一种磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备方法及其应用与流程
本发明属于生物工程领域，涉及一种磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备方法及其应用。
背景技术：
随着人口老龄化问题的不断加剧，实现缺损或病变组织的修复和重建已经成为生物医学领域的重要科学命题。骨组织是人体最重要的组织之一，目前，临床上对于人体骨组织的修复所普遍采取的治疗措施仍是使用自体骨和异体骨，对骨缺损进行填充和修复。该治疗方法存在着较大的弊端，比如缺少供体、易引起原有组织的感染和排异。这些都限制了该方法的广泛应用，并鼓励着科学研究者对新方法新材料的探索和开发。因此，骨组织工程被认为是更具应用前景的治疗方法，将逐渐取代传统使用的仅为人体被动接收的、生物惰性的骨替代材料，代之以自身具有生物活性，并可以生物降解的支架材料。
生物材料作为细胞和组织再生的支架是组织工程的基础。它为细胞的生长和组织的再生提供结构上和力学上的支撑，从而提高细胞在材料上的粘附、繁殖、分化以及成骨。骨组织工程支架需要满足以下的要求：具有良好的生物相容性、生物降解性，无免疫源性，降解产物无毒副作用，理想的材料表面化学和形貌特性，以及必要的力学特性。同时，支架不但要作为人造的细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)，还应作为生物信号分子的载体，通过不断向生理组织环境中释放这些因子而控制和调节细胞的功能和行为，以最终实现组织的修复。
然而，传统的块体支架材料在组织工程的应用过程中远远不能满足最终的骨组织重建。尤其是合成的支架缺乏可控的降解速度而导致无法实现对生物因子的可控释放。已有的研究结果已经表明，直接将生长因子混入块体支架往往在植入初期产生爆释而对组织修复产生微弱的效果，或因释放过量而产生骨组织的增生。为解决这一问题，科学家们提出了以微米或纳米尺寸的胶体颗粒作为基本单元构建有胶体颗粒构建的整体材料，即利用颗粒间的相互作用力促使颗粒发生自组装，形成具有粘弹性的胶体分散体，即胶体凝胶。
相比于传统的块体支架材料，胶体凝胶具有更优异的性能。首先，使用微/纳米颗粒作为基本结构单元而制备的具有整体结构的胶体凝胶材料具有优异的可注射性和可塑性，这得益于颗粒间的氢键、静电作用、亲水性作用等相互作用力。这一特性使胶体凝胶材料可作为组织缺损填充材料用于微创手术(minimallyinvasivesurgery)，临床操作简单、易于广泛推广。同时，由于使用微纳米尺寸的颗粒材料为基础，可作为药物/蛋白加载和释放的载体，从而赋予胶体凝胶材料在药物缓释领域应用的潜力。而且，微/纳米球材料自身的小尺寸、高比表面积效应，有利于控制材料的降解速率，得到高载药率，植入后与体内组织有高反应活性，同时亦具有高渗透性和高活动性。
开发胶体类材料的关键是具有微纳米尺寸的胶体颗粒材料。高分子和生物陶瓷类胶体颗粒在骨修复材料领域具有各自的应用优势，但是它们的缺点也是十分明显，如高分子材料生物相容性和生物活性较差，而陶瓷材料的力学性能较低。因此，利用不同性质的材料复合而成的复合材料，不仅兼具组分材料的性质，而且可以得到单组分材料不具备的新性能，为获得结构和性质都符合骨组织工程要求的支架材料开辟了一条广阔的途径。尤其是生物高分子材料和具有骨传导性和骨诱导性的无机生物材料复合体系在骨修复材料领域有着重要的应用和研究意义。
胶体凝胶材料的关键技术是微纳米颗粒的制备，而如何制备高分子/生物矿物盐组成的复合材料颗粒是制备可用于骨修复的复合材料凝胶的核心。有研究人员将可生物降解的聚合物材料与具有生物活性的无机生物材料复合，制备得到复合材料微粒。这类材料表现出更加优异的生物学性能，易加工性和可控的降解速率。因此，由磷酸钙和可降解聚合物(如胶原、明胶、壳聚糖、plga等)制备的复合材料微球表现出更优异的特性，如比单纯plga材料高的亲水性，良好的细胞相容性，比单纯高分子材料更慢的降解速率，以及更强的生物矿化能力。同时，复合材料支架有利于细胞的生长繁殖和新组织的生成。由于复合材料支架兼具各组分材料的优良特性，同时又可避免各组分的缺点，因此在组织工程支架制备中具有重要的实用价值。
现有的制备复合材料纳米颗粒技术的难点之一在于如何实现纳米颗粒产业规模化生产。尤其是纳米颗粒在成核和生长过程中，受温度、良溶剂/不良溶剂混合比、搅拌速率等参数都会对纳米颗粒的形成发生影响，传统的使用搅拌共混方式的制备方式往往造成纳米颗粒产物批次间差异显著，难以保证不同批次间纳米颗粒产品的性能参数(如尺寸和尺寸分布)稳定。
