去细胞角膜基质透镜及其制备方法与流程

本发明涉及组织工程学技术领域，尤其是涉及一种去细胞角膜基质透镜及其制备方法。

背景技术：

远视是平行光线进入眼内后在视网膜之后的一种屈光状态，当眼球的屈光力不足或其眼轴长度不足时就产生远视。远视作为眼科疾病的一种，极大的影响了人们的生活质量，尤其是随着年龄的增大，远视的发生几率也会升高。

远视是临床常见的屈光不正眼病，高度远视的矫正一直是屈光治疗的难题。目前远视矫正治疗的方法主要包括框架眼镜、角膜接触镜或者屈光手术。

老视是一种生理现象不是病理状态也不属于屈光不正，是人们步入中老年后必然出现的视觉问题。随着年龄的增长，出现老视的患者必须增加凸透镜才能获得清晰的近视力。

目前，植入式的角膜接触镜多采用合成材料制成，可以根据不同患者的屈光状态生产出各种度数和型号大小的透镜，术后视力恢复快，但其弊端也比较明显，比如：术后可能出现散光增加，早期可能出现角膜雾状浑浊；而且其适用症有限，并存在角膜瓣相关风险，在长期植入过程中可能出现角膜损伤，视觉质量下降的情况；另外，其安全性较低，属于永久性异物，在长期植入过程中可能出现免疫排斥反应。因此，对于高度远视、老视及合并屈光参差的患者，需要找到适应症更广、安全性更高、预测性更强、稳定性更佳的透镜材料。

对于角膜基质移植所需的材料而言，不仅要求有良好的光学特性，还要求与人眼组织有良好的组织相容性，人工合成材料则在生物组织相容性上有很大的弊端，而利用动物源性的角膜，则能够在很大程度上缓解人工合成材料的组织相容性差的问题。

但使用动物源性角膜也存在着一些问题，例如：(1)虽然动物源性角膜的组织相容性较好，但如果其自身细胞去除不完全，则会存在产生免疫反应的风险；(2)此外，虽然目前已有一些去除角膜基质细胞的方法，但是现有的角膜去细胞基质制备工艺容易导致角膜吸水肿胀，导致基质中的胶原纤维排列或构象发生改变，使角膜基质透明度下降，原始形态、曲率等发生改变；(3)而且，传统的角膜透镜通常是以特殊的角膜刀切削制得，工艺相对粗糙，可能造成削切面不够光滑，或者透镜部分丢失，预测性和安全性较差，且术后近期并发症，如散光等发生率较高。

因此，如何获得安全性更高、透明度更佳和性能更稳定的角膜基质透镜，仍需要进行不断的研究。安全、有效的人角膜基质的处理方法，在实际临床应用中，具有重大的意义。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供一种去细胞角膜基质透镜的制备方法，本发明的第二个目的在于提供去细胞角膜基质透镜，以缓解现有技术中存在的角膜透镜安全性低、透明度差和性能不稳定的技术问题。

本发明提供了一种去细胞角膜基质透镜的制备方法，包括：将带有细胞的角膜基质透镜依次进行细胞裂解和交联处理，然后经过灭菌后得到所述去细胞角膜基质透镜。

进一步的，所述细胞裂解的方法包括：用含有0.1％-3％tritonx-100的0.9％的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液浸泡12-48h，然后用0.9％生理盐水或磷酸盐缓冲溶液漂洗48-96h。

进一步的，所述交联的方法包括：用含有交联剂的0.9％生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中浸泡，然后用0.9％生理盐水或者磷酸盐缓冲溶液漂洗24-96h，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、n-羟基硫代琥珀酰亚胺、京尼平或者戊二醛。

进一步的，所述交联剂的使用量与角膜基质透镜的质量比为1:1-1:15。

进一步的，所述交联剂的使用量与角膜基质透镜的质量比为1:5-1:10。

进一步的，在所述细胞裂解处理之前，还包括消毒处理，所述消毒的方法包括：用含有浓度为0.01～0.1mg/ml青霉素和浓度为0.05～0.5mg/ml链霉素的生理盐水浸泡1-5h，然后用0.9％生理盐水或磷酸盐缓冲溶液漂洗。

进一步的，在所述交联处理之后，还包括灭菌处理，所述灭菌的方法包括：用γ射线进行辐照，辐照剂量为20～30kgy。

进一步的，所述带有细胞的角膜基质透镜是通过全飞秒激光技术获得的。

进一步的，所述制备方法包括：

步骤(a)，消毒：将通过全飞秒激光技术获得带有细胞的准确厚度的角膜基质透镜，用含有浓度为0.01～0.1mg/ml青霉素和浓度为0.05～0.5mg/ml链霉素的生理盐水浸泡1-5h，然后用0.9％生理盐水或磷酸盐缓冲溶液漂洗；

