一种含碳纳米管的复合多孔支架及其制备方法与流程

本发明属于组织工程材料领域，特别涉及一种由壳聚糖、明胶、羟基磷灰石、碳纳米管四种材料复合、交联制备复合支架的方法。

背景技术：

感染、先天畸形、外伤、肿瘤等原因所造成的骨缺损在临床上十分常见，且治疗难度大。如何促进骨缺损部位的快速愈合，一直是骨科领域亟待解决的医学难题。传统的治疗方法包括自体骨移植、同种异体骨移植和人工骨材料替代等，但是自体骨移植来源有限且会给患者带来创伤，异体骨移植容易产生免疫排斥反应，人工骨材料存在成骨性能不确定的缺陷。随着组织工程研究的兴起，利用组织工程技术来进行骨缺损的治疗具有十分广阔的应用前景。组织工程中最重要的三个要素为种子细胞、支架材料和生物生长因子，其中支架材料是最为关键的因素。

由多种材料按照不同的比例与特性组合合成的支架材料为复合支架材料，可有效克服单一材料组分和功能单一的缺点，制备出与骨组织天然构造更加吻合、具有良好的生物相容性、骨传导性以及骨诱导性的骨组织工程支架。骨组织工程复合支架主要由壳聚糖、明胶、胶原、羟基磷灰石等天然或人工合成材料中的两种或者三种进行复合制备。壳聚糖(chitosan，简记cs)可从甲壳类动物的外壳中提取甲壳素经过脱乙酰化得到，拥有良好的生物相容性、可降解性，它能够促进生物组织细胞的吸附、增殖、分化，在骨组织工程中应用广泛。明胶(gelatin，简记gel)是一类蛋白质，它可以通过胶原部分水解得到，具有优良的生物相容性、生物活性和生物可降解性，普遍应用在临床医学、医药工业中。羟基磷灰石(hydroxyapatite，简记hap)是构成人体成骨组织主要无机成分，与人体组织之间具有其它材料所不可比拟的相容性，并非常容易与骨组织形成骨性结合，但其存在着脆性大、诱导性差等问题。这几类天然材料往往生物相容性较好，与生物体较易结合，其分解产物也容易被生物体所吸收。但天然材料的机械性能较差，存在一定缺陷。

碳纳米管(carbonnanotube，简记cnt)，是一种径向尺寸为纳米量级，轴向尺寸为微米量级，管子两端由半球形端帽封闭的新型一维量子材料，具有特殊的力学性能、电化学性能和高比表面积。如拉伸强度100～150gpa，是钢的100倍，但密度只有钢的1/6；cnt的体电导率为1000s/cm，远远大于炭黑100s/cm；cnt的比表面积大约是150～300m²/g。cnt作为一种纳米级碳材料，经研究表明也具备优良的生物相容性。因此，基于cnt特殊的力学性能、电化学性能、高比表面积和生物相容性，可以作为一种补强材料和导电材料应用在骨组织工程中，用来增加复合支架材料的机械性能和导电性，从而制备出高韧性、高强度的复合支架。专利cn103877612a“一种含碳纳米管的细胞支架及其制备方法”，该发明以聚乳酸-羟基乙酸共聚物的六氟异丙醇溶液和碳纳米管的六氟异丙醇悬浊液混合获得静电纺丝液，采用静电纺丝技术制备了三维细胞支架，该发明选用的是聚乳酸-羟基乙酸共聚物为支架主要基底材料。专利cn106668946a“一种碳纳米管/壳聚糖/胶原蛋白复合支架材料及其制备”，该方法采用壳聚糖、胶原蛋白、碳纳米管混合，采用冻干法制备三维多孔支架，但没有复合构成人体成骨组织主要无机成分-羟基磷灰石，所用交联剂为戊二醛、碳化二亚胺类或环氧烷基类，且缺少搭载细胞生长因子的研究。

基于上述研究现状，本发明在天然生物材料壳聚糖、明胶、羟基磷灰石复合的基础之上引入了碳纳米管，采用冷冻干燥法制备复合支架，并通过化学交联制备与骨组织天然构造和性能更加吻合的复合支架，通过碳纳米管的加入量调控复合支架的孔隙率、吸水率和机械性能，增强了复合支架的机械特性和电学特性，能促进接种其上的脂肪干细胞进行组织分化。

