氨酸(asparticacid)，苏氨酸(threonine)，丝氨酸(serine)，谷氨酸(glutamicacid)等18种氨基酸。

槐耳现有的提取方法有普通水提法、高温高压水提法、冷碱法、热碱法，碱提法水溶性提取物的得率高于水提法，其中热碱法提取物的得率最高为29.65％，但其粗多糖含量最低，冷碱法粗多糖的实际得率最高为6.93％。

目前，对于槐耳的研究，近年来主要集中在槐耳颗粒或浸膏对肿瘤细胞抗性方面，槐耳提取方法及化学成分进行分离与细致的研究鲜有报道，大部分研究将目光聚焦在其粗提物槐耳清膏上，槐耳清膏为槐耳菌质发酵后的热水提取物，其含有多糖、蛋白质、生物碱等多种有机成分及10余种矿物质元素，主要活性成分为多糖蛋白。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种槐耳醇提物的用途，槐耳醇提物具有显著的抑制胃癌bgc823细胞、结肠癌细胞hct116增殖的效果，说明槐耳醇提物同样具备抗肿瘤作用，对槐耳的药用成分进行了进一步的开发利用，为抗胃癌、结肠癌药物的开发提供了新的途径。

本发明还提供了槐耳醇提物的制备方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种槐耳醇提物的用途，槐耳醇提物作为制备抗肿瘤药物的应用。

现有技术均采用槐耳水提物或多糖进行研究，并用于抗肿瘤，并未揭示槐耳醇提物是否具有药用价值，本发明首次发现槐耳醇提物具有较好的抗肿瘤作用，且优于现有认为的槐耳水提物或多糖的抗肿瘤作用。对槐耳的药用成分进行了进一步的开发利用，为抗胃癌、结肠癌药物的开发提供了新的途径。

作为优选，所述抗肿瘤药物为抗胃癌药物或抗结肠癌药物。

作为优选，所述槐耳醇提物通过以下方法制备而得：将槐耳子实体粉碎，过筛得槐耳粉碎物，按照1g槐耳粉碎物：30ml乙醇的料液比将槐耳粉碎物与乙醇混合后，加热回流提取2-3次，每次2小时，过滤，合并提取液，合并的提取液旋蒸回收乙醇，浓缩至稠膏状，冷冻干燥。

作为优选，所述乙醇的质量浓度为70％。

一种具有抗癌作用的槐耳醇提物的制备方法，将槐耳子实体粉碎，过筛得槐耳粉碎物，按照1g槐耳粉碎物：20-40ml乙醇的料液比将槐耳粉碎物与乙醇混合后，加热回流提取2-3次，每次2小时，过滤，合并提取液，合并的提取液旋蒸回收乙醇，浓缩至稠膏状，冷冻干燥。

作为优选，所述乙醇的质量浓度为60-90％。

作为优选，将槐耳子实体粉碎，过筛得槐耳粉碎物，按照1g槐耳粉碎物：30ml质量浓度为70％的乙醇的料液比将槐耳粉碎物与乙醇混合后，加热至80℃回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液，合并的提取液旋蒸回收乙醇，浓缩至稠膏状，冷冻干燥。

一种具有抗癌作用的槐耳提取物的制备方法，步骤如下：

(1)醇提：将槐耳子实体粉碎，过筛得槐耳粉碎物，按照1g槐耳粉碎物：30ml质量浓度为70％的乙醇的料液比将槐耳粉碎物与乙醇混合后，加热至80℃回流提取3次，每次2小时，过滤，合并提取液得醇提液；

(2)水提：将步骤(1)醇提后剩余的药渣干燥后，按照1g药渣：30ml蒸馏水的料液比加蒸馏水，加热回流提取3次，每次2.5h，过滤，合并提取液得水提液；

(3)将醇提液和水提液混合，真空减压浓缩至稠膏状，冷冻干燥。

作为优选，抗癌作用为抗胃癌或抗结肠癌作用。

本发明的有益效果是：槐耳醇提物具有显著的抑制胃癌bgc823细胞、结肠癌细胞hct116增殖的效果，说明槐耳醇提物同样具备抗肿瘤作用，对槐耳的药用成分进行了进一步的开发利用，为抗胃癌、结肠癌药物的开发提供了新的途径。