微流控加工技术恰恰为解决这一问题提供了理想的手段。该技术通过设计构建几十到几百微米的通道，操纵微小体积的流体，特征体积在10-9至10-18l间。该技术的关键是将传统实验室中在实验台上的合成等试验技术微缩至一个几厘米的微流控芯片中进行，这种系统的主要特征是流体环境的小型化，其中微流通道约100μm(约人类头发的直径)，而化学试剂则通过各种注射泵送入芯片中进行合成、分离或分析等反应。近年来，微流控技术在生物药物研究中已经成为重要的工具之一。例如，上微流控技术已被用于支持复杂的化学反应过程或药物筛选等工艺中，用于研究细胞-药物的相互作用，用于产生微米级尺寸的颗粒或液滴并用于药物控释或细胞包埋等应用。尽管微流控技术在微观尺度材料合成加工方面已经表现出其巨大的潜力，但如何将这一技术应用到纳米材料合成制备领域的相关研究和报道仍屈指可数。
本发明开发一种制备磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备工艺，通过磷酸钙和明胶两相的共沉淀法制备具有纳米尺寸的、无机/有机复合组分的复合材料纳米颗粒。更重要的是，本发明证实该复合材料颗粒制备技术可以通过微流芯片进行连续加工制备，为实现该复合材料的规模化生产提供了新途径。
现有的制备有机/无机复合材料微纳米颗粒的方法通常是利用乳液法制备，该方法将高分子溶液与预制备的磷酸钙纳米颗粒共混，进而将上述混合溶液分散在不共混的连续相溶液中，通过搅拌或超声震荡，形成水包油或油包水乳液，在经过固化、去乳液、清洗得到复合材料的微粒。例如，leeuwenburgh等(biomacromolecules2010；11(10):2653-2659)利用乳液法制备了磷酸钙/明胶微球，但颗粒的尺寸分布在20-50μm，颗粒尺寸分布宽。该工艺技术只能制备微米尺度的磷酸钙/明胶颗粒，无法实现纳米尺度复合材料颗粒的制备。jiang等(actabiomaterialia2010,6,3457-3470)同样基于乳液技术将plga和壳聚糖复合得到的复合微球可以中和单纯plga降解过程中的酸性产物，从而提升其生物学方面的性能。但这些复合材料微球都是在微米尺度上的颗粒，其比表面积大，使用微米颗粒堆积的胶体材料因为颗粒间的相互作用有限因此难以形成粘性的、有足够力学支撑的胶体网络，因此得到的胶体复合材料力学性能较差。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备方法，使用共沉淀法制备磷酸钙/明胶复合材料纳米级颗粒，实现了磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的一步法制备，为工业化量产奠定基础。
本发明是采用如下技术方案来实现的。
一种磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
(1)将明胶在20-90℃下溶解在去离子水中得到明胶水溶液，向其中加入磷酸盐，搅拌溶解，调ph至7-14，得磷酸盐-明胶水溶液；
(2)将钙盐溶解在极性有机溶剂中，将得到的钙盐-有机溶剂溶液滴加至步骤(1)得到的磷酸盐-明胶水溶液中，得磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬浊液；
(3)步骤(2)得到的悬浊液中，保持温度在20-90℃下，加入交联剂，在300-500rpm搅拌下进行交联反应；
(4)终止交联反应，反应液进行反复离心和在去离子水中重悬，得磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的明胶水溶液中，明胶浓度为0.5-20w/v％，优选2-10w/v％，更优选3-5w/v％，在步骤(3)中所述的交联反应的时间大于1h。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(1)中所述的磷酸盐为磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵等水溶性的磷酸盐类中的一种或几种；在步骤(2)中所述的钙盐为硫酸钙、氯化钙、硝酸钙、碳酸钙等水溶性或微溶于水的钙盐中的一种或两种；在步骤(2)中所述的极性有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃中的一种或几种。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(2)中，所述的钙盐-有机溶剂溶液和磷酸盐-明胶水溶液的体积比为1-9，优选2-3.5。
