一种硬膜生物补片及其制备方法与流程

本发明属于生物医用材料领域，具体地，涉及一种用于硬膜缺损修复的生物补片及其制备方法。

背景技术：

硬膜是保护脑（脊髓）组织和防止脑脊液渗漏的一道重要屏障。硬膜缺损在神经外科临床上颇为常见，创伤、肿瘤侵蚀、炎症破坏、先天性疾病及颅脑手术、脊髓手术等均可造成硬膜缺损，进而导致脑脊液渗漏、皮下积血/积液、切口延迂不愈、颅内感染、脑组织膨出、癫痫等并发症。因而，长期以来，通过手术修补硬膜，保持硬膜的完整，保护脑（脊髓）组织，防止脑脊液渗漏，已成为神经外科界的共识。传统的硬脑膜重建材料主要取自自体组织，材料来源有限，并加重患者的痛苦，近年来人工硬脑膜修补材料已被广泛接受。

目前，国内外已有多种人工硬膜材料进入临床应用，大致可分为3类：人工合成材料、同种异体材料和异种生物材料。

人工合成材料，包括不可吸收合成材料和可吸收合成材料。不可吸收的人工合成材料对接受移植的宿主永远是异物，植入后可导致慢性炎症反应、疤痕或包裹反应、机械压迫、迟发性出血、术腔感染等问题。可吸收的人工合成材料，存在脑适应性差，与脑组织接触处有慢性纤维化，降解产物易导致炎症和粘连反应等缺点。

同种异体材料，包括异体人硬脑膜、阔筋膜，无细胞人体真皮等。这类材料经多种技术手段处理灭活，组织相容性好。但是存在一些难以解决的问题，如可能传播宿主疾病、来源局限、价格昂贵、伦理问题，以及组织间隙大，易导致脑脊液渗漏等，限制了其应用。

异种生物材料，常见来源有牛腱、牛/猪心包、牛/猪的腹/胸膜及猪小肠粘膜下层等，这些动物组织去除细胞成分以及免疫原性之后，所得到的细胞外基质成分，可以开发出理想的硬膜生物修补材料，但不同来源的产品都各有优缺点。

由牛腱提取的胶原膜可用于硬膜缺损修补，国内已有数个此类产品上市，但此类材料用于硬膜修补存在如下缺点：降解速率过快，组织未长成之前材料已降解；韧性较差，容易破裂；粘附力不够强，脑脊液可从贴敷周边的缝隙中渗出，形成积液；贴敷到缺损部位时被组织液浸润后，无法调整位置，对使用者经验要求较高。

来自于牛/猪心包、牛/猪腹膜或胸膜的硬膜补片产品具有力学强度高，致密性好等优点。但其加工过程多需经环氧化物或戊二醛等化学剂处理，存在以下缺点：有潜在的细胞毒性；使用前需反复清洗以去除化学残留物；降解速率较慢，与组织再生不匹配，可导致纤维化、慢性炎症反应、与颅骨或脑组织粘连等并发症；质地硬，无法与脑组织表面完美贴合，必须严密缝合。

在异种生物材料中，小肠粘膜下层(smallintestinalsubmucosa,sis)来源的脱细胞基质是目前学术界公认的最理想的组织修复材料之一。sis基质材料具有以下优点：韧性好，克服了牛腱来源提取制得的胶原膜韧性不够的缺点；无需环氧化物或戊二醛交联，避免了交联剂的潜在细胞毒性；材质柔软，可与脑组织表面完美贴合；可诱导组织生长，组织生长与材料降解同步，吸收完全，组织再生塑性完美。另外，sis中还含有多种生长因子，可以为组织再生创造合适的微环境，即使经过脱细胞处理的sis仍含有这些生长因子，如fgf-2和tgf-β。这些生长因子在组织的修复和重构中有着重要的促进作用，这是其它细胞外基质材料和人工聚合物(如胶原、壳聚糖、聚乳酸和聚羟基乙酸)所不能比拟的。