技术实现要素：

本发明的目的是针对传统复合支架生物相容相差、机械性能较低、稳定性差等问题，发明一种含碳纳米管的复合多孔支架的制备方法。该方法制造出的多孔支架材料具有生物相容性好、孔隙率高、机械强度高、成骨诱导活性、结构稳定等优点。

为了达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种含碳纳米管的复合多孔支架的制备方法，该制备方法以壳聚糖、明胶、羟基磷灰石为主要材料，添加不同比例的碳纳米管，采用冷冻干燥法制备复合支架，具体包括以下步骤：

(1)将一定量羟基磷灰石hap分散、溶解于二次蒸馏水中，搅拌30～50min至溶液成乳状，得到hap乳状溶液，其中，hap含量为1～2g/100ml。

(2)向hap乳状溶液中加入适量壳聚糖cs和明胶gel，再加入冰乙酸得到混合溶液；混合溶液于40～60℃下加热、磁力搅拌60～120min，待各物质均匀分散后，得到cs/gel/hap的混合溶液a。其中，cs含量为2～5g/100ml，gel含量为1～3g/100ml，hap含量为1～2g/100ml；混合溶液a中乙酸的体积分数为1～5％。

(3)将一定量碳纳米管cnt分散于二次蒸馏水中，加入适量冰乙酸，超声处理30～50min后磁力搅拌100～150min，得到cnt乙酸溶液。其中，cnt含量为0.5～3g/100ml；cnt乙酸溶液中乙酸的体积分数为1～3％。

所述的碳纳米管cnt为多壁碳纳米管，直径为7～9nm，长度为5～20μm。

(4)将步骤(3)制备得到的cnt乙酸溶液加入到步骤(2)制备得到的cs/gel/hap混合溶液a中，于40～60℃下加热、搅拌50～100min至混合均匀，得到cs/gel/hap/cnt的混合溶液b。

(5)将步骤(4)制备得到的混合溶液b移到塑料孔板中，并将塑料孔板在-20～-30℃条件下进行预冻处理20～30h，预冻处理后进行冷冻干燥处理得到复合支架预产物。

所述的冷冻干燥的温度为-40～-60℃，时间为20～30h。

(6)去除复合支架预产物表面的一层致密的物质，常温条件下，将复合支架预产物浸泡在交联剂中化学交联20～30h后，进行清洗、干燥处理，即可获得结构稳定的含碳纳米管的骨组织工程复合支架。

所述的交联剂为n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在65％乙醇溶液中的混合溶液。其中，n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度均为50mmol/l。交联剂用量为15～20ml/g支架。

所述的清洗过程为采用磷酸氢二钠冲洗4～6h，再采用二次蒸馏水冲洗6～8h。

所述的干燥温度为60～80℃，干燥时间为20～30h。

上述制备方法得到的含碳纳米管的复合多孔支架中壳聚糖、明胶、羟基磷灰石三种物质的质量比为1:(0.2～1):(0.2～1)；含碳纳米管的复合多孔支架内部为多孔结构，孔隙率在69.51％～84.35％范围，吸水率在667.32％～946.82％范围。

本发明制备的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架，对骨组织工程典型种子细胞—脂肪干细胞表现出良好的生物学性能，适用于骨组织工程领域。

本发明相对于现有技术，具有如下优点和有益效果：本发明所述方法制备的复合支架，集合了壳聚糖、明胶、羟基磷灰石、碳纳米管四种材料各自的优点，兼具优良的生物性能和力学性能；通过化学交联，获得了结构更加稳定的复合支架；通过调节复合支架材料中的碳纳米管含量，来调控复合支架的孔隙率、吸水率和机械性能；获得了孔隙率高、吸水率高、生物相容性好、结构稳定的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架材料；扫描电镜、亲水性实验和细胞相容性实验检测都证明了该支架材料能够满足骨组织工程对于支架材料的需求。

附图说明

图1为本发明制备的碳纳米管含量0％的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石复合支架扫描电镜图；

图2为本发明制备的碳纳米管含量5.0％的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架扫描电镜图；

图3为本发明制备的碳纳米管含量10.0％的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架扫描电镜图；

图4为本发明制备的碳纳米管含量15.0％的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架扫描电镜图。

