本发明属于灵芝孢子破壁
技术领域：
，具体涉及一种灵芝孢子破壁方法及其制备得到的破壁灵芝孢子粉和应用。
背景技术：
：灵芝是一种含有丰富的生理活性的物质，包括灵芝多糖类、三萜类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽类、矿物元素、脂肪酸等。其药理作用有主要有抗肿瘤、免疫调节、抗辐射、镇静、安定、强心、降压、镇咳、平喘、降血糖等。灵芝的活性成分大多存在于灵芝孢子中，因此，要想充分利用灵芝孢子的活性成分，需要将灵芝孢子进行破壁处理，如此才能将更多的活性物质释放出来。但是灵芝孢子外壁较厚，因此灵芝孢子破壁技术就成了灵芝孢子利用的关键。目前，对于灵芝孢子的破壁技术包括多种，例如超微粉碎破壁法，匀浆破壁法，超声破壁法，萌发破壁法，生物酶破壁法，co2超临界破壁法、高能球磨撞击法等。但是超微粉碎破壁法、匀浆破壁法、超声破壁法、高能球磨撞击法破壁率都比较低，并且超微粉碎破壁法、高能球磨撞击法和超声破壁法对活性物质的破坏力较大，容易使活性物质变质。而萌发破壁法破壁过程较长，操作繁琐，不适于大批量处理，并且破比率也比较低。生物酶破壁法的影响因素太多，其中酶用量、温度、ph值、时间等都会影响破壁的效率，因此实用性不强。co2超临界破壁法破壁过程是在超高压状态下进行的，co2在临界液态条件下会将大量脂肪酸类活性物质释放掉，造成活性物质的流失。因此，开发一种既能充分保留灵芝孢子粉的活性物质，又能实现较高的破壁率的方法将是使灵芝孢子粉功效得到最优发挥的关键。技术实现要素：为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种灵芝孢子破壁方法及该方法制备得到的破壁灵芝孢子粉和应用。发明人发现，将灵芝孢子粉与富勒烯粉末混合并进行预处理，使富勒烯粉末中的团簇颗粒被粉碎成微米和/或纳米颗粒，进入灵芝孢子壳壁及内部；然后选用外加能量源的方式辐照富勒烯，使之产生相变，发生体积膨胀，将灵芝孢子外壁撑开，实现了灵芝孢子的破壁。所述外加能量源引发的富勒烯相变过程不产生高热量，且无高压力，能保持灵芝孢子内活性成分的稳定性，同时可以实现灵芝孢子至少98％的破壁率。同时，所采用的富勒烯可以进行回收并重复利用，从原料利用的角度，大大节约了生产成本。基于这样的思路，完成了本发明。本发明目的是通过如下技术方案实现的：一种灵芝孢子破壁方法，所述破壁方法包括如下步骤：1)将富勒烯粉末与灵芝孢子粉混合并进行预处理，以使富勒烯粉末进入灵芝孢子；2)对预处理后的混合粉末进行辐照。根据本发明，本领域技术人员可以理解，各种富勒烯均可使用。优选所述富勒烯为c60，c70，c76中的一种或几种的混合物，更优选为c60，c70中的一种或其混合物，最优选为c60。根据本发明，优选所述富勒烯粉末的粒径为10nm～50μm，更优选为10nm～5000nm，最优选为100nm～1000nm；优选预处理后富勒烯粉末的粒径为50nm-500nm，最优选为100nm-200nm。根据本发明，本领域技术人员可以理解，所述灵芝孢子粉没有限定，采用现有技术中任一种均可。根据本发明，优选所述富勒烯粉末与灵芝孢子粉的质量比为1:5～10000，更优选为1:10～1000，最优选为1:100～500。根据本发明，在步骤1)中，优选所述预处理的温度≤50℃。