步骤(b)，细胞裂解：用含有0.1％-3％tritonx-100的0.9％生理盐水或磷酸盐缓冲溶液浸泡12-48h，然后用0.9％的生理盐水漂洗48-96h；

步骤(c)，交联：用含有交联剂的0.9％生理盐水或磷酸盐缓冲溶液中浸泡，然后用0.9％生理盐水或者磷酸盐缓冲溶液漂洗24-96h，所述交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，或n-羟基硫代琥珀酰亚胺、或戊二醛、或京尼平；所述交联剂的使用量与所述经过细胞裂解处理的角膜基质透镜的质量比为1:1-1:15；

步骤(d)，灭菌：用γ射线进行辐照，辐照剂量为20～30kgy。

另外，本发明还提供了按照所述的制备方法得到的去细胞角膜基质透镜。

本发明提供的去细胞角膜基质透镜的制备方法，不仅能够有效去除基质中细胞成分降低基质的免疫原性，提高角膜的力学强度，更能有效保持角膜基质的原始形态和透明度，所制得的去细胞角膜基质透镜具有安全性更高、透明度更佳和性能更稳定的特点。而且，角膜基质透镜植入后可以作为角膜基质细胞生长增值的支架，角膜细胞可以在透镜中迁移和生长，最终与自体角膜融为一体，可作为永久性植入透镜，为临床上高度远视及屈光参差的矫正提供新的治疗方法。另外，以该透镜作为植入式角膜接触镜可以避免出现合成材料类角膜透镜的永久异物情况，避免免疫排斥等现象的出现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为去细胞前的角膜基质透镜的he染色结果图；

图2为去细胞处理后的角膜基质透镜的he染色结果图；

图3为去细胞并进行交联后的角膜基质透镜的he染色结果图；

图4为去细胞前后的角膜基质透镜的透光率比较图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

现有的角膜基质透镜去细胞工艺尚不成熟，制得的角膜基质透镜材料存在着安全性更低、透明度差和性能不稳定的问题。本发明就是针对现有技术中存在的这些问题，所提出的改进。

本发明提供了去细胞角膜基质透镜的制备方法。

其中，细胞裂解的方法中涉及的0.1％-3％tritonx-100，例如可以为，但不限于0.1％tritonx-100、0.3％tritonx-100、0.5％tritonx-100、0.8％tritonx-100、1％tritonx-100、1.5％tritonx-100、2％tritonx-100、2.5％tritonx-100或者3％tritonx-100。

其中，交联的方法中涉及的交联剂例如可以为，但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，或者n-羟基硫代琥珀酰亚胺，或者京尼平，或者戊二醛。

其中，交联的方法中涉及的交联剂的使用量与角膜基质透镜的质量比为1:1-1:15，其质量比例如可以为，但不限于1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或者1:15。

其中，消毒的方法中涉及的浓度为0.01～0.1mg/ml青霉素和浓度为0.05～0.5mg/ml链霉素的生理盐水或磷酸盐缓冲溶液，其中青霉素例如可以为，但不限于0.01mg/ml、0.03mg/ml、0.05mg/ml、0.07mg/ml、0.1mg/ml；其中链霉素例如可以为，但不限于0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml。

其中，灭菌的方法中涉及的辐射剂量为20～30kgy，例如可以为，但不限于20kgy、21kgy、22kgy、23kgy、24kgy、25kgy、26kgy、27kgy、28kgy、29kgy或30kgy。

其中，带有细胞的角膜基质透镜来自于人或者其他动物(其他动物例如可以为，但不限于猪、牛或者羊等)，优选的，带有细胞的角膜基质透镜来自于人。

其中，涉及的全飞秒激光技术，是指利用全飞秒激光小切口角膜基质透镜取出术(smallincisionlenticuleextraction,smile)进行切取的技术。smile是应用超短脉冲激光在角膜内完成两次脉冲扫描，制作角膜基质内镜片后将其取出，可以降低对角膜神经的损伤及生物与力学的影响。

另外，本发明中涉及的带有细胞的角膜基质透镜是指未经处理的、直接从人或者其他动物眼内取出的新鲜的角膜基质透镜。

需要注意的是，按照本发明提供的方法，能够获得多种厚度精确的透镜，优选的，厚度为10-90μm。

为了有助于更清楚的理解本发明，现通过具体的实施例对本发明的内容进行详细的介绍。如未明确指出，以下实施例中涉及的实验操作方法为常用的分子生物学或医学操作方法，涉及的试剂、仪器为常规的市售试剂或者仪器。

实施例1去细胞角膜基质透镜的制备方法

步骤(a)，消毒：将通过全飞秒激光技术获得的带有细胞的准确厚度的角膜基质透镜，用含有浓度为0.01mg/ml青霉素和浓度为0.1mg/ml链霉素的生理盐水浸泡3h，然后用0.9％的生理盐水漂洗；

步骤(b)，细胞裂解：用含有0.5％tritonx-100的0.9％的生理盐水浸泡24h，然后用0.9％的生理盐水漂洗96h；

步骤(c)，交联：用含有交联剂的0.9％的生理盐水中浸泡，然后用0.9％生理盐水漂洗24h，交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)；交联剂的使用量与经过细胞裂解处理的角膜基质透镜的质量比为1:5；

