一种鼻腔纳米制剂葛根素液晶纳米粒及其制备方法与流程

本发明涉及一种药物制剂及其制备方法，特别涉及葛根素立方液晶纳米粒及其制备方法。

背景技术：

葛根素为常用中药葛根的主要药效成分，治疗缺血性脑中风疗效确切，药理作用广泛。多项临床实验显示，葛根素能够有效的降低中风患者的血浆内皮素、同型半光氨酸、氧化低密度脂蛋白的水平；具有改善患者神经功能、提高日常生活能力的作用。但由于葛根素为异黄酮碳苷，溶解度低，口服给药绝对生物利用度仅为3.77％，caco-2、mdck细胞转运实验进一步显示，其表观渗透系数papp仅为1×10^-7，细胞吸收和黏膜渗透性较差。另外，临床多采用注射给药进行治疗。动物实验显示，静脉注射给药，脑靶向性极差，靶向指数te不到2％。为葛根素寻求一种安全性高、顺应性好、能够迅速发挥药效的给药途径，和增加葛根素溶解性和渗透性给药剂型具有重要的临床价值。

目前，在中、西医两方面领域中，鼻腔给药制剂均已被广泛认为是一种能够实现快速递药、直达脑部的新型给药系统。有实验表明葛根素经鼻给药后，嗅球部位药物峰浓度(cmax)和生物利用度(aucbrain)显著高于静脉注射组(分别为静脉注射组的1.72倍和3.05倍)，半衰期和平均滞留时间均显著延长，脑靶向指数高达14％，是静脉注射组的7.5倍。可见，葛根素以鼻腔给药形式治疗脑部疾病具有良好前景。

液晶是一种独立的物质状态，处于该状态的物质具有像液体一样的流动性和连续性，同时具有晶体的各向异性。与脂质体相比，液晶的载体材料更为稳定，不易发生氧化或被酶解，能够为药物提供稳定的“内环境”；并且其内部具有独特的双水道结构和更大的双分子层面积，可通过将水溶性药物(如四环素、头孢唑啉、胰岛素等)包封于水道之中，脂溶性药物(如维生素e等)包裹于脂质双分子层中，实现对不同极性药物的增溶。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高葛根素在包封率高、利用度高、细胞吸收和黏膜渗透性较好的脂质立方液晶纳米粒鼻用制剂及其制备方法。

实现上述目的的技术方案如下。

本发明葛根素液晶纳米粒，其原料组成如下(以重量份计；)：

本发明葛根素液晶纳米粒，其原料组成优选为(以重量份计)：

本发明鼻腔缓释制剂葛根素液晶纳米粒制备方法如下：

(1)取单油酸甘油酯、泊洛沙姆407、维生素e醋酸酯，加入溶剂无水乙醇，40-65℃热水浴下溶解，减压回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均匀分散在圆底烧瓶内壁；

(2)将促渗剂材料甘油加入蒸馏水中至混合溶解得到3-7％甘油-水，加入配方量的葛根素溶解；

(3)将水相(2)加入油相，在热水浴中，常压条件下旋转混合至均匀。

(4)将(3)液体超声得到色泽均一无分层的乳白色液体。

本发明鼻腔缓释制剂葛根素液晶纳米粒制备方法优选为：

(1)取单油酸甘油酯、泊洛沙姆407、维生素e醋酸酯，加入溶剂无水乙醇，55℃热水浴下溶解，减压回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均匀分散在圆底烧瓶内壁；

(2)将促渗剂材料甘油加入蒸馏水中至混合溶解得到5％甘油-水，加入配方量的葛根素溶解；

(3)将水相(2)加入油相，在热水浴中，常压条件下旋转混合至均匀。

(4)将(3)液体超声得到色泽均一无分层的乳白色液体。

附图说明

图1是液晶纳米粒的外观图

图2是葛根素液晶液晶纳米粒投射电镜图

图3是葛根素液晶液晶纳米粒偏光显微镜图(a为溶剂，b为葛根素液晶纳米粒)

图4是葛根素液晶液晶纳米粒粒径、电位分布图(a为电位，b为粒径半径)

图5是葛根素液晶液晶纳米粒体外释放曲线图

本发明涉及采用脂质立方液晶作为药物载体包封葛根素制备成葛根素脂质立方液晶纳米粒，运用偏光显微镜证明液晶的存在，投射电镜下外观完整，形态明显；电位为﹣37.47±1.550mv，粒径半径为94.62±3.18nm。该方法制备出的制剂包封率高，稳定性好，体外释放较葛根素水溶液缓慢，细胞透过率均较葛根素溶液高。证明液晶纳米粒可作为葛根素的给药剂型，增加其溶解性和细胞渗透性，下列实验例(实验样本用实施例1制备)进一步说明本发明。

实验例1葛根素液晶纳米粒的偏光效应

溶剂5％甘油-水、液晶纳米粒滴加于载玻片，用盖玻片盖住，偏光显微镜下观察液晶纳米粒状态。与空白溶液相比(图3a),液晶纳米粒在偏光显微镜下可见折射光(图3b)，可判断有液晶存在。

