本发明属于药品或保健品领域，具体涉及桂花提取物在制备ido抑制剂中的用途。
背景技术：
ido(indoleamine-2，3-dioxygenase)中文名为吲哚胺2，3-双加氧化酶，是肝脏以外唯一催化色氨酸沿犬尿氨酸途径(kynureninepathway，kp)代谢的限速酶，可以将色氨酸分解为l-犬尿氨酸、吡啶甲酸和喹啉酸等多种代谢物。l-色氨酸作为人体内维持细胞活化和增殖所必需的氨基酸，也是构成蛋白质不可缺少的成分，它的缺乏会导致一些重要细胞的功能异常。自1967年被发现以来，ido通过降解色氨酸抑制病原微生物增殖的机制、ido与神经系统疾病之间的关系逐渐被阐明；并有研究证实，ido还参与调节t细胞的反应，能够对t细胞的增殖和活化产生抑制作用，而这种抑制作用则介导了表达ido肿瘤细胞的免疫逃逸现象。因此，ido的表达或活性的异常增高，与多种疾病的发病机制密切相关，是导致多种疾病的重要因素，例如已被证实的肿瘤、阿尔茨海默病、抑郁症和老年性白内障、aids等病毒感染、莱姆病和链球菌感染等细菌感染等(可参考如下文献：ido抑制剂的研究进展，孔令雷等，《中国药物化学杂志》，2009，19(2)：147-154；中国专利文献cn101429151a一种含(e)-4-(β-溴乙烯基)苯氧酰基结构的ido抑制剂及其制备方法，公开日期2009年5月13日)。因此，ido抑制剂成为极具潜力的治疗药物，引起了众多学者的关注。作为一种全新靶点，ido成为极具潜力的癌症免疫治疗靶标。筛选高效、低毒的ido抑制剂/抗体，并将其用于治疗上述疾病，成为了研究人员的共同诉求。1978年，有研究人员研究分离出了非选择性的竞争性ido抑制剂，但其抑制效力微弱。20世纪90年代初，首次合成了色氨酸衍生物1-mt(即：indoximod)，其作为与底物色氨酸结构最接近的抑制剂，引起了人们对于ido抑制剂更为广泛的关注和兴趣。ido抑制剂的研发尚处于药物开发的初期，目前仅有2个化合物(epacadostat和indoximod)进入ⅱ期临床，1个化合物(gdc-0919)进入ⅰ期临床。最初寻找ido抑制剂的工作主要以化学合成为手段，以ido的底物色氨酸为模板，在研究构效关系的基础上对其进行结构修饰，发表的文章和注册的专利几乎覆盖了所有能修饰的基团，但是收效甚微。从2006年起，国内外学者们尝试从天然产物中寻找具有新结构骨架的高活性的ido抑制剂，如：brastianos等从海绵neopetrosiaexigua中提取了得到exiguaminea(ki值＝0.21μm)；albanpereir等从海水螅中提取得到annulinc(ki值＝0.14μm)；caspari等发现商业可售的天然产物brassinin(ki值＝97.7μm)具有中等活性；中国专利文献cn101843618a公开了：小檗碱及其衍生物亦具有ido抑制作用。桂花(osmanthusfragrans(thunb.)lour)，属木犀科(oleaceae)木犀属(osmanthus)，又名木樨、岩桂、九里香，主要包括金桂、银桂、丹桂和四季桂四大品种，是中国传统十大名花之一。桂花在中国已有2500多年的栽培历史，不仅可以作为景观植物进行观赏，而且具有较高的食用和药用价值，被广泛应用于食品、化妆品及药品中。随着对桂花研究的不断深入，药理实验表明，桂花提取物具有抗氧化和抗炎的作用。目前，关于桂花提取物用于制备ido抑制剂尚无报道。技术实现要素：为此，本发明要解决的技术问题是现有技术中无桂花提取物用于制备ido抑制剂的问题，从而提供桂花提取物在制备ido抑制剂中的用途。为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：本发明提供桂花提取物在制备ido抑制剂中的用途；所述ido抑制剂用于治疗阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、强直性脊柱炎、细菌感染、白内障、心境障碍、抑郁症或焦虑症。本发明还提供桂花提取物在制备治疗ido介导的色氨酸代谢途径的病理学特征的疾病的药品中的用途，所述疾病为阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、强直性脊柱炎、细菌感染、白内障、心境障碍、抑郁症或焦虑症。优选地，上述用途中，所述桂花提取物为桂花提取物a；桂花提取物a通过以下方法制备而成：取桂花，加入10～20倍重量的体积浓度为70％～90％的乙醇水溶液室温下提取1～3次，每次提取1～14天，合并提取液，减压浓缩，得桂花浸膏，继续减压浓缩、干燥，得桂花提取物a。进一步优选地，上述用途中，桂花提取物a通过以下方法制备而成：取桂花，加入15倍重量的体积浓度为85％的乙醇水溶液室温下提取2次，每次提取7天，合并提取液，减压浓缩，得桂花浸膏，继续减压浓缩、干燥，得桂花提取物a。