步骤(d)，灭菌：将交联后的角膜透镜用γ射线进行辐照，辐照剂量为25kgy；

需要说明的是，在本实施例1中，带有细胞的角膜基质透镜来自于人。

另外，发明人对按照实施例1的方法制备得到的去细胞角膜基质透镜的性能进行了分析，具体实验如下。

he染色实验

分别对带有细胞的角膜基质透镜、按照实施例1的方法制备得到的去细胞角膜基质透镜进行he染色，结果分别如图1、图2和图3所示，从带有细胞的角膜基质透镜的he染色图(图1)中可以看到有较多的细胞存在，而从按照实施例1的方法制备得到的去细胞角膜基质透镜he染色图(图2)中则基本看不到细胞，但基质纤维间存在一些空隙；而按照实施例1的方法进行交联后得到的去细胞角膜基质透镜he染色图(图3)中则基本看不到空隙，说明本发明提供的方法可以有效除去角膜基质透镜中的细胞，并保持角膜基质透镜形态学稳定。

透光率检测实验

利用分光光度计在可见光波段(390nm-780nm)分别对带有细胞的角膜基质透镜、按照实施例1的方法制备得到的去细胞角膜基质透镜进行透光率分析，结果如图4所示，按照实施例1的方法制备得到的去细胞角膜基质透镜的可见光透光率基本与新鲜角膜基质(即带有细胞的角膜基质透镜)一致，说明该工艺对角膜基质透镜的透光性能影响较小，能使之保持较好的透光率。

其中，图4中，去细胞角膜基质即为去细胞角膜基质透镜；新鲜角膜基质即为带有细胞的角膜基质透镜。

实施例2去细胞角膜基质透镜的制备方法

步骤(a)，消毒：将通过全飞秒激光技术获得的带有细胞的准确厚度的角膜基质透镜，用含有浓度为0.05mg/ml青霉素和浓度为0.2mg/ml链霉素的生理盐水浸泡2h，，然后用0.9％的生理盐水漂洗；

步骤(b)，细胞裂解：用含有0.3％tritonx-100的0.9％的生理盐水浸泡48h，然后用0.9％的生理盐水漂洗96h；

步骤(c)，交联：用含有交联剂的0.9％的生理盐水中浸泡，然后用0.9％生理盐水漂洗24h，交联剂n-羟基硫代琥珀酰亚胺(nhs)；交联剂的使用量与经过细胞裂解处理的角膜基质透镜的质量比为1:9；

步骤(d)，灭菌：将交联后的角膜透镜用γ射线进行辐照，辐照剂量为25kgy；

需要说明的是，在本实施例2中，带有细胞的角膜基质透镜来自于人。

实施例3去细胞角膜基质透镜的制备方法

步骤(a)，消毒：将新鲜的带有细胞的角膜基质透镜，用含有浓度为0.1mg/ml青霉素和浓度为0.5mg/ml链霉素的生理盐水浸泡1h，，然后用0.9％的生理盐水漂洗；

步骤(b)，细胞裂解：用含有0.4％tritonx-100的0.9％的生理盐水浸泡36h，然后用0.9％的生理盐水漂洗72h；

步骤(c)，交联：用含有交联剂的0.9％的生理盐水中浸泡，然后用0.9％生理盐水漂洗24h，交联剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺；交联剂的使用量与经过细胞裂解处理的角膜基质透镜的质量比为1:10；

步骤(d)，灭菌：将交联后的角膜透镜用γ射线进行辐照，辐照剂量为25kgy；

需要说明的是，在本实施例3中，带有细胞的角膜基质透镜来自于人。

按照本发明提供的去细胞角膜基质透镜的制备方法，制得的去细胞角膜基质透镜具有以下优点：

首先，在生理盐水环境对角膜基质透镜进行细胞裂解和交联，避免角膜基质透镜出现吸水/脱水状态，改变胶原纤维的构象和排列，这样能使角膜基质透镜有效地保持原始形态、厚度和曲率。在这种状态下对角膜基质透镜中的细胞进行裂解和交联，不仅能有效除去基质中细胞成分降低基质的免疫原性，提高角膜的力学强度，更能有效保持角膜基质透镜的原始形态和透明度，从而获得安全性更高、透明度更佳和性能更稳定的角膜基质透镜。

其次，角膜基质透镜植入后可以作为角膜基质细胞生长增值的3维支架，角膜细胞可以在透镜中迁移和生长，最终与自体角膜融为一体，可作为永久性植入透镜，为临床上高度远视及屈光参差的矫正提供新的治疗方法。另外，以该透镜作为植入式角膜接触镜可以避免出现合成材料类角膜透镜的永久异物情况，避免免疫排斥等现象的出现。

另外，全飞秒激光技术可以精确切削，使得角膜透镜的制备更加精密，可以避免传统切削工艺造成的角膜透镜切削面不够光滑或者透镜部分丢失；而本申请则利用了全飞秒激光技术进行切削，制备工艺更精密，预测性更强。

因此，本发明提供的去细胞角膜基质透镜具有安全性更高、透明度更佳和性能更稳定的特点。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明的限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。