具体实施方式

本发明用以下实施例说明，但本发明并不限于下述实施例，在不脱离前后所述宗旨的范围内，所有基于本发明基本思想的修改和变动，都属于本发明请求保护的技术范围内。

实施例1不含碳纳米管的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石复合支架制备

精确称量1.00g羟基磷灰石，加入到烧瓶中，随后加入98ml的二次蒸馏水，磁力搅拌约30min后，溶液成乳状。向乳状溶液中加入2.50g壳聚糖和1.50g明胶，随后再加入2ml冰乙酸。然后将该溶液置于40℃的水浴锅中加热、磁力搅拌约120min后，待各物质均匀分散在溶液中，即可将烧瓶取出。将取出的烧瓶置于超声波中或者静止一段时间除去溶液中的气泡。在气泡脱除之后，使用胶头滴管将烧瓶中的溶液移到塑料孔板中。将装满混合溶液的塑料孔板置于-20℃的冰箱中冷藏25h进行预冻，然后置于冷冻干燥机中-40℃冻干30h，得到复合支架材料预产物。刮去制备好的复合支架材料预产物表面的一层致密的物质，将其浸泡在75ml交联剂中(n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在65％乙醇溶液中的混合溶液。其中，n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为50mmol/l)，常温静置交联20h后，取出支架用磷酸氢二钠冲洗4h，再使用二次蒸馏水冲洗6h，即可完成壳聚糖/明胶/羟基磷灰石复合支架的交联。于60℃下干燥6h后，所得复合支架孔隙率84.35％，吸水率775.08％。

实施例2碳纳米管含量0.5％的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架制备

精确称量1.00g羟基磷灰石，加入到烧瓶中，随后加入98ml的二次蒸馏水，磁力搅拌约30min后，溶液成乳状。向乳状溶液中加入2.50g壳聚糖和1.50g明胶，随后再加入2ml的冰乙酸。然后将该溶液置于40℃的水浴锅中加热、磁力搅拌120min。将称量好的0.025g碳纳米管加入另一烧瓶中，在烧瓶中加入5ml的二次蒸馏水和100μl的冰乙酸，先超声处理30min，随后磁力搅拌约100min，将碳纳米管乙酸溶液加入到已经搅拌均匀的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石混合溶液中，然后用5ml的二次蒸馏水将剩余的碳纳米管冲洗干净。继续于40℃下加热搅拌100min待新的混合再次均匀，得到壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管混合溶液。使用胶头滴管将烧瓶中的溶液移到塑料孔板中，将装满混合溶液的塑料孔板置于-25℃的冰箱中冷藏28h进行预冻，然后置于冷冻干燥机中-40℃冻干30h，得到复合支架材料预产物。刮去制备好的复合支架材料预产物表面的一层致密的物质，将其浸泡在100ml交联剂中(n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在65％乙醇溶液中的混合溶液。其中，n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为50mmol/l)，常温静置交联22h后，取出支架用磷酸氢二钠冲洗4h，再使用二次蒸馏水冲洗6h，即可完成壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架的交联。于60℃下干燥7h后，所得复合支架孔隙率83.39％，吸水率786.92％。

实施例3碳纳米管含量5.0％的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架制备

精确称量1.00g羟基磷灰石，加入到烧瓶中，随后加入110ml的二次蒸馏水，磁力搅拌约40min后，溶液成乳状。向乳状溶液中加入3.50g壳聚糖和1.50g明胶，随后再加入3ml的冰乙酸。然后将该溶液置于50℃的水浴锅中加热、磁力搅拌100min。将称量好的0.31g碳纳米管加入另一烧瓶中，在烧瓶中加入15ml的二次蒸馏水和200μl的冰乙酸，先超声处理40min，随后磁力搅拌约100min，将碳纳米管乙酸溶液加入到已经搅拌均匀的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石混合溶液中，然后用5ml的二次蒸馏水将剩余的碳纳米管冲洗干净。继续于50℃下加热搅拌70min待新的混合再次均匀，得到壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管混合溶液。使用胶头滴管将烧瓶中的溶液移到塑料孔板中，将装满混合溶液的塑料孔板置于-25℃的冰箱中冷藏30h进行预冻，然后置于冷冻干燥机中-50℃冻干30h，得到复合支架材料预产物。刮去制备好的复合支架材料预产物表面的一层致密的物质，将其浸泡在120ml交联剂中(n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在65％乙醇溶液中的混合溶液。其中，n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为50mmol/l)，常温静置交联25h后，取出支架用磷酸氢二钠冲洗5h，再使用二次蒸馏水冲洗7h，即可完成壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架的交联。于70℃下干燥6h后，所得复合支架孔隙率81.39％，吸水率946.82％。