进一步地，在上述技术方案中，在所述的钙盐-有机溶剂溶液中钙盐含量和磷酸盐-明胶水溶液中磷酸盐含量以形成磷酸钙的钙和磷含量的摩尔比1.0-3.0为基准计算得到。
进一步地，在上述技术方案中，钙盐-有机溶剂溶液中钙盐含量和磷酸盐-明胶水溶液中磷酸盐含量以最终的磷酸钙理论产量为明胶质量的5-40wt％进行配制。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(3)中，所述的交联剂为戊二醛、甘油醛、甲醛、碳二亚胺、二卤代烷、异氰酸酯、二异氰酸酯、谷氨酰胺转胺酶或京尼平中的一种或几种。
进一步地，在上述技术方案中，在步骤(3)中，所述的交联剂与所述的悬浊液中明胶氨基的摩尔比为0.25-10.0，优选0.5-1.0。
本发明还提供利用微流控芯片装置制备得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒，包括如下步骤：
(1)按照权利要求1所述的方法制备得到磷酸盐-明胶水溶液和钙盐-有机溶剂溶液；
(2)以磷酸盐-明胶水溶液为内相，以钙盐-有机溶剂溶液为外相，以交联剂为第三相；
(3)以第一流速将内相、以第二流速将外相分别注入至微流控芯片装置的内相流体微通道和外相流体微通道中，内相和外相流入至混合通道内共混，形成磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬浊液；
(4)以第三流速将第三相注入至位于微流反应芯片装置下游的第三相流体微通道中，第三相流经混合通道与混合通道内的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬浊液混合，混合流体经输出通道导出芯片，收集在容器中；
(5)步骤(4)收集的交联反应液，进行反复离心和在去离子水中重悬清洗，得磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒；
所述的各微通道内壁表面进行亲水处理。
进一步地，在上述技术方案中，所述的内相流体微通道、外相流体微通道、第三相流体微通道或混合通道的横截面积为3×10-5～5mm2，优选3×10-4～5mm2，更优选0.3～3mm2。
进一步地，在上述技术方案中，所述的第一流速、第二流速和第三流速分别为0.05-200mlhr-1、0.1-1000mlhr-1和0.05-20000μlhr-1。
进一步地，在上述技术方案中，第二流速与第一流速的流速比为1.0～10.0，优选2.0～3.5；第三流速与第一流速比为0.0067～0.335，优选0.0067～0.067。
进一步地，在上述技术方案中，所述内相和外相通过相应微通道注入至微流控芯片装置后形成外相包裹内相的同心轴流体。
上述本发明方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒中的磷酸钙成分是磷酸三钙、磷酸八钙、羟基磷灰石中的一种或几种。
本发明还提供一种胶体凝胶，其特征在于，该胶体凝胶是采用上述本发明所述的方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的冻干粉和水性溶液共混而得到。其中，所述磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒冻干粉与水性溶液共混形成的分散液中，复合材料纳米颗粒的体积百分比为5％～150％，优选50-100％，更优选75％。制备得到的胶体凝胶的弹性模量在10pa到200kpa之间。所述胶体凝胶，该胶体凝胶还可以采用上述本发明所述的方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的冻干粉与悬浮有细胞的水性溶液或溶解有生物活性分子的水性溶液直接共混而得到。其中，所述的细胞选自原代培养细胞、传代培养细胞、细胞株培养细胞和杂合体中的一种；所述的生物活性分子为药物、蛋白质和信号因子中的一种。
本发明的有益效果：