优选地，上述用途中，所述桂花提取物为桂花提取物b或桂花提取物c；桂花提取物b和桂花提取物c通过以下方法制备而成：取所述桂花浸膏加入10％～30％的乙醇水溶液使溶解，离心后的上清液经大孔树脂柱层析纯化，以水为流动相a、以乙醇为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱：先用a：b体积比为90％：10％的流动相洗脱4～6bv，再用a：b体积比为70％：30％的流动相洗脱4～6bv，再用a：b体积比为30％：70％的流动相洗脱4～6bv，再用a：b体积比为5％：95％的流动相洗脱使大孔树脂再生，分别收集流动相为a：b体积比为70％：30％和a：b体积比为30％：70％的洗脱液，然后分别进行减压浓缩、干燥，分别得桂花提取物b和桂花提取物c。进一步优选地，上述用途中，桂花提取物b或桂花提取物c通过以下方法制备而成：取所述桂花浸膏加入15％的乙醇水溶液使溶解，离心后的上清液经大孔树脂柱层析纯化，以水为流动相a、以乙醇为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱：先用a：b体积比为90％：10％的流动相洗脱5bv，再用a：b体积比为70％：30％的流动相洗脱5bv，再用a：b体积比为30％：70％的流动相洗脱5bv，再用a：b体积比为5％：95％的流动相洗脱使大孔树脂再生，分别收集流动相为a：b体积比为70％：30％和a：b体积比为30％：70％的洗脱液，然后分别进行减压浓缩、干燥，分别得桂花提取物b和桂花提取物c。优选地，上述用途中，所述大孔树脂选自ab-8、d101、xad1600、hpd-200或diaionhp-20。优选地，上述用途中，所述大孔树脂柱的直径为8cm，柱体积为3.5l。优选地，上述用途中，所述梯度洗脱的流速为3bv/h。优选地，上述用途中，所述桂花为金桂花。优选地，上述用途中，所述桂花为金桂花的干花和/或叶。优选地，上述用途中，所述桂花提取物按照常规工艺，加入常规辅料制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、散剂、合剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、贴膏剂、栓剂、气雾剂、软膏剂或注射剂。所述常规辅料为：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素纳等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：peg6000、peg4000、虫蜡等。本发明的技术方案具有如下优点：本发明的桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c均具有一定的ido抑制活性，可以用于治疗阿尔茨海默病、自身免疫性疾病、强直性脊柱炎、细菌感染、白内障、心境障碍、抑郁症或焦虑症；其中，桂花提取物b对ido的抑制活性更为显著，对细胞内的ido的抑制活性接近阳性对照药1-甲基色氨酸(1-mt)对细胞内的ido的抑制活性。具体实施方式实施例1桂花提取物的制备取金桂花的干花和叶，粉碎，加入15倍重量的体积浓度为85％的乙醇水溶液室温下提取2次，每次提取7天，合并提取液，减压浓缩，得桂花浸膏，继续减压浓缩、干燥，得桂花提取物a。取桂花浸膏加入15％的乙醇水溶液使溶解，离心后的上清液经d101大孔树脂柱层析纯化(大孔树脂柱的直径为8cm，柱体积为3.5l)，以水为流动相a、以乙醇为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3bv/h)：先用a：b体积比为90％：10％的流动相洗脱5bv，再用a：b体积比为70％：30％的流动相洗脱5bv，再用a：b体积比为30％：70％的流动相洗脱5bv，再用a：b体积比为5％：95％的流动相洗脱使大孔树脂再生，分别收集流动相为a：b体积比为70％：30％和a：b体积比为30％：70％的洗脱液，然后分别进行减压浓缩、干燥，分别得桂花提取物b和桂花提取物c。实施例2桂花提取物的制备取金桂花的叶，粉碎，加入10倍重量的体积浓度为90％的乙醇水溶液室温下提取1次，每次提取14天，合并提取液，减压浓缩，得桂花浸膏，继续减压浓缩、干燥，得桂花提取物a。