实施例4碳纳米管含量10.0％的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架制备

精确称量1.50g羟基磷灰石，加入到烧瓶中，随后加入110ml的二次蒸馏水，磁力搅拌约50min后，溶液成乳状。向乳状溶液中加入3.00g壳聚糖和2.00g明胶，随后再加入4ml的冰乙酸。然后将该溶液置于60℃的水浴锅中加热、磁力搅拌80min。将称量好的0.72g碳纳米管加入另一烧瓶中，在烧瓶中加入25ml的二次蒸馏水和500μl的冰乙酸，先超声处理50min，随后磁力搅拌约120min，将碳纳米管乙酸溶液加入到已经搅拌均匀的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石混合溶液中，然后用5ml的二次蒸馏水将剩余的碳纳米管冲洗干净。继续于60℃下加热搅拌60min待新的混合再次均匀，得到壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管混合溶液。使用胶头滴管将烧瓶中的溶液移到塑料孔板中，将装满混合溶液的塑料孔板置于-30℃的冰箱中冷藏26h进行预冻，然后置于冷冻干燥机中-60℃冻干24h，得到复合支架材料预产物。刮去制备好的复合支架材料预产物表面的一层致密的物质，将其浸泡在130ml交联剂中(n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在65％乙醇溶液中的混合溶液。其中，n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为50mmol/l)，常温静置交联26h后，取出支架用磷酸氢二钠冲洗5h，再使用二次蒸馏水冲洗8h，即可完成壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架的交联。于70℃下干燥8h后，所得复合支架孔隙率75.41％，吸水率684.24％。

实施例5碳纳米管含量15.0％的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架制备

精确称量1.50g羟基磷灰石，加入到烧瓶中，随后加入100ml的二次蒸馏水，磁力搅拌约50min后，溶液成乳状。向乳状溶液中加入3.00g壳聚糖和1.80g明胶，随后再加入5ml的冰乙酸。然后将该溶液置于50℃的水浴锅中加热、磁力搅拌120min。将称量好的1.11g碳纳米管加入另一烧瓶中，在烧瓶中加入50ml的二次蒸馏水和600μl的冰乙酸，先超声处理50min，随后磁力搅拌约150min，将碳纳米管乙酸溶液加入到已经搅拌均匀的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石混合溶液中，然后用5ml的二次蒸馏水将剩余的碳纳米管冲洗干净。继续于50℃下加热搅拌80min待新的混合再次均匀，得到壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管混合溶液。使用胶头滴管将烧瓶中的溶液移到塑料孔板中，将装满混合溶液的塑料孔板置于-30℃的冰箱中冷藏30h进行预冻，然后置于冷冻干燥机中-60℃冻干30h，得到复合支架材料预产物。刮去制备好的复合支架材料预产物表面的一层致密的物质，将其浸泡在150ml交联剂中(n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在65％乙醇溶液中的混合溶液。其中，n-羟基琥珀酰亚胺、乙磺酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的浓度分别为50mmol/l)，常温静置交联30h后，取出支架用磷酸氢二钠冲洗6h，再使用二次蒸馏水冲洗8h，即可完成壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架的交联。于80℃下干燥7h，后所得复合支架孔隙率69.51％，吸水率667.32％。

实施例6含不同比例碳纳米管的壳聚糖/明胶/羟基磷灰石/碳纳米管复合支架细胞相容性检测

将种子细胞-脂肪干细胞接种在cs/gel/ha/cnt支架材料上进行复合培养，同支架细胞复合培养物培养一段时间之后进行死活荧光染色观察，发现含不同比例碳纳米管的复合支架与细胞复合培养物的染色结果并无明显差异。使用calcein-am染色细胞发出大面积绿色荧光，表明细胞生存状态良好，使用pi染色只出现少量红色荧光表明死细胞较少，而使用hoechst染色出现大面积蓝色荧光。以上实验现象表明，含不同比例碳纳米管的复合支架材料均具备较好的生物相容性，能够满足骨组织工程对于支架材料的需求。

细胞支架复合培养物培养一周后，将其置于孔板当中，用2.5％戊二醛在4℃条件下固定24h，再用pbs洗涤两次，依次使用浓度梯度为50％、70％、90％、100％的酒精进行脱水，脱水时间为30min，脱水完成后进行真空干燥，干燥完成后用扫描电镜观察cs/gel/ha/cnt复合支架上细胞粘附及胞外基质分泌情况。根据电镜图片可以看出，细胞完全吸附在支架上，充分铺展，生长状况良好。