根据本发明，在步骤1)中，优选所述预处理包括但不限于低温高能球磨、高压均质处理、高速均质处理等；最优选，所述预处理为低温高能球磨。根据本发明，优选所述低温高能球磨的球磨温度为20～40℃，更优选为25～35℃，最优选为30℃；优选球磨时间为1～20h，进一步优选为2～16h，更优选为4～12h，最优选为8h；优选球磨频率为200～2000r/min，进一步优选为300～1500r/min，更优选为500～1000r/min，最优选为700r/min。本发明中，通过预处理(例如为低温高能球磨、高压均质处理、高速均质处理等)，一方面可将富勒烯粉末中的团簇颗粒粉碎成微米和/或纳米颗粒，同时会在灵芝孢子外壁产生一定的裂隙，这样可以使得富勒烯颗粒更好的进入灵芝孢子壳壁及内部。根据本发明，所述辐照是通过外加能量源实现的，可以是磁场，射频，射线中的一种或多种；优选为射频。根据本发明，优选所述磁场的能量为0.1-10t；优选所述磁场辐照的时间为1-12h。根据本发明，优选所述射频的能量为100～1000mhz，最优选为300～500mhz；优选所述射频辐照的时间为0.5～20h，更优选为1～12h，最优选为3～9h。根据本发明，优选所述射线的能量为1-1000ev；优选所述射线辐照的时间为0.5-12h。本发明中，通过辐照使灵芝孢子内的富勒烯产生相变，发生体积膨胀，将孢子外壁撑开，从而实现了对灵芝孢子的破壁处理。本发明还提供一种破壁灵芝孢子粉的制备方法，所述方法包括如下步骤：1)将富勒烯粉末与灵芝孢子粉混合并进行预处理，以使富勒烯粉末进入灵芝孢子；2)对预处理后的混合粉末进行辐照，得到破壁灵芝孢子富勒烯混合粉末；3)向上述步骤2)得到的破壁灵芝孢子富勒烯混合粉末中加入水，搅拌、离心、去除沉淀，取上清液进行干燥，即制备得到破壁灵芝孢子粉。根据本发明，优选所述水的温度为50～100℃，最优选为60～80℃。根据本发明，优选所述破壁灵芝孢子富勒烯混合粉末和水的质量体积比为1-1000mg/ml；最优选为50-500mg/ml。根据本发明，优选所述加入水、搅拌和离心重复3～5遍。根据本发明，本领域技术人员可以理解，各种干燥形式均可使用。优选，所述干燥为真空干燥或常压风干；优选所述干燥的温度为20-50℃，更优选为30-45℃，最优选为40℃；优选所述干燥的时间为1-48h，更优选为10-24h，最优选为12h。本发明中，由于富勒烯不溶于水，破壁或未破壁的灵芝孢子粉在室温下都难溶于水，而在50～100℃(优选为60～80℃)下破壁或未破壁的灵芝孢子粉易溶于水，利用灵芝孢子粉的溶解性，将其从富勒烯粉末中分离提取出来；而所述富勒烯可以通过离心将其去除。本发明还提供一种破壁灵芝孢子粉，所述破壁灵芝孢子粉是通过上述方法制备得到的。本发明还提供一种灵芝孢子油的制备方法，所述方法包括如下步骤：1)将富勒烯粉末与灵芝孢子粉混合并进行预处理，以使富勒烯粉末进入灵芝孢子；2)对预处理后的混合粉末进行辐照，得到破壁灵芝孢子富勒烯混合粉末；3)向上述步骤2)得到的破壁灵芝孢子富勒烯混合粉末中加入水，搅拌、离心、去除沉淀，取上清液进行干燥，制备得到破壁灵芝孢子粉；4)由上述步骤3)得到的破壁灵芝孢子粉提取灵芝孢子油。本领域技术人员可以理解，可以利用本领域已知的各种方法由破壁灵芝孢子粉中提取灵芝孢子油。