(1)本发明首次提供了使用共沉淀法制备磷酸钙/明胶复合材料纳米级颗粒的制备方法，实现了磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的一步法制备，为工业化量产奠定基础。
(2)本发明的方法制备得到的复合材料颗粒的磷酸钙成分主要是磷酸三钙、羟基磷灰石相或磷酸八钙中的一种或几种，且无机成分可调控。
(3)本发明的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒具有生物相容性、可降解性，可作为生物活性蛋白类药物(如诱导组织再生的生长因子)的控释载体，用于药物缓释应用。
(4)以磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒作为结构单元，利用高分子相间的超分子作用(疏水作用、氢键、静电作用)，得到具有整体结构的、有胶体颗粒组成的胶体凝胶材料。其具有可注射性和可塑性，可作为可注射组织工程支架。由于复合材料微球中无机相具有增强效应，因此可得到高强度的胶体凝胶，弹性模量可在100pa至100kpa之间调控。在受到剪切力破坏后，材料弹性模量在30min内恢复至其初始弹性模量的30-70％，24h内回复弹性模量80-100％，可使用普通医用注射器进行注射，使用微创手术。
(5)传统方法需要分批次制备，制备过程中由于纳米颗粒对制备参数影响非常敏感，导致不同制备批次间得到的纳米颗粒产物参数难以保持稳定；而本发明中所述的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的制备方法可通过流体反应器或微流芯片直接制备，该方法可实现连续加样制备，反应条件更加稳定、更加可控，因此得到的产品参数更加稳定可控。并且可通过多个微流通道叠加的方法实现生产的放大，提高产量、产率，有利于工业化生产。本发明方法制备得到的纳米颗粒的李静范围为300nm-2000nm之间。
(6)所得磷酸钙/明胶复合材料凝胶与现有的微米级颗粒组成的复合材料可注射凝胶体系相比，具有更好的力学强度，流变弹性模量可达到200kpa，且具有自修复效应，自修复效率超过80％。
附图说明
图1为实施例1中所述方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的扫描电镜照片。
图2为对比例1中制备的磷酸钙纳米颗粒的扫描电镜照片。
图3为对比例2中制备的明胶纳米颗粒的扫描电镜照片。
图4为实例1中所述方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的x射线元素分析。
图5为实例1中所述方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的透射电镜照片。
图6为对比例1中所述方法制备得到的磷酸钙纳米颗粒的透射电镜照片。
图7为对比例2中所述方法制备得到的明胶纳米颗粒的透射电镜照片。
图8为实施例4中所述方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的x射线衍射谱。
图9为实施例4中所述方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的红外图谱分析。
图10为实施例4中所述方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的热重分析(tg)。
图11为实施例5中所述制备复合材料纳米颗粒的微流控芯片装置，其中，1、第一微通道，2、第二微通道，3、第三微通道，4、输出通道，5、u型混合通道ⅰ、6、u型混合通道ⅱ，11、输入端口1，21、输入端口2，31、输入端口3，41、输出通道输出端口。
图12为实例5中所述方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的透射电镜照片。
图13为实例5中所述方法制备的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的x射线元素分析。
图14为实施例6中所述的毛细管微流芯片微通道结构设计图，其中，1、内相流体微通道，2、外相流体微通道，3、交联剂微通道，4、输出通道，5、排气口，6、基台，7、内相流体送样端，8、外相流体送样端，9、输出通道输出端。
图15为实施例9中所述胶体凝胶的注射性能测试，过程平均推力仅为4.2±1.3n。