取桂花浸膏加入10％的乙醇水溶液使溶解，离心后的上清液经ab-8大孔树脂柱层析纯化(大孔树脂柱的直径为8cm，柱体积为3.5l)，以水为流动相a、以乙醇为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3bv/h)：先用a：b体积比为90％：10％的流动相洗脱4bv，再用a：b体积比为70％：30％的流动相洗脱6bv，再用a：b体积比为30％：70％的流动相洗脱4bv，再用a：b体积比为5％：95％的流动相洗脱使大孔树脂再生，分别收集流动相为a：b体积比为70％：30％和a：b体积比为30％：70％的洗脱液，然后分别进行减压浓缩、干燥，分别得桂花提取物b和桂花提取物c。实施例3桂花提取物的制备取金桂花的干花，粉碎，加入20倍重量的体积浓度为70％的乙醇水溶液室温下提取3次，每次提取1天，合并提取液，减压浓缩，得桂花浸膏，继续减压浓缩、干燥，得桂花提取物a。取桂花浸膏加入30％的乙醇水溶液使溶解，离心后的上清液经ab-8大孔树脂柱层析纯化(大孔树脂柱的直径为8cm，柱体积为3.5l)，以水为流动相a、以乙醇为流动相b，按照如下程序进行梯度洗脱(梯度洗脱的流速为3bv/h)：先用a：b体积比为90％：10％的流动相洗脱6bv，再用a：b体积比为70％：30％的流动相洗脱4bv，再用a：b体积比为30％：70％的流动相洗脱6bv，再用a：b体积比为5％：95％的流动相洗脱使大孔树脂再生，分别收集流动相为a：b体积比为70％：30％和a：b体积比为30％：70％的洗脱液，然后分别进行减压浓缩、干燥，分别得桂花提取物b和桂花提取物c。实验例1本发明桂花提取物对ido的抑制活性的研究1、实验目的利用质粒pcdna3.1-ido转染hek293细胞，使其高表达ido，然后测定本发明桂花提取物在细胞水平对ido的抑制活性。2、实验方法将hek293细胞以2.5x104细胞/孔的密度接种于96孔板中，dmem培养基培养(含10％胎牛血清、50u/ml青霉素和50mg/ml链霉素)，置于37℃、湿度95％、5％co2的培养箱中培养。培养24h后，使用脂质体lipofectamin2000介导pcdna3.1-hido质粒转染，分为阳性对照组和实验组1-3组。阳性对照组以1-甲基色氨酸(1-mt)为供试品，实验组1-3组分别以实施例1制备的桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c为供试品。转染24h后，各组分别加入对应的供试品进行孵育。孵育5h后，取140μl上清到另一96孔板中，加入10μl30％(w/v)三氯乙酸，在65℃加热15min，然后12000rpm离心10min，取等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合显色，最后采用酶标仪在492nm检测吸光值，活性测定结果用ic50值表示。3、实验结果各组对ido的抑制活性的具体实验结果如表1所示。表1各组对细胞水平ido的抑制活性的具体实验结果组别ic50(μm)阳性对照组17.8实验组1组40.6实验组2组16.3实验组3组22.5由表1可知：(1)实验组1-3组对细胞内的ido均具有一定的抑制活性；这表明，桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c均具有一定的ido抑制活性；(2)实验组2组对细胞内的ido的抑制活性接近阳性对照组对细胞内的ido的抑制活性；这表明，桂花提取物b对ido的抑制活性更为显著。4、实验结论实施例1制备的桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c对ido具有抑制活性；其中，桂花提取物b对细胞内的ido的抑制活性接近阳性对照药1-甲基色氨酸(1-mt)对细胞内的ido的抑制活性。实验例2本发明桂花提取物对强直性脊柱炎的治疗效果1、实验目的采用蛋白聚糖免疫方法建立小鼠强直性脊柱炎模型，然后灌胃本发明桂花提取物，elisa法检测炎性标志物血清tnf-α和nf-кb受体活化因子配体(rankl)水平，并检测血清ido活性(kyn/trp)，验证本发明桂花提取物对于强直性脊柱炎的疗效。2、实验方法2.1实验动物健康雄性balb/c小鼠40只，体重(18±2)g，鼠龄4～5周，均购自上海斯莱克。2.2供试药物以实施例1制备的桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c为供试药物。2.3实验分组及造模将小鼠适应性喂养1周后，取其中8只作为空白对照组。取剩余的32只采用蛋白聚糖免疫方法建立强直性脊柱炎模型，鼠腹腔注射蛋白聚糖乳剂0.15ml(75μg+弗氏佐剂)，首次免疫后7天可加强免疫，腹腔注射0.15ml乳剂，造模共21天；造模成功后，分为4组：实验组1-3组和模型对照组。