本发明还提供一种灵芝孢子油，所述灵芝孢子油是通过上述方法制备得到的。本发明进一步提供了本发明的破壁灵芝孢子粉或灵芝孢子油在制备用于预防和/或治疗肿瘤的药物中的用途或者在制备用于预防和/或治疗化疗药物所致肝脏损伤的药物中的用途。本发明的有益效果：1.本发明提供了一种灵芝孢子破壁方法，所述方法是将灵芝孢子粉与富勒烯粉末混合并进行预处理，使富勒烯粉末中的团簇颗粒被粉碎成微米和/或纳米颗粒，进入灵芝孢子壳壁及内部；然后选用外加能量源的方式辐照富勒烯，使之产生相变，发生体积膨胀，将灵芝孢子外壁撑开，实现了灵芝孢子的破壁，可以实现灵芝孢子至少98％的破壁率。2.本发明还提供了一种破壁灵芝孢子粉的制备方法及其制备得到的破壁灵芝孢子粉；所述方法不涉及高温高压，最大程度的保留了灵芝孢子的活性成分含量及活性，抑瘤率高，同时其对化疗药物所致肝脏损伤具有明显的保护作用。3.本发明还提供了一种灵芝孢子油的制备方法及其制备得到的灵芝孢子油，所述灵芝孢子油是从本发明所制备得到的破壁灵芝孢子粉中提取得到的，其提取率高。附图说明图1为本发明实施例9中不同组肝脏细胞情况。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。本发明所述的实施例中的球磨是在xqm-2l型球磨机中进行，所述的球磨操作为球磨温度为30℃；球磨时间为8h；球磨频率为700r/min。本发明中，所述的破壁率的计算方法：1)在室温下，用分析天平(精度0.lmg)称取2.0mg已破壁的灵芝孢子粉放入10ml试管中，再用精密手持滴管在各试管中加入2ml的蒸馏水，摇荡5min左右，由于灵芝孢子粉在室温下，难溶于水中，因而制备得到灵芝孢子粉的悬浊液；2)用微量注射器(10μl)吸取悬浊液6μl，一次性将悬浊液滴到计数盘内，并盖上一玻璃片，静置2min～3min，使悬浊液在计数盘内分布均匀，待灵芝孢子粉下沉不再移动后计数。通过光学显微镜鉴别孢子的破壁与否，未破壁的孢子壁光滑完整、丰满，双壁结构清晰，个体形态一致；破壁后，孢子壁不完整、内容物呈不规则块状；3)灵芝孢子破壁率的计算：灵芝孢子破壁率的计算公式：破壁率＝[(a-b)/a]×100％；其中，a为破壁前完整孢子数；b为破壁后完整孢子数；破壁前完整孢子数为破壁后完整孢子数和破壁后不完整孢子数之和。本发明中，所述的灵芝孢子油的提取方法为超临界co2萃取方法；所述的灵芝孢子油的提取率计算方法为通过检测灵芝孢子油中脂肪酸的含量来判定灵芝孢子油的提取率，具体为：称取20mg所得孢子油于l0ml于具塞试管中，加入0.4mol/lkoh-甲醇溶液2ml，于70℃水浴加热30min，反应完毕后，加入蒸馏水2ml，再加浓盐酸中和至ph值呈中性。然后加入2ml正己烷萃取，取上清液，反复洗涤2～3次。合并上清液并减压浓缩至干，再加1％的硫酸.甲醇溶液2ml，于70℃水浴30min，反应完毕后，正己烷萃取，再用蒸馏水，充分振荡，静置分层后取上清液，反复洗涤2～3次，合并上清液并用无水硫酸钠干燥，最后取上清液1μl进行gc-ms分析，由分析得到的酯化物推算灵芝孢子油中脂肪酸含量，进而确定提取率。实施例1将1g富勒烯c60与100g灵芝孢子粉于球磨机中进行充分混合球磨，然后将混合粉末放置于一玻璃瓶中，玻璃瓶通过线圈与射频仪链接，打开射频仪，调节功率为300mhz，持续辐照2h后，关闭射频仪。