实验例2葛根素液晶纳米粒粒径、电位分布

取空白纳米粒和液晶载药纳米粒于样品池中，用激光粒度分析仪测、贝克曼电位测定其粒径、电位分布情况，测量三次。测定结果分散性良好，粒径半径为94.62±3.18nm，电位为﹣37.47±1.550。粒径、电位分布图分别见图4(a)，4(b)。

实验例3葛根素液晶纳米粒体外释放情况考察

取实施案例1的液晶纳米粒，采用透析袋法进行体外释放特性实验考察。释放介质为水。具体实验步骤为：将1ml液晶纳米粒、5mg/ml葛根素水溶液。样品用注射器加入透析袋(截留分子量8000-10000)中，两头用夹子夹住。接受介质为水，t＝37℃，转速为300r/min，分别于0.5，1，2，3，4，5，6，8，10，12h，24h取样1ml，每次再补入1ml相同条件下的水。取出的样过0.22μm微孔滤膜，hplc测定葛根素浓度。计算各时间点的累计释放率(q)。

q＝(cn+∑civi)/q0×100％

式中q0为接受池葛根素总量；cn为第n次取样实测质量浓度，vi为第i次取样体积，ci为第i次取样实测质量浓度。

实验结果显示(图5)葛根素水溶液释放速度快，于2h基本释放完全。葛根素液晶纳米粒释放缓慢，于6小时释放率达90％。提示葛根素被液晶纳米粒装载之后，可延缓药物释放，具有一定包裹性。

实验例4葛根素液晶纳米粒mdck-mdr1细胞毒性

mdck-mdr1其许多生理特性均与血脑屏障(blood-brainbarrier,bbb)相似，常用于体外药物透过bbb的筛选模型。选用体外血脑屏障细胞模型mdck-mdr1对葛根素液晶纳米粒在脑部的吸收进行研究，并且通过比较葛根素和葛根素液晶纳米粒细胞转运参数，从细胞和分子水平阐明立方液晶纳米粒促葛根素进在脑部的吸收。在进行转运实验之前，首先通过mtt实验考察葛根素液晶纳米粒的安全给药浓度。具体实验方法如下：

(1)常规条件下分别培养mdck-mdr1细胞至70-80％汇合时，用0.25％胰蛋白酶(0.02％edta)消化细胞，以dmem培养基(含10％胎牛血清)终止消化，用移液器轻轻吹打后，将细胞悬液转移到15ml离心管中，800r·min^-1离心5min，弃去上清液，再加入新鲜的dmem高糖培养基(含10％胎牛血清、100u·ml^-1青霉素和100μg·ml^-1链霉素)，制得单个细胞悬液，将细胞密度调整为5×10⁴个/ml，将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，边缘孔用无菌pbs填充。

(2)将96孔细胞培养板放入co2培养箱，在37℃、5％co2及饱和湿度条件下培养24h，至细胞贴壁生长。

(3)设置pue-lcn给药浓度为稀释5倍、稀释10倍、稀释12.5倍、稀释20倍、稀释25倍、稀释50倍，培养24h。

(4)每孔加入mtt溶液20μl，37℃孵育4h，弃去孔内培养上清液，每孔加入150μldmso，振荡10min，使mtt充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度，记录结果。结果见下表。实验数据以存活率表示，采用sas9.0统计分析，组间数据差异采用t检验进行检验，^*p<0.05表示具有统计学显著性差异。

实验结果表明，当液晶纳米粒稀释25倍(约200μg/ml)以下时对两种细胞无毒性，可以作为药物转运浓度。

表1不同稀释倍数pue-lcn的mdck-mdr1细胞毒性研究结果(n＝3)

实验例5葛根素液晶纳米粒跨膜转运研究实验

具体操作如下：

(1)培养mdck-mdr1细胞至70-80％汇合时，用0.25％胰蛋白酶(含0.02％edta)消化，并以dmem培养基(含10％胎牛血清)终止消化反应，用移液器轻轻吹打细胞，将细胞悬液混匀后转移入15ml离心管中，以800r·min^-1离心5min，之后弃去上清液，重新加入新鲜的培养基(培养基；mdck-mdr1细胞加入dmem培养基(含10％胎牛血清))，制得单细胞悬液，调整密度，接种于transwell聚碳酸酯12孔板(1.12cm²，0.4μm)上侧细胞培养池。在常规条件下培养，顶侧室0.5ml，基底侧室加入1.5ml。在transwell板中培养细胞，隔天更换两侧细胞室的培养液，每天观察细胞表面形态和生长状态，同时使用细胞电阻仪测定细胞单层膜电阻(transepithelialelecteicalresistance,teer),当电阻在250-350ω·cm2，表明其具有足够得紧密链接和完整性，可用来进行药物吸收和机制研究。

