氢分子液体/气体在制备抑制肿瘤干细胞药物中的应用的制作方法

本发明属于制备抑制肿瘤干细胞药物技术领域，具体涉及氢分子液体/气体在制备抑制肿瘤干细胞药物中的应用。

技术背景

近年来，随着研究发现肿瘤并不是由均一的肿瘤细胞组成的，肿瘤内不同的细胞具有不同的增殖、浸润和转移能力，具有很强的异质性。其中一小部分细胞具有自我更新、无限增殖和多向分化的潜能，这部分细胞被称作肿瘤干细胞(cancerstemcells，csc)，其肿瘤干细胞(csc)具有自我更新和分化的能力，是形成肿瘤和启动肿瘤快速增殖的初始细胞，还可以通过不断分化产生新的肿瘤细胞形成完整肿瘤。肿瘤干细胞也被认为是耐药和复发的罪魁祸首，寻找有效的抑制胶质瘤干细胞的药物已成为研究者和临床医生关注的热点。

氢是世界上分子量最小、最丰富的元素，约占整个宇宙质量的90％。氢气是一种无色无味的双原子气体。目前氢气作为清洁能源气体被广泛研究，直到2007年日本学者太田成男教授领导的研究小组发现动物呼吸2％的氢气就可有效清除自由基，显著改善脑缺血再灌注损伤，氢气选择性抗氧化作用的特性使得氢分子的生物学功能逐渐受到广泛关注，越来越多的临床和实验研究表明氢分子能够治疗多种由于氧化损伤引起的疾病，如帕金森症、糖尿病、代谢综合征、线粒体疾病等。氢气用于抑制肿瘤的研究，其实早在1975年dole等在science上发表了利用氢气治疗恶性黑色素瘤的文章，不过是采用呼吸8个大气压的氢气，由于呼吸高压氢气存在一定危险，难以被广泛采用。saitoh等采用富氢电解水处理人舌癌细胞hsc-4，证明在细胞水平氢分子能够显著降低肿瘤细胞克隆形成能力。到目前为止，氢气或富氢水是否能够抑制肿瘤干细胞目前仍然未见相关报道。

本发明的研究发现氢气能够显著抑制脑胶质瘤及其他肿瘤干细胞球的增殖能力，呼吸氢气和富氢水能够显著抑制人和大鼠来源的胶质瘤体内成瘤能力，并且氢气和富氢水处理后人和大鼠胶质瘤细胞的侵袭能力显著下降，进一步发现氢气和富氢水能够显著抑制肿瘤干细胞表面标记cd133的表达，而促进分化标记的表达。

技术实现要素：

本发明的目的制备能够显著抑制人和大鼠肿瘤干细胞球的药物。尤其是将含有氢分子的液体/气体用于制备抑制脑瘤肿瘤干细胞及其他肿瘤干细胞药物，显著抑制肿瘤体内成瘤能力，进一步显著抑制肿瘤干细胞表面标记cd133的表达，而促进分化标记的表达，并且使得肿瘤细胞的侵袭能力显著下降。

含有氢分子的液体用于制备抑制肿瘤干细胞药物的应用。

含有氢分子的液体为富氢溶液，该富氢溶液的溶剂含有水，优选(包括但不限于)纯净水、生理盐水、牛奶、有机酸的酸性水溶液、饮料等可饮用的水溶液，富氢溶液中氢的浓度为氢分子饱和，为15-30℃、1个大气压条件下或通过加压等其他方法制备的浓度范围不低于100μmol/l，上限浓度为氢在水中的过饱和浓度。

一种制备抑制肿瘤干细胞药物，其特征在于，药物为富氢溶液，该富氢溶液含有水，优选(包括但不限于)纯净水、生理盐水或可供饮用的水溶液、牛奶、有机酸的酸性水溶液、饮料等可饮用的水溶液，富氢溶液中氢的浓度为氢分子饱和，为15-30℃、1个大气压条件下或通过加压等其他方法制备的浓度范围不低于100μmol/l，上限浓度为氢在水中的过饱和浓度。

抑制肿瘤干细胞药物为口服药、注射药或洗浴用药。

含有氢分子的气体用于制备抑制肿瘤干细胞药物的应用。

含有氢分子的气体为含有氧气、空气、水蒸气中的一种或几种与氢气的混合气体，含有氢分子的气体中氢气的体积百分含量为2％-80％或高压氢，优选体积百分含量为20-70％；

一种制备抑制肿瘤干细胞药物，其特征在于，药物为含有氢分子的气体，为含有氧气、空气、水蒸气中的一种或几种与氢气的混合，氢气的体积百分含量为2％-80％或高压氢，优选体积百分含量为20-70％。

抑制肿瘤干细胞药物为呼吸的气体吸入药物。

本发明的氢分子液体/气体在制备抑制肿瘤干细胞药物中的应用，其中氢分子能显著抑制肿瘤体内成瘤能力，使得肿瘤细胞的侵袭能力显著下降，进一步显著抑制肿瘤干细胞表面标记cd133的表达，而促进分化标记的表达。

附图说明

图1氢气处理组和对比组抑制体内肿瘤体积的比较图，氢气处理组显著抑制胶质瘤体内增殖，其中，图a为实验动物饮用富氢水和对照组实物结果，图b为实验动物呼吸氢气组和对照组结果；

图2氢气处理组和对比组抑制肿瘤干细胞球的增殖的比较图，氢气处理组显著抑制多种肿瘤细胞的肿瘤干细胞球增殖；其中，图a为大鼠和人的脑胶质瘤细胞c6和u87肿瘤球形成实验的细胞形态结果和统计图，图b为hepg2、pa-1和hs38.t细胞的肿瘤球形成结果统计。

