磺化聚醚醚酮在制备用于治疗骨瘤的药物中的用途及人骨替代材料的制作方法

本发明涉及一种已知物质的药物新用途，具体地涉及磺化聚醚醚酮的药物新用途。

背景技术：

磺化聚醚醚酮，英文名称是sulfonatedpoly-etheretherketone，是一种由聚醚醚酮经磺化改性得到的新型高性能热塑性工程塑料，可由两种方法制得:

1）将单体磺化之后直接聚会而得，这种方法叫直接共聚法(directpolymerization)。

2）采用磺化剂对聚醚醚酮进行磺化而得的后磺化法。由于聚醚醚酮化学品性优良，耐酸性强，普通溶剂中，能溶解或破坏它的只有浓硫酸，所以通常采用浓硫酸作磺化剂。后磺化法由于操作简便，成本低廉，是一种常用的磺化方法。

由于磺化聚醚醚酮在具备聚醚醚酮性能的同时还具有优良的性能，因此磺化聚醚醚酮作为新型高性能热塑性工程塑料而被广泛应用，如磺化聚醚醚酮所制得的膜，具有良好的热稳定性能和机械强度。

现有技术中，磺化聚醚醚酮还可以作为人骨替代材料的，如中国专利201310137210.0所公开的，通过在现有聚醚醚酮和羟基磷灰石二元复合材料中加入质量分数为2%-8%的磺化聚醚醚酮，能有效地提高人骨替代材料的生物活性，实验表明，加入的磺化聚醚醚酮本身无细胞毒性，并且得到的三组分材料与两组分材料相比，能更好地促进细胞增殖。另一方面，由于磺化聚醚醚酮与聚醚醚酮和羟基磷灰石形成良好的界面以及自身较好的机械性能，使得人骨替代材料中羟基磷灰石的含量可以适当地得到提升，聚醚醚酮-磺化聚醚醚酮-羟基磷灰石三元复合材料中羟基磷灰石的含量达到30%时仍然具有较好的机械强度，能满足人骨替代材料的要求。

技术实现要素：

本发明通过大量实验发现，磺化聚醚醚酮能抑制骨癌细胞生长，可以应用到制备治疗骨癌的药物中，并提供一种人骨替代材料，可以预防或治疗骨瘤。

本发明采用的技术方案是：

本发明首先提供一种已知物质的新用途，即磺化聚醚醚酮在制备用于治疗骨瘤的药物中的用途。

本发明还提供一种人骨替代材料,所述人骨替代材料中含有质量分数为1%-12%的磺化聚醚醚酮。

优选地，所述人骨替代材料中含有质量分数为10%的磺化聚醚醚酮。

优选地，所述人骨替代材料中含有质量分数为3%-5%的磺化聚醚醚酮。

本发明的有益效果是：本发明提供了磺化聚醚醚酮在制备用于治疗骨瘤的药物中的用途，使得磺化聚醚醚酮能应用于人骨替代材料中，并达到预防或治疗骨瘤的有益效果。

附图说明

图1为ha和pes及其复合材料的红外吸收图谱。

图2为peek和speek对细胞抑制率的影响比较图。

图3为peek和speek对细胞mda水平的影响的比较图。

具体实施方式

下面，结合具体实施例对本发明进行详细描述。

实施例1：磺化聚醚醚酮抑制骨瘤细胞生长的实验

实验目的：测定ha，peek和speek三种材料对mg-63细胞和u2os细胞生长的影响

原理：od值表示被检测物吸收掉的光密度，活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的mtt还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜（formazan）并沉积在活细胞中，甲臜是一类两个偶氮基连在同一个碳原子上的特殊染料，在570nm或490nm波长处有最大共振吸收，在一定细胞数范围内，mtt结晶物形成的量经酶标仪测得的od值与活性细胞数成正比，因此可间接反映活细胞数量和活性。

具体步骤：用含有10%小牛血清的rpmi1640培养基培养mg-63细胞和u2os细胞。待细胞生长至对数生长期时（细胞汇合度约为80%），弃去原培养液，加入3mlpbs清洗细胞两次。倒掉pbs，加入1ml浓度为0.25%的胰酶溶液消化贴壁细胞，吹打瓶壁上的细胞，直至细胞分散成为单个细胞，加入3ml新鲜培养液，吹打分散均匀，细胞板计数，将细胞液配制成7种不同浓度(0.5×104~3.5×104个/ml)细胞悬浮液，并依次加入96孔培养(100μl/孔)。置于37℃、5%的co2培养箱中培养72h，再加入5mg/mlmtt(20μl/孔)继续培养4h。弃掉培养液，用0.1mmol/l的pbs液清洗后，用胰蛋白酶消化细胞，加入dmso(150μl/孔)室温下孵育15～20min，用酶联检测仪，测其570nm处光密度（opticaldensity，od）值。

实验结果：比较ha，peek和speek材料对mg-63细胞、u2os细胞抑制率的影响发现，ha对两种细胞增殖抑制率均较低，peek材料对mg-63细胞和u2os细胞抑制作用高于ha，speek材料对u2os细胞增殖有明显的抑制作用，对mg-63细胞抑制作用不明显，ha、peek和speek对细胞抑制率的影响比较图见附图1。