(2)分别从ap-bl、bl-ap两个方向考察葛根素、葛根素液晶纳米粒的细胞转运情况。实验前将单层细胞用hbss缓冲液小心清洗三次，然后加入37℃hbss缓冲液(ph7.2)孵育20min。

ap-bl方向：取浓度为200μg/ml的葛根素hbss缓冲液0.5ml，加入ap侧作为供给池；同时取空白hbss缓冲液1.5ml，加入bl侧，作为接受池。

bl-ap方向：取稀释25倍的葛根素液晶纳米粒hbss缓冲液1.5ml，加入bl侧作为供给池；同时取空白hbss缓冲液0.5ml，加入ap侧，作为接受池。

在30、60、90、120、150、180min时，从接受室中取样，随机加入相同体积的新鲜截至，ap-bl方向取样600μl，bl-ap方向取样200μl，hplc法测葛根素含量，计算表观渗透系数(papp)和外排率er。

式中dq/dt为药物转运速率；a为聚碳酸脂膜面积；c为葛根素在供给池中的初始浓度。

papp(bl→ap)为基底侧到细胞顶侧的表观渗透系数；papp(bl→ap)为细胞顶侧到基底侧的表观渗透系数。实验数据以n＝3表示，采用sas9.0统计分析，组件数据差异比较采用两个独立样本t检验，^*p<0.05差异有统计学意义。实验结果见表2。

表2.pue和pue-lcn在mdck-mdr1单层膜上的转运影响

液晶纳米粒包封的葛根素纳米粒稀释25倍(约200μg/ml)后，葛根素在吸收方向的papp为1.333±0.1321×10-6cm·s^-1，外排papp为1.670±0.0944×10-6cm·s^-1，与相同浓度的葛根素相比分别提高了13.74％和25.93％，提示液晶纳米粒可以促进葛根素透过血脑屏障细胞，具有促进葛根素脑部吸收的作用。

实验例6葛根素液晶纳米粒宏观、微观形体观察

制备得到pue-lcn外观呈乳白色，稳定性良好，分散均匀，无沉淀(图1)。

通过投射电镜可对液晶纳米粒微观形态进行观察。用1ml注射器吸取适量pue-lcn，分次滴加在覆盖碳膜的铜网上，自然干燥后投射电镜下观察立方液晶纳米粒在水中分散程度良好，形态结构完整，分散均匀，结果见图1。

具体实施方式

实施例1

本实施例所述葛根素脂质立方液晶纳米粒的组成和制法如下：

原料组成为单油酸甘油酯(gmo)，泊洛沙姆407(f127)，5％甘油-水溶液，葛根素，维生素e醋酸酯的配方用量如下：

(1)制备配方量总量为100g。取单油酸甘油酯2g、泊洛沙姆4072.13g、维生素e醋酸酯1g，加入溶剂100ml无水乙醇，55℃热水浴下溶解，减压回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均匀分散在圆底烧瓶内壁；

(2)将促渗剂材料甘油加入蒸馏水中至混合溶解得到5％甘油-水，加入0.5g的葛根素热水浴溶解并加至100g；

(3)将水相加入油相，加入玻璃珠，在55℃，90r/min条件下旋转混合至均匀。

(4)将上述液体探头超声3min(超声4s，间隔3)，得到色泽均一无分层的乳白色液体。

实施例2

原料组成为单油酸甘油酯(gmo)，泊洛沙姆407(f127)，5％甘油-水溶液，葛根素，维生素e醋酸酯的配方用量如下：

(1)制备配方量总量为100g。取单油酸甘油酯4.5g、泊洛沙姆4075g、维生素e醋酸酯1g，加入溶剂100ml无水乙醇，55℃热水浴下溶解，减压回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均匀分散在圆底烧瓶内壁；

(2)将促渗剂材料甘油加入蒸馏水中至混合溶解得到5％甘油-水，加入0.3g的葛根素热水浴溶解并加至100g；

(3)将水相加入油相，加入玻璃珠，在60℃，70r/min条件下旋转混合至均匀。

(4)将上述液体探头超声5min(超声4s，间隔3s)，得到色泽均一无分层的乳白色液体。

实施例3

原料组成为单油酸甘油酯(gmo)，泊洛沙姆407(f127)，5％甘油-水溶液，葛根素，维生素e醋酸酯的配方用量如下：

(1)制备配方量总量为100g。取单油酸甘油酯4.5g、泊洛沙姆4071g、维生素e醋酸酯5g，加入溶剂100ml无水乙醇，55℃热水浴下溶解，减压回收乙醇，得到均一油相，呈薄膜均匀分散在圆底烧瓶内壁；

(2)将促渗剂材料甘油加入蒸馏水中至混合溶解得到5％甘油-水，加入0.4g的葛根素热水浴溶解并加至100g；

(3)将水相加入油相，加入玻璃珠，在60℃，110r/min条件下旋转混合至均匀。

(4)将上述液体探头超声7min(超声4s，间隔3s)，得到色泽均一无分层的乳白色液体。