附图说明

图1是乙醇浓度对总黄酮提取率的影响。

图2是乙醇倍量对总黄酮提取率的影响。

图3是提取时间对总黄酮提取率的影响。

图4是提取次数对总黄酮提取率的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例：

以总黄酮提取率为考察指标，通过单因素考察及正交实验，确定槐耳醇提物的最佳提取工艺。

1.单因素考察

选择乙醇浓度，乙醇倍量，提取时间，提取次数进行考察，每个因素的各个水平平行3次试验。以下为各个因素实验结果。

1.1.乙醇浓度考察

将槐耳子实体粉碎，过20目筛，称取槐耳子实体粉8份，约1g/份，精密称定，考察不同乙醇浓度对总黄酮提取率的影响，分别选择60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的乙醇，料液比1g:30ml，80℃水浴回流提取1次，1h/次，放冷，补重，过滤。精密移取续滤液适量，紫外分光光度法测定总黄酮的含量，平行三次试验。计算总黄酮提取率，总黄酮提取率(mg/g)＝总黄酮/生药，结果见图1。

1.2.乙醇倍量考察

将槐耳子实体粉碎，过20目筛，称取槐耳子实体粉5份，约1g/份，精密称定，考察乙醇倍量对总黄酮提取率的影响，分别加入10、20、30、40、50倍量(g:ml)的70％乙醇，80℃水浴回流提取1次，1h/次，放冷，补重，过滤。精密移取续滤液适量，紫外分光光度法测定总黄酮的含量，平行三次试验。计算总黄酮提取率，总黄酮提取率(mg/g)＝总黄酮/生药。结果见图2。

1.3.提取时间的考察

将槐耳子实体粉碎，过20目筛，称取槐耳子实体粉5份，约1g/份，精密称定，考察提取时间对总黄酮提取率的影响，选择5个水平0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，80℃水浴回流，液固比30:1，乙醇浓度70％。精密移取续滤液适量，紫外分光光度法测定总黄酮的含量，平行三次试验。计算总黄酮提取率，总黄酮提取率(mg/g)＝总黄酮/生药。结果见图3。

1.4.提取次数考察

将槐耳子实体粉碎，过20目筛，称取槐耳子实体粉3份，约1g/份，精密称定，加入30倍量的70％乙醇，80℃水浴回流2h，考察提取次数分别为1次、2次、3次，2h/次，计算总黄酮提取率，总黄酮提取率(mg/g)＝总黄酮/生药。结果见图4。

2.正交实验设计

采用四因素三水平正交试验，平行试验3次，以槐耳总黄酮含量为指标，在单因素考察的基础上，以水浴加热回流方法进行最佳工艺的考察，确定乙醇浓度(a)、溶剂倍量(b)、提取时间(c)、提取次数(d)为考察因素，选用l9(3⁴)正交表进行试验，因素水平表见表1。

表1因素与水平表

2.1.正交试验结果分析

选择l9(3⁴)正交表可得9组工艺条件。直观分析见表2，方差分析见表3。

表2正交设计结果表

表3方差分析结果表

注：*p<0.1，**p<0.05，***p<0.01。

槐耳中总黄酮以芦丁计含量为考察指标，由直观分析可知，各因素对醇提物总黄酮提取的影响大小依次为提取次数(d)>提取时间(c)>乙醇浓度(a)>溶剂倍量(b)。由方差分析可知，经f检验结果表明，提取次数、提取时间和乙醇浓度为主要因素，溶剂倍量没有影响，故槐耳总黄酮的提取优化工艺为a1b3c2d3。