实施例2：磺化聚醚醚酮的细胞粘附率实验

实验目的：细胞在材料表面的粘附是细胞能否在材料表面增殖生长的基础。细胞粘附率可以用来评价材料生物相容性，测定peek和speek两种材料对mg-63细胞和u2os细胞黏附率的影响

原理：粘附率=粘附细胞数/总细胞数×100%。

具体步骤：将peek和speek两种材料分别制备成5mm×2mm圆柱体模压材料，经过高温高压灭菌后，置于12孔细胞培养板中，将细胞浓度为3.5×104个/ml（初始接种浓度）的mg-63细胞和u2os细胞悬浮液1ml/孔分别滴加到材料上。于37℃、体积分数为5％co2及饱和湿度条件下培养，培养箱中复合培养6h后，pbs冲洗，去除未粘附的细胞。用0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞并记数，计算细胞粘附率。

实验结果：细胞粘附率显示，peek和speek对于细胞mg-63和u2os粘附率影响较小，peek通过磺酸化改性后对细胞u2os的粘附作用增强，peek和speek对细胞抑制率的影响比较图见附图2。

实施例3：磺化聚醚醚酮对细胞周期的影响实验

实验目的：细胞增殖与细胞周期关系密切，细胞增殖调节最终发生在细胞周期水平上，测定peek和speek两种材料对mg-63细胞和u2os细胞周期的影响，

实验原理：细胞周期由g0期、g1期、s期、g2期和m期，其中g0/g1期细胞比例代表了细胞群体中处于静止状态的细胞数，反映了细胞增殖状况；s期和g2/m期反映细胞增殖活跃程度。碘化丙啶（pi）是一种双链dna的荧光染料，与双链dna结合后可以产生荧光，荧光强度和双链dna的含量成正比。细胞内的dna被碘化丙啶染色后，可以用流式细胞仪对细胞进行dna含量测定，然后根据dna含量的分布情况，可以进行细胞周期分析

实验步骤：在12孔板中分别加入经灭菌的模压材料，将处于对数生长期的mg-63细胞和u2os细胞配制成2×105个/ml的细胞悬浮液，滴加在材料上，培养24h后，取出材料，pbs清洗材料2次，用胰酶消化细胞，收集单细胞悬浮液于ep管中，2000rpm左右离心3-5分钟，沉淀细胞，吸弃上清液，加入1ml预冷的pbs，重悬细细胞，离心沉淀细胞，小心吸除上清，轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。加入1ml冰浴预冷的70%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定24小时。2000rpm左右离心3-5分钟，沉淀细胞，每管加入配制好的染色液0.5ml（按试剂盒要求配制），37℃避光温浴30分钟，上机采用流式细胞术(fcm)检测mg-63细胞周期分布。

peek和speek对细胞周期的影响见表1

表1：peek和speek对细胞周期的影响

实验结果：细胞增殖与细胞周期关系密切，细胞增殖调节最终发生在细胞周期水平上，细胞周期由g0期、g1期、s期、g2期和m期构成，其中g0/g1期细胞比例代表细胞群体中处于静止状态的细胞数，反映细胞增殖状况，g2/m期反映细胞增殖活跃程度。与ha对照组相比，peek和speek作用两种细胞后，g0/g1细胞比例降低，s期细胞比例减少，表明聚合物对细胞周期有一定的阻滞作用。speek材料对于u2os细胞影响明显，g0/g1期显著增加，g2/m期显著降低，既speek对u2os细胞周期抑制作用明显。

实施例4：磺化聚醚醚酮对细胞mda水平的影响

实验目的：测定peek和speek两种材料对对mg-63细胞和u2os细胞mda水平的影响

实验原理：当生物体产生的ros超出机体清除能力时，过量的ros就会攻击细胞膜上的磷脂侧链多不饱和脂肪酸，形成脂质过氧化物mda，导致细胞膜的流动性和通透性改变，严重则造成细胞结构破坏，影响细胞各种生命活动，引起组织或器官损伤。因此测试mda水平常常可以反映细胞氧化程度和受到材料的毒害程度。丙二醛（malondialdehyde，mda）检测：mda和硫代巴比妥酸(thiobarbituricacid,tba)反应可产生红色产物的显色反应，产物在535nm处有最大吸收值，因此可对细胞中mda进行定量检测。

实验步骤：取对数生长期mg-63细胞和u2os细胞，配制成2×104个/ml的细胞悬浮液，分别与经灭菌的peek和speek模压材料于12孔板中培养12h、24h、36h后，取出材料，pbs清洗材料2次，用0.5ml胰酶消化细胞，收集单细胞悬浮液于试管中，试剂加入按照试剂盒规范依次进行。轻轻混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴（或用锅开盖煮沸40分钟），取出后流水冷却，然后3500～4000rpm离心10分钟，取上清液，可见光分光光度计535nm处，1cm光径，双蒸水调零，测各样品吸光度值。