sis基质材料作为一种理想的硬膜替代材料，目前国内以该种材料的硬膜补片仅有一家进口产品——美国cookbiotechincorporated生产的生物硬脑膜修补片（商品名：biodesignsurgisis）。该产品在欧美国家已占据10～30％的生物硬脑膜片市场，进入我国市场已近10年。但是surgisis的生产工艺（cn102176929b）仅进行sds清洁剂、过氧乙酸、异丙醇和碱溶液等处理步骤，虽然考虑了消毒、脱脂等步骤，但未针对性地采用去免疫原性物质工艺，导致了细胞残留量、dna含量过高，例如surgisis系列产品中的oasis^tm的dna含量为0.42ng/mg（gilberttw,etc,quantificationofdnainbiologicscaffoldmaterials.jsurgres2009,152(1):135–139.），而且对存在于细胞外基质中的天然抗原成分——α-gal抗原也未考虑。

近年来，国内一些厂家对sis产品的制备进行了深入研究。发明专利cn103272275b采用近交系动物小肠粘膜下层组织为原料保证了不同批次产品的稳定性和统一性，以机械振荡与超声波振荡工艺去除残留dna，克服了biodesignsurgisis产品dna残留量较多的问题，该专利产品的dna残留量为120±15pg/g，明显低于biodesignsurgisisdna残留量的250±45pg/g，但是该专利的脱细胞和脱脂过程仅采用低浓度的碱溶液在较短时间内处理，脱细胞和脱脂效果欠佳，并且也未涉及去除α-gal抗原的工艺。发明专利cn101366975b和cn101366979b对sis材料采用了过氧乙酸消毒、碱溶液脱细胞、dna酶和α-半乳糖苷酶处理的工艺，虽然考虑了去除免疫原性物质dna和α-gal抗原，但其脱细胞和脱脂工艺仅为短时间的碱溶液处理，效果欠佳。发明专利cn103405811b对sis材质的处理虽然包括了消毒、胰蛋白酶、dna酶和α-半乳糖苷酶处理等步骤，但是未涉及脱脂工艺。发明专利cn101433735b对sis材料虽然采用了“过氧乙酸+乙醇”消毒、有机溶剂脱脂、“高渗处理+胰蛋白酶处理+酸处理+碱处理”脱细胞以及表面活性剂去垢等工艺，但是该工艺中使用毒性较强的有机溶剂脱脂，若有机溶剂去除不彻底，可有导致组织毒性反应的潜在风险；该工艺中胰蛋白酶浓度过高且处理时间过长，可能会破坏细胞外基质结构；而且此发明工艺并未涉及去除dna和α-gal抗原的步骤。

综上所述，目前sis制备过程尚未有一种能完整地考虑去除残留细胞、脂质、dna和α-gal抗原等免疫原性物质的工艺，可引起产品免疫原性物质含量过高，易导致植入体内后发生免疫毒性反应。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有硬膜生物补片制备技术的不足，提供一种使用sis制备、免疫原物质含量低、能保留天然细胞外基质三维结构的硬膜生物补片及其制备方法。

为了实现本发明的目的，本发明使用sis制备硬膜生物补片的制备方法，采用了预处理、消毒、脱脂、脱细胞、去dna、去α-gal抗原、冷冻干燥和灭菌等工艺处理。

上述硬膜生物补片的制备方法，具体步骤如下：

下面步骤中，除特别说明之外，sis材料与溶液的比例均在1:5~1:20（v/v）之间。

（1）预处理

取新鲜屠宰动物的猪小肠组织清洗洁净，置于0.01%~0.5%醋酸溶液浸泡10~120min，去腥，使用物理刮除法除去猪小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层，切成片段，使用纯化水冲洗至少3遍。

（2）消毒

使用浓度为0.5～1.5％的过氧乙酸和浓度为15～25％的乙醇的混合水溶液，超声条件下，室温浸泡30~120min，进行消毒。之后使用纯化水超声清洗至少3遍。

（3）脱脂

使用浓度为90-100%的乙醇，超声条件下，常温浸泡0.5-12h。之后使用纯化水超声清洗至少3遍。

（4）脱细胞、去dna和去α-gal抗原

使用含0.01～0.10％胰蛋白酶和含0.01～0.05%edta的混合水溶液，超声条件下，于36±2℃条件下浸泡15-40min。之后使用pbs超声清洗至少3遍；