图16为实施例9中所述胶体凝胶通过普通医用注射器分进行注射的照片。
图17为实施例10中所述的磷酸钙/明胶复合材料胶体凝胶作为二维细胞培养基质材料在体外培养间充质干细胞1天和4天之后的扫描电镜照片。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从生物或化学公司购买。
实施例1
按照如下方法制备磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒：
(1)将1.25g明胶溶解在25ml去离子水中，并保持加热到40℃，得到澄清透明的明胶水溶液；将0.138g磷酸氢二钠溶解在该明胶水溶液中，并在300rpm下持续搅拌和加热40℃，滴加naoh溶液将溶液ph值调至10，得磷酸氢二钠-明胶水溶液；
(2)将0.106g氯化钙溶解在75ml无水乙醇中，待完全溶解后将该氯化钙乙醇溶液逐滴滴加入上述磷酸氢二钠的明胶水溶液中，并保持加热40℃和持续搅拌(1000rpm)，随着滴加过程进行，逐渐形成磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬液，理论计算，最终磷酸钙产物的钙/磷比为1.67；
(3)滴加完毕后，向上述纳米颗粒悬液中加入74μl的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联反应时间12hr，待反应结束，向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(4)将步骤(3)得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒，加入适量去离子水，得磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒悬浊液；其中离心的条件为，在5000rpm，室温，离心30分钟，使颗粒和上清液分层；
(5)将悬浊液在-60℃下冷冻干燥，得到磷酸钙/明胶纳米颗粒干粉。
图1为磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的扫描电镜照片，可见复合材料颗粒呈片状结构，长轴尺寸在200-600nm区间分布，其中a、b为不同视野下的电镜照片。与对比例1中合成的磷酸钙晶体(图2)和对比例2中合成的明胶纳米颗粒的形貌(图3)有明显的区别。
图4为磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的x射线元素分析图谱，图4显示纳米颗粒的主要元素组成包括c、n、o、ca、p，其中c、n、o是明胶的主要元素组成，而ca、p是磷酸钙的主要元素组成。证实复合材料中的组分是由明胶和磷酸钙组成。
图5为磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的透射电镜照片，图5a和5b为不同标尺下的电镜照片。图5显示复合材料纳米颗粒的形貌为片状颗粒。与对比例1中合成的磷酸钙晶体(图6)和对比例2中合成的明胶纳米颗粒(图7)的形貌有明显的区别。
对比例1
按照如下方法制备磷酸钙纳米颗粒：
(1)将0.138g磷酸氢二钠溶解在25ml去离子水中，加热到40℃得到澄清水溶液，通过滴加naoh溶液将上述水溶液的ph值调至10，得磷酸氢二钠水溶液；
(2)将0.106g氯化钙溶解在75ml无水乙醇中，待完全溶解后将该氯化钙乙醇溶液逐滴滴加入上述磷酸氢二钠水溶液中，并保持加热40℃和持续搅拌(500-1000rpm)，随着滴加过程进行，逐渐形成磷酸钙纳米颗粒的悬液，理论计算，最终磷酸钙产物的钙/磷比为1.67；
(3)将步骤(2)得到的磷酸钙纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙纳米颗粒，加入适量去离子水，得到磷酸钙纳米颗粒的悬浊液；
(4)将悬浊液在-60℃下冷冻干燥，得到磷酸钙纳米颗粒干粉。
图2为磷酸钙纳米颗粒的扫描电镜图片，可见磷酸钙纳米颗粒为片状晶体，长轴尺寸在200-400nm区间分布。对比图1所示的实施例1中制备的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒形貌明显不同。
图6为磷酸钙纳米颗粒的透射电镜图片，可见磷酸钙纳米颗粒为片状晶体，长轴