正交试验显著性分析可知，溶剂倍量对总黄酮的含量无显著影响，考虑能源及时间节约，综合考虑，因此确定槐耳醇提最佳提取工艺条件为a1b1c2d3，即30倍量，70％乙醇溶液，加热回流提取3次，每次2h。

2.2.最佳提取工艺试验验证

根据试验结果，确定槐耳醇提最佳提取工艺为a1b1c2d3。取三批槐耳药材，依上述最佳提取工艺进行验证试验。结果见表4。

表4验证试验结果表

平行3次测定，槐耳中总黄酮平均含量为25.76mg/g，rsd为1.70％，表明提取工艺重现性良好，稳定可行。

试验部分：

以结肠癌细胞hct116和胃癌bgc823细胞为试验细胞株，槐耳不同组分提取物为细胞给药样本，采用mtt比色法，研究槐耳不同组分提取物对hct116细胞和bgc823细胞增殖作用，筛选出槐耳有效部位，为槐耳有效部位的提取工艺研究提供科学依据。

一、实验材料

(一)实验药品与试剂

槐耳药材，产于山东，批号20131001

mtt(美国sigma公司，型号m2123)

胰蛋白酶(美国amresco公司，1:250)

胎牛血清(fetalbovineserun，fbs)(四季青，批号20151112)

双抗(penicillin-streptomycinsolution)(hyclone公司，批号j130043)

dmso(dimethylsulfoxide)(ɑmresco公司，批号3544b028)

磷酸盐缓冲盐(pbs)(赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，批号nza1064)

96孔板(赛默飞世尔thermofisher)。

(二)实验器材

高速多功能粉碎机(上海力箭机械有限公司，型号yb-1000a)

超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司，型号kq5200de)。

二、方法与结果

1细胞培养

结肠癌hct116细胞和胃癌bgc823细胞株，均来源于中国科学院生命科学研究院细胞库。将hct116细胞(bgc823细胞)接入25cm²细胞培养板，加入含10％胎牛血清的完全培养液6ml，置37℃，5％co2培养箱中，半旋开培养瓶的瓶盖并保持培养箱内的湿度，1-2d更换一次培养液。每天观察细胞生长状况，待细胞融合80％后进行细胞传代或冻存。

2细胞传代

细胞生长至80％融合需进行传代。在细胞处于对数生长期时，弃培养瓶中培养液，用pbs缓冲液洗2～3次，每次2～3ml，注意不要直接冲洗细胞，加入0.25％胰蛋白酶液2ml，作用2-5min左右(视具体细胞而定)，加入等体积的培养液进行中和。将细胞悬液移入15ml离心管，设置转速为800r·min-1，离心5min，弃去上清液，用培养液轻轻洗1～2次。细胞沉淀用少许新完全培养液慢慢吹散，用细胞计数板计数后分瓶传代培养或传板分组实验。

3细胞样本制备

称取槐耳子实体粉末约10g，按最佳提取工艺提取，即醇提加入30倍量70％乙醇溶液，加热回流提取3次，每次2h，旋蒸回收乙醇，浓缩至稠膏状，冷冻干燥后得到样品a(槐耳醇提浸膏粉)；

醇提后药药渣干燥后加入30倍量蒸馏水回流3次，每次2.5h，旋蒸回收乙醇，浓缩至稠膏状，冷冻干燥后得到样品b(槐耳水提浸膏粉)；

另用相同方法制备一份醇提液和水提液，将醇提液和水提液合并，真空减压浓缩至稠膏状，冷冻干燥得到样品a+b(槐耳醇水双提浸膏粉)，并以市售槐耳颗粒c作为对照，将制备的细胞样本用于hct-116细胞(bgc-823细胞)生长抑制试验。

4细胞给药浓度梯度

精密称定槐耳不同进出部位样本浸膏粉0.064g(槐耳颗粒按比例转化)，溶于10ml不含血清培养基中，配置成浸膏6400μg/ml母液，梯度稀释至各实验浓度。细胞给药浓度梯度见表5。