将混合粉末取出后加入80℃水充分搅拌，并进行离心操作，重复3-5次；由于富勒烯不溶于水，会沉积在底部，收集可溶物——上层清液，将其干燥(40℃下干燥12h)后即制备得到所述破壁灵芝孢子粉。实施例2将1g富勒烯c60与500g灵芝孢子粉于球磨机中进行充分混合球磨，然后将混合粉末放置于一玻璃瓶中，玻璃瓶通过线圈与射频仪链接，打开射频仪，调节功率为400mhz，持续辐照4h后，关闭射频仪。将混合粉末取出后加入80℃水充分搅拌，并进行离心操作，重复3-5次；由于富勒烯不溶于水，会沉积在底部，收集可溶物——上层清液，将其干燥(40℃下干燥12h)后即制备得到所述破壁灵芝孢子粉。实施例3将1g富勒烯c60与300g灵芝孢子粉于球磨机中进行充分混合球磨，然后将混合粉末放置于一玻璃瓶中，玻璃瓶通过线圈与射频仪链接，打开射频仪，调节功率为300mhz，持续辐照3h后，关闭射频仪。将混合粉末取出后加入80℃水充分搅拌，并进行离心操作，重复3-5次；由于富勒烯不溶于水，会沉积在底部，收集可溶物——上层清液，将其干燥(40℃下干燥12h)后即制备得到所述破壁灵芝孢子粉。实施例4将1g富勒烯c70与100g灵芝孢子粉于球磨机中进行充分混合球磨，然后将混合粉末放置于一玻璃瓶中，玻璃瓶通过线圈与射频仪链接，打开射频仪，调节功率为300mhz，持续辐照3h后，关闭射频仪。将混合粉末取出后加入80℃水充分搅拌，并进行离心操作，重复3-5次；由于富勒烯不溶于水，会沉积在底部，收集可溶物——上层清液，将其干燥(40℃下干燥12h)后即制备得到所述破壁灵芝孢子粉。实施例5将1g富勒烯c76与100g灵芝孢子粉于球磨机中进行充分混合球磨，然后将混合粉末放置于一玻璃瓶中，玻璃瓶通过线圈与射频仪链接，打开射频仪，调节功率为300mhz，持续辐照3.5h后，关闭射频仪。将混合粉末取出后加入80℃水充分搅拌，并进行离心操作，重复3-5次；由于富勒烯不溶于水，会沉积在底部，收集可溶物——上层清液，将其干燥(40℃下干燥12h)后即制备得到所述破壁灵芝孢子粉。对比例1——高能球磨撞击法取300g灵芝孢子粉于球磨机中进行充分混合球磨，所述球磨机的转速700转/分钟，球磨时间为10h。球磨结束后，将球磨罐中粉体取出，得到破壁后的灵芝孢子粉。对比例2——co2超临界破壁法取300g灵芝孢子粉于1lco2超临界萃取釜中，萃取釜和分离釜的温度和压力分别设置为35mpa、40℃，运行3h，然后高压条件下静止12h后迅速释放临界气体co2。临界气体co2释放结束后，收集样品即为破壁灵芝孢子粉。实施例6——实施例3、对比例1、对比例2制备得到的破壁灵芝孢子粉的破壁率对比由于在本发明的制备方法中，离心去除富勒烯时，会有极少量的未破壁灵芝孢子同富勒烯一起被去除，为了更科学的进行对比，将实施例3的沉淀物稍作处理：将沉淀物中加入过量甲苯，上清液为溶解了富勒烯的紫色溶液，离心，将沉淀用乙醇反复清洗几次后干燥，将干燥后的粉末与实施例3得到的破壁灵芝孢子粉进行混合，将混合后的样品用于破壁率的对比分析。对比例1和对比例2得到的破壁灵芝孢子粉无需进行处理。通过上述破壁率的计算方法计算得到如下结果：案例破壁率实施例398％对比例175％对比例280％由上表对比可以看出，本发明所述的破壁方法能极大的提高灵芝孢子的破壁率。