图3氢气处理组和对比组抑制干细胞标记cd133的表达的比较图，氢气处理组显著抑制干细胞标记cd133的表达；

图4氢气处理组和对比组抑制肿瘤干细胞标记cd133的表达的免疫荧光图比较，免疫荧光显示氢气处理组显著抑制肿瘤干细胞标记cd133的表达，促进分化标记gfap的表达；

图5氢气处理组和对比组抑制胶质瘤迁移侵袭能力的比较图，氢气处理组显著抑制胶质瘤迁移侵袭能力。

具体实施方式

下面采用以下实施例即实验数据说明本发明，但本发明的技术范围不仅限于此，可在不脱离本发明主题和范围的情况下以同等方式对本发明进行各种改变和修饰。

实施例1：

(1)细胞培养中含氢培养基的制备

1，将镁棒高压灭菌后，放置于细胞培养基中，两天后培养基中氢浓度达到饱和，可供使用。

2，使用电解水产生的100％体积比纯氢气通入培养基中一定时间(50ml30min)，此时培养基中氢浓度达到饱和，可供使用。

(2)动物脑胶质瘤模型中氢组的处理

1，呼吸氢气组动物模型中，通过电解水产生氢气，将含有60％体积比的氢气和空气混合气体通入动物培养箱中，供动物呼吸。

2，饮用富氢水动物模型中，实验动物饮用含有饱和浓度氢分子的富氢水。富氢水制备通过电解水产生氢气高压灌入普通饮用水中密封保存。

(3)颅内原位胶质瘤成瘤模型处理比较

八周龄雄性wistar大鼠(170-180g)正常喂养一周。水合氯醛麻醉后，使用立体定位仪将培养的c6细胞注入大鼠脑部尾状核区，具体位置为x＝3.5mm,y＝0.5mm,z＝-5.0mm。开颅后，c6细胞悬液以1μl/min的流量注入大鼠，细胞悬液体积为10μl注入细胞数量为4.8x106个每只大鼠。实验后，大鼠随机分为三组包括正常培养组、富氢水组和呼吸氢气组，富氢水组和呼吸氢气组采用(2)的方法，正常培养组、富氢水组和呼吸氢气组的效果图，见附图1。

(4)肿瘤干细胞球形成

1，肿瘤细胞消化后离心收集。

2，pbs缓冲液重悬细胞，计数后，加入1.5×10⁴个细胞至5ml肿瘤干细胞培养基(分别采用含氢培养基和普通不含氢培养基进行比较，含氢的培养基制备见步骤(1)，肿瘤干细胞培养基使用dmem/f12，其中加入20ng/mlegf,20ng/mlbfgf和50xb27。

3，细胞培养14天后，形成肿瘤干细胞球，见附图2。

(5)细胞流式检测肿瘤细胞cd133的表达

1，取按照步骤(4)中形成的氢气和对照组处理的胶质瘤细胞球，吹散后成单细胞悬液，按4×10⁵个每管分装。

2，pbs洗一次，300g离心10min；弃上清。

3，100μlpbs重悬细胞，加入一抗cd133-fitc(biobyt1：200)，设一管为直标抗体pe-isotype空白对照，一管为直标抗体fitc-isotype空白对照，4℃摇床，避光反应40min。

4，pbs清洗3次，每次300g离心10min，1％多聚甲醛固定，4℃放置，流式细胞仪检测，见附图3。

(6)细胞免疫荧光检测

1，细胞增殖至70％时，消化离心，重悬细胞计数后，取1×105个细胞接种至24孔细胞培养板中，正常贴壁培养24小时后，分别更换含氢培养基和普通不含氢培养基培养，含氢的培养基制备见步骤(1)。

2，取贴壁培养的肿瘤细胞，吸出培养基，用pbs洗三次，洗时注意不可吹打细胞，加入4％多聚甲醛固定15min；

3，吸出固定液，用pbs洗3次，每次5min，0.1％triton室温破膜10分钟，pbs洗3次，每次5min；

4，10％山羊血清室温封闭30min；

5，吸出封闭血清，不需要洗，直接加入一抗：兔抗人cd133((biobyt1：200)，gfap(sab1:200)阴性对照只加pbs，于4℃冰箱孵育过夜；

6，pbs清洗3次后加入罗丹明标记羊抗兔二抗或fitc标记的羊抗小鼠二抗，于室温孵育1h，pbs清洗3次；

7，最后标记dapi，室温孵育20min，pbs清洗后在荧光显微镜下观察、拍照，见附图4。

(7)matrigel侵袭实验

1，制备侵袭小室：matrigel胶在常温下很快会凝固，因此，将其从-20℃取出后置于4℃融解，且整个过程都置于冰上操作。用无血清培养基稀释(1：5～1：8)后，取400μl铺到transwell膜上，将transwell小室放在6孔板中，于37℃孵箱放置3h使其凝固。

2，接种细胞：实验用细胞消化离心后，氢气组和对照组分别用含氢无血清培养基和普通不含氢无血清培养基重悬，含氢的培养基制备见步骤(1)。在小室内加入1ml肿瘤细胞悬液，细胞数为3×10^5～6×10⁵(依肿瘤细胞侵袭能力选择合适的细胞数)。小室外，氢气组和对照组分别加入3ml含1.5％胎牛血清的含氢培养基和普通不含氢培养基。

3，培养细胞：常规培养24～48h(依肿瘤细胞侵袭能力而定)。

4，固定及染色：取出transwell小室，pbs洗一次，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，用1％结晶紫-甲醛溶液进行固定并染色20～30min，吸去染色液，然后用自来水缓慢洗去残留染色液，空气干燥。

5，镜检：在倒置显微镜下拍照，每个样品计数5个视野，计数后进行统计学分析，见附图5。