表5槐耳不同浸出部位细胞给药浓度梯度

采用以上药物样本，比较各个提取部位对hct116细胞(bgc823细胞)增殖抑制实验(mtt实验)，通过比较各组的抑制率的ic50值，筛选出药效最佳(ic50值最小)的浸出部位，以此有效部位进行下一步槐耳最佳提取工艺研究。

5筛选方法

用mtt法测定肿瘤细胞抑制增殖实验，对各浸出物的肿瘤抑制率ic50值进行比较，进而筛选出药效最佳的浸出部位。

6细胞生长抑制试验

将处于对数生长期的hct116细胞(bgc823细胞)用0.25％胰蛋白酶消化，离心，采用细胞计数板计数后，调整细胞悬液浓度，配制为每孔5×l04个/ml的细胞悬液接种于96孔板，为防止边缘效应，96孔板外缘一圈加入200μl的pbs磷酸缓冲液，其余每孔加入100μl细胞悬液，放置于co2浓度为5％，温度为37℃的co2培养箱中培养24-48h(视细胞生长状况而定)，吸弃培养液，加入不含血清的不同质量浓度样本，分别为浸膏640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml每孔100μl，平行设6个复孔，同时设置空白对照组不添加细胞悬液，只加入100μl新鲜培养基，平行测定3次。在同样条件的培养箱内继续培养24h，于倒置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即5％浓度)，继续孵育4h。终止培养，小心吸去培养孔内培养液。每孔加入150μldmso，置于低速摇床上振荡10min，以溶解残留的mtt-甲臜结晶，于多功能酶标仪上490nm处测定各孔的光密度(od)值，以正常对照组测得的od值为对照，按照抑制率公式计算槐耳各提取物组对于hct116细胞(bgc823细胞)增殖的抑制效果。槐耳不同组分的作用时间分别设定为24h和48h，计算出ic50值。

抑制率＝[1-(实验组mtt检测od值-空白组od)/(对照组mtt检测od值-空白组od)]×100％。

改良寇式法：lgic50＝xm-i(p-(3-pm-pn)/4)

xm:lg最大剂量

i:lg(最大剂量/相临剂量)

p:阳性反应率之和

pm:最大阳性反应率

pn:最小阳性反应率。

结肠癌hct116细胞结果见表6；胃癌bgc823细胞结果见表7。

表6槐耳不同提取物对hct116细胞增殖抑制ic50值

表7槐耳不同提取物对bgc823细胞增殖抑制ic50值

三、讨论与分析

本部分实验研究结果显示，槐耳各浸出部位在640～20μg·ml-1浓度下对结肠癌hct116细胞及胃癌bgc823细胞有明显的增殖抑制作用，且随着药物浓度的增加，呈剂量依赖关系。

槐耳不同提取物对hct116细胞和bgc823细胞均具有不同增殖抑制作用，hct116细胞和bgc823细胞两种细胞均显示作用时间48h较24h效果好，且呈剂量依赖关系，槐耳醇水双提提取物ic50值最低，其次是醇提物，不同浸出部位之间有显著差异(槐耳水提物与槐耳颗粒之间没有显著性差异)。因此，选择ic50值最小(抗肿瘤效果最佳)的醇水双提提物作为后期试验有效部位。

本项结果表明，槐耳醇提物具有显著的抑制胃癌bgc823细胞、结肠癌细胞hct116增殖的效果，说明槐耳醇提物同样具备抗肿瘤作用。而此前国内外研究仅限于对槐耳水提物及其多糖成分，并未对槐耳的其他药用部位进行成分分析，致使相关药用部位被摒弃。本研究提示槐耳醇提物具备抑制肿瘤的作用，这无疑提示着槐耳醇提物的化学成分分离与系统研究是极具价值的，具备开发前景。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。