实验结果：peek和speek对细胞mda水平的影响的比较图参看附图3，氧化应激机理研究发现mda水平与peek及其官能团变化（化学修饰）有关，在peek材料中，mg-63细胞mda水平比u2os高，该材料对mg-63细胞脂质过氧化程度高。在speek材料中，mg-63细胞脂质过氧化水平较低，u2os细胞脂质过氧化水平较高。这些数据表明speek可以促进u2os细胞发生脂质过氧化，导致细胞氧化损伤。一些官能团（例如磺酸基）不仅可以改变该材料的表面性能如张力，而且可以增加活性或惰性基团含量达到增强复合材料界面的作用，经过引入官能团这种化学结构的变化能够调节细胞粘附，增殖以及周期，从而实现官能团调节细胞活性的作用。通过对peek结构进行化学修饰（砜基，胺基，酰胺基等），筛选具有抑制骨瘤细胞生长同时保证成骨细胞和成纤细胞正常生长的官能团类型，为研究聚合物官能团对细胞活性的调节作用提供了新方法。这种方法在聚合物基体中通过化学键引入官能团，材料稳定性好，对细胞活性的作用持续，是合成载药骨科材料的新思路。经过化学修饰的peek通过偶联反应键接到纳米材料表面，使其在加入聚合物基体后能均匀分散，可以有效的改变peek与ha复合的界面性质；在聚醚醚酮合成过程中加入经过化学修饰peek和羟基磷灰石，形成ha与peek在一些程度上的化学结合和分子水平混合的复合材料。这些前期工作成果支持本课题提出的在聚合物化学结构中引入有效官能团调节细胞活性的新方法，有望发展制备具备抗肿瘤特性的新型peek/ha生物骨科材料的新技术，制备出力学性能和生物相容性优良的三维网状结构的peek/ha骨骼替代材料。

细胞内外环境等多种因素综合影响细胞的粘附、迁移、增殖、凋亡和坏死等生物学行为和损伤机理，因此细胞在生物材料上的表现形式会受到材料物理性质、表面化学性质、表面形貌和化学成分等多种因素的影响。材料化学改性，尤其是化学功能团修饰材料的基础研究，提供单一表面化学特性对细胞生物学行为的影响，避免多种综合因素的交叉影响。目前对破骨细胞、人成纤维细胞、间充质干细胞、神经干细胞等正常组织细胞的基础研究日趋活跃，发现部分化学功能团有抑制乳腺癌细胞、肝癌细胞粘附、增殖的作用，不同的化学功能团对细胞的不同生物学特性的影响不一样，且对不同细胞类型的影响也不一样，有的功能团具有明显的抑制肿瘤细胞生长的作用，反之也有化学功能团促进肿瘤细胞生长。甲基、氨基、羧基和羟基等化学功能团的研究显示化学功能团亲水特性对骨肉瘤细胞的粘附性能存在影响，进而影响细胞增殖及凋亡等生物学行为。生物材料表面化学特性对骨肉瘤细胞的生长会产生影响，不同的化学功能团会有不同的作用。氨基和羧基功能团虽然能够促进骨肉瘤细胞的凋亡，但也有较强的促粘附、增殖作用；羟基功能团不仅诱导骨肉瘤细胞的凋亡率低，而且还促进其粘附、增殖；而甲基功能团具有一致的抑制骨肉瘤细胞粘附、增殖和促进骨肉瘤细胞凋亡坏死的发生，既具有明显的抑制骨肉瘤细胞生长的能力，具有较强的抗癌作用。同时，细胞形态也有明显的变化。在羟基和羧基样品表面骨瘤细胞多呈现出椭圆形和多边形，细胞体积较大，胞浆丰富，可见较多伪足伸出，部分较大伪足相互融合，在氨基功能团样品表面的细胞多数为长梭形，甲基表面的细胞仍呈小圆形，细胞体积较小。在氨基、羧基、羟基样品表面均可见细胞数量增多，体积增大，可见大椭圆形、梭形及多边形细胞，而在甲基样品表面细胞呈圆形或椭圆形，梭形、不规则形细胞较少。采用磺化peek研究该材料在不同组分条件下的生物活性/细胞毒性，使材料力学性和生物活性具有定向调控作用增强。实验表明磺化peek在一定程度上抑制骨瘤细胞生长，同时成骨细胞和成纤细胞正常生长。

实施例5：人骨替代材料的制备

人骨替代材料的制备方法可参考如下实施例：

（1）通过原位聚合法合成含有质量分数为10%的peek以及10%ha的复合材料。一段时间后，趁热迅速倾倒至常温蒸馏水中凝结分散，得灰白色块状固体。产物经粉碎机捣碎后呈粉末状，用丙酮和蒸馏水多次反复抽提、过滤，以除去未反应的单体、溶剂和盐类杂质。在电热恒温鼓风干燥箱中100℃烘干12小时以上，最终得灰白色粉末产品。

（2）采用磺化剂，制备磺化聚醚醚酮。

（3）将peek/ha复合材料与speek物理按比例混合，制备speek的质量分数分别3%、5%和10%的人骨替代材料。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。