实验组1-3组分别给予实施例1制备的桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c灌胃给药，每日1次，每次0.2g/10g。模型对照组和空白对照组均给予等量生理盐水灌胃。各组均给药60天，于第61天眼眶取血。2.4炎症因子测定采用elisa检测动物外周血中血清tnf-α和rankl水平，按照试剂盒说明书操作。2.5ido活性检测利用高效液相色谱技术同时检测小鼠血清中trp浓度与kyn浓度。因为ido能催化底物trp代谢生成产物kyn，故kyn/trp比值可以反映ido活性。血清在4℃下放置过夜，3000rpm离心15min。取上清血清，加入等体积的5％高氯酸溶液，于漩祸混匀器上混匀0.5-1min。室温静置10-15min，以充分沉淀血清中的蛋白，然后以12000rpm离心10min，取上清液加入1/2体积甲醇(色谱纯)，在漩祸仪上振荡5min，然后12000rpm离心10min，最后上清经过0.45μm过滤器过滤后进行上样，检测血清中犬尿氨酸/色氨酸(kyn/trp)比值，从而反映ido活性的变化。色谱条件：c18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：15mmol/l乙酸钠-乙酸溶液(含体积分数为7％的乙腈，ph3.5)；流速：1ml/min；检测波长：225nm；进样量：20μl；柱温25℃。2.6统计学处理采用spss22.0统计学软件进行分析，计量数据用均数±标准差表示，行t检验；计数资料用百分比表示，行χ2检验；p＜0.05表示差异有统计学意义。3、实验结果各组小鼠的具体实验结果如表2所示。表2各组小鼠血清tnf-α和rankl水平以及对ido活性的抑制作用#与空白对照组比较p＜0.05，*与模型对照组比较p＜0.05由表2可知，(1)模型对照组小鼠的血清tnf-α和rankl水平明显升高，这表明强直性脊柱炎模型造模成功；(2)实验组1-3组小鼠的血清tnf-α和rankl水平显著降低(p＜0.05)，且显著降低ido活性(p＜0.05)；这表明，实施例1制备的桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c通过抑制ido活性起到对强直性脊柱炎的治疗效果。4、实验结论本发明桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c可以显著降低强直性脊柱炎模型的血清tnf-α和rankl水平，且对ido活性具有显著的抑制作用；本发明桂花提取物a、桂花提取物b、桂花提取物c对强直性脊柱炎具有显著的治疗作用。实验例3本发明桂花提取物对于链球菌感染的治疗作用1、实验目的通过对链球菌感染小鼠灌胃本发明桂花提取物，检测其对于链球菌感染小鼠的死亡抑制率，验证其对链球菌感染的治疗作用。2、实验方法2.1实验动物健康雄性昆明小鼠40只，体重(18±2)g，鼠龄4～5周，均购自上海斯莱克。2.2供试药物以实施例1制备的桂花提取物b、桂花提取物c为供试药物。2.3实验分组及造模溶血性链球菌cmcc(b)32171标准菌株接种兔血琼脂平板，划线后培养得到有明显溶血环的单菌落。取单菌落接种于thy培养基(含5％小牛血清)扩增过夜，od600nm＝0.6(约109cfu/ml)时，4℃保存备用。thy培养基(每升含胰蛋白胨20克，酵母浸出物3克，牛肉膏5克，氯化钠2克，葡萄糖4克，碳酸钠2.5克，磷酸氢二钠0.4克，调ph至7.4。固体培养基：再加入1.5％琼脂粉，高压蒸气灭菌30min，置于4℃保存)。取10只小鼠，作为空白对照组。将其余30只小鼠均分为3组：实验组1-2组和模型对照组，每组10只小鼠。实验组1-2组分别给予桂花提取物b、桂花提取物c灌胃给药，每次80mg/kg。模型对照组和空白对照组均给予等量生理盐水灌胃。实验组1-2组和模型对照组灌胃1h后，均尾静脉注射od600nm＝0.6化脓性链球菌322171pbs溶液，注射剂量：0.4ml菌液/10g小鼠，每隔24h给药1次，每隔6h观察1次，分别记录时间6h、12h、24h、48h的小鼠的死亡情况。3、实验结果各组不同时间对链球菌感染小鼠死亡的影响如表3所示。表3各组对链球菌感染小鼠死亡的影响(n＝10)由表3可知，(1)给药48小时后，实验组1-2组的小鼠存活率分别为60％和60％，而模型对照组小鼠的存活率仅为20％；这表明，实施例1制备的桂花提取物b、桂花提取物c能够显著提高链球菌感染小鼠的存活率，对链球菌感染有显著的治疗作用。4、实验结论本发明桂花提取物b、桂花提取物c对链球菌感染有显著的治疗作用。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12