使用含0.05～10u/mldna酶的水溶液，超声条件下，于36±2℃条件下浸泡15-40min。之后使用pbs漂超声清洗至少3遍；

使用含0.05～10u/mlα-半乳糖苷酶的水溶液，超声条件下，于20-37℃条件下浸泡15-40min。之后使用pbs超声清洗至少3遍；

使用浓度为5-40mm的naoh水溶液，超声条件下，常温浸泡20-60min。之后使用pbs超声清洗直至中性。

（5）冻干、灭菌

将sis片材3～12层叠加，固定于模具上，冷冻干燥后，裁剪成临床使用所需规格，采用pet包装袋进行包装，最后进行辐照灭菌。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

采用了系统的去除免疫原性物质工艺，包括使用乙醇处理去除脂质、使用胰蛋白酶和碱溶液处理脱细胞，使用dna酶处理去除dna，使用α-半乳糖苷酶处理去除α-gal抗原等步骤。与已有类似产品相比，免疫原物质含量更低，如残留细胞量不大于1个/镜下视野（400×）、dna残留量不大于120pg/g、α-gal抗原为阴性（免疫荧光检测法）、脂质含量不大于0.1%，所以植入体内后生物相容性更好，免疫排斥反应更低，安全性更好。

本发明所使用的酶处理方法，其浓度和作用时间既能有效去除免疫原性物质又不会破坏细胞外基质正常结构，产品扫描电镜下显示胶原纤维束结构完整；阻水性检测显示具阻止液体通过作用；用于比格犬硬脑膜缺损修补时可有效防止脑脊液渗漏，且植入材料跟周围正常组织相容性好。

本发明的硬膜生物补片由3～12层单层sis构成，用于硬膜缺损修补时，短期可提供一个良好的致密性屏障以防止脑脊液渗漏；长期可作为组织支架诱导硬膜组织长入，逐渐与周围硬膜组织形成一个整体，修复缺损，防止脑脊液渗漏，同时补片逐步降解，组织再生与补片降解速度同步。

附图说明

图1所示的是本发明实施例1的样品图。

图2所示的是本发明实施例1的切片he染色图。

图3所示的是本发明实施例1的电镜扫描图。

图4所示的是本发明实施例1的用于比格犬硬脑膜修补术的组织切片图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。

实施例1

（1）预处理

取新鲜屠宰动物的猪小肠组织清洗洁净，置于0.5%醋酸溶液浸泡30min，猪小肠与醋酸溶液的比例为1:5，使用物理刮除法除去猪小肠空肠的粘膜层、肌层、浆膜层、淋巴结，分离出粘膜下层，切成片段，使用纯化水冲洗3遍。

（2）消毒

使用含有1.0％过氧乙酸和15％乙醇的混合水溶液，sis材料与混合水溶液的比例为1:10，超声条件下，室温浸泡100min，进行消毒。之后使用纯化水超声清洗3遍。

（3）脱脂

使用浓度为95%的乙醇，sis材料与乙醇的比例为1:10，超声条件下，常温浸泡2h。之后使用注射用水超声清洗3遍。

（4）脱细胞、去dna和去α-gal抗原

使用含0.02％胰蛋白酶和含0.02%edta的混合水溶液，sis材料与胰蛋白酶/edta溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡30min。之后使用pbs超声清洗3遍；

使用含5u/mldna酶的水溶液，sis材料与dna酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于37℃条件下浸泡20min。之后使用pbs漂超声清洗3遍；

使用含5u/mlα-半乳糖苷酶的水溶液，sis材料与α-半乳糖苷酶溶液的比例为1:5，超声条件下，于30℃条件下浸泡20min。之后使用pbs超声清洗3遍；

使用浓度为25mm的naoh水溶液，sis材料与naoh溶液的比例为1:20，超声条件下，常温浸泡50min。之后使用pbs超声清洗直至中性。

（5）冻干、灭菌

将sis材料4层叠加，固定于模具上，冷冻干燥，裁剪成4cm×7cm规格，采用pet包装袋进行包装，最后进行辐照灭菌。产品如图1所示。

实施例2：对实施例1制备得到的样品进行物理性能检测、化学性能检测、组织学检测、生长因子检测、生物学性能检测和动物试验。

1.物理性能检测

1）阻水性

方法：参照《yy/t0471.3-2004接触性创面敷料试验方法第3部分：阻水性》的方法进行检测。

结果：具有阻水性。

2）缝合强度

方法：用3-0非吸收缝合线在补片两边中央距边缘2mm处缝合，将缝合线另一端与样品的另一端分别固定在拉力仪两端上，以20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录最大力值。按上述方法对3批样品进行检测。