实施例7——从实施例3、对比例1、对比例2制备得到的破壁灵芝孢子粉中提取灵芝孢子油的提取率通过上述提取方法及提取率的计算方法计算得到如下结果：案例灵芝孢子油提取率实施例345％对比例123％对比例222％由上表对比可以看出，本发明所述的破壁方法能极大的提高灵芝孢子活性物质的利用率。实施例8——实施例3、对比例1、对比例2制备得到的破壁灵芝孢子粉的抗癌性能对比本实施例考察了破壁灵芝孢子粉对小鼠肝癌肿瘤的生长抑制作用，其中，动物品系：balb/c雌鼠，5周，体重在16-20g之间；肿瘤模型：小鼠肝癌h22瘤株；给药方式：口服；给药剂量：400mg/kg，共计给药10次，每天给药1次；实验分组：随机分组，每组6只。药物a组：实施例3制备得到的破壁灵芝孢子粉；药物b组：对比例1制备得到的破壁灵芝孢子粉；药物c组：对比例2制备得到的破壁灵芝孢子粉；对照组：生理盐水；实验方法：皮下接种100μl浓度为5×107/ml的h22肝癌细胞；接种24小时后开始给药，连续给药10次；实验期间每隔一天称量小鼠体重并观察肿瘤生长情况，观察至接种后15天结束实验，取小鼠肿瘤称重及测量体积，计算抑瘤率。抑瘤率的计算公式：抑瘤率＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％通过上述抗癌方法及抑瘤率计算得到如下结果：案例平均瘤重(g)抑瘤率实施例30.52±0.1365.5％对比例10.78±0.0847.9％对比例20.67±0.1555.3％对照组1.5±0.17--由上表对比可以看出，本发明所述的破壁方法制备得到的破壁灵芝孢子粉具有最高的抑瘤率。实施例9——破壁灵芝孢子粉对化疗药物引起的肝脏损伤的保护作用动物模型：选用icr5周龄雌性小鼠，将其随机分成5组，每组6只，分别对应对照组、模型组和实验组：对比例1组、对比例2组和实施例3组。实验组：化疗药物通过灌胃方式给予小鼠，具体剂量为：环磷酰胺80mg/kg体重/次，白消安20mg/kg体重/次；实施例3、对比例1和对比例2中的破壁灵芝孢子粉通过灌胃方式给予小鼠，具体剂量为：100μl/次，浓度为10mg/ml。对照组：用同体积的生理盐水代替实验组的化疗药物和破壁灵芝孢子粉，其它处理方式与实验组一致。模型组：化疗药物环磷酰胺和白消安通过灌胃方式给予小鼠，其用量同实验组，并用同体积的生理盐水替代实施例3、对比例1和对比例2中的破壁灵芝孢子粉，并通过灌胃方式给予小鼠，其它处理方式与实验组一致。先培养小鼠2～3天，观察小鼠状态，状态稳定后，作为实验的第1天。然后分别在第2、5、9和12天将化疗药物或同体积的生理盐水采用灌胃方式给予小鼠，在第19、20、21、24和25天将实施例3、对比例1和对比例2中的破壁灵芝孢子粉或同体积的生理盐水采用灌胃方式给予小鼠后观察效果。由附图1可以看出，模型组显示，采用灌胃方式给予化疗药物后，小鼠肝脏有较明显的损伤；实验组显示，采用灌胃方式给予实施例3中的破壁灵芝孢子粉对小鼠肝脏损伤有明显改善，其肝脏细胞情况较接近对照组，而采用灌胃方式给予对比例1和对比例2中的破壁灵芝孢子粉对小鼠肝脏损伤的保护效果较弱，其肝脏细胞情况较接近模型组。说明本发明制备得到的破壁灵芝孢子粉对化疗药物引起的肝脏损伤确实有良好的保护作用。以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12