结果：缝合强度在3n~5n范围。

3）拉伸强度

方法：将样品沿两个方向分别裁剪为宽度为10mm形状；裁剪后在相对湿度40%~60%、温度22±2℃环境内放置2小时后进行试验。夹具间距为25mm，将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度拉伸，记录断裂时的最大力值。按上述方法对3批样品进行检测。

结果：拉伸强度在30n~35n范围。

4）顶破强度

方法：按照《yy0500-2004心血管植入物人工血管》8.3.3.2探头破裂强度的测量方法选取9.5mm直径探头进行检测。按上述方法对3批样品进行检测。

结果：顶破强度在85n~90n范围。

2.化学性能检测

1）酸碱度

方法：按照《gb/t14233.1医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析方法》中规定的酸碱度方法进行。

结果：检验液与空白对照液的ph值之差不超过1.5。

2）细菌内毒素

方法：按照gb/t14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法》中规定的细菌内毒素试验方法进行。

结果：细菌内毒素含量小于2.15eu/片，符合与脑脊液接触医疗器械对细菌内毒素限量的要求。

3）dna残留量

方法：依据yy/t0606.25-2014《动物源性生物材料dna残留量测定法：荧光染色法》进行检测。

结果：dna残留量为80±12pg/g。

4）α-gal抗原含量

方法：将样品用多聚甲醛固定后，常规石蜡包埋切片，片厚3微米。利用生物素标记bsi-b4与α-gal抗原的特异亲和特性进行免疫组化反应。染色结果判定：深棕黄色颗粒为强阳性（+++），棕黄色颗粒为阳性（++），黄色颗粒为弱阳性（+），未见着色为阴性（-）。

结果：为阴性（-）。

5）脂质含量

方法：参照《gb/t5009.6食品中脂肪的测定》中索氏抽提法进行测定。

结果：脂质含量为0.08%。

3.组织学检测

1）光学显微镜观察

方法：用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切成0.4微米的薄片，经二甲苯脱蜡、系列酒精脱水，苏木精—伊红染色，显微镜下观察细胞残留情况和基质纤维结构。

结果：无细胞和细胞碎片残留；胶原纤维连续，无断裂，如图2所示。

2）超微结构观察

方法：使用电子扫描镜进行扫描。

结果：材料呈多孔结构，胶原纤维无断裂，如图3所示。

4.生长因子检测

方法：将组织捣碎后使用采用ellisa法检测成纤维细胞生长因子的含量，具体操作方法详见试剂盒使用说明书。

结果：含量为9540-9937pg/g。

5.生物学性能检测

方法：参照gb/t16886系列方法进行试验。

结果：细胞毒性反应小于或等于1级；无迟发型超敏反应；皮内反应显示试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0；无致热性；无溶血反应；遗传毒性试验结果显示，鼠伤寒沙门氏菌回复突变（ames）试验呈阴性反应、小鼠淋巴瘤试验呈阴性反应、无染色体畸变性；无急性全身性毒性反应；无亚慢性全身性毒性；肌肉植入30天、60天、90天跟阴性对照品的组织反应无明显区别。

6.动物试验

方法：采用库克（cook）生物技术公司生产的生物硬脑膜修补片（注册证编号：国食药监械（进）字2014第3462661号）作为对照，应用硬膜生物补片进行beagal犬硬脑膜缺损修补术。

结果：植入3个月后，植入材料与正常硬脑膜边界不清，已融合在一起；植入材料纤维已被新生组织替代；植入材料部位与正常硬脑膜组织形态结构无明显区别，可见纤维母细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞等细胞存在，可见毛细血管生成；蛛网膜和脑组织正常。硬膜生物补片修补硬脑膜缺损3个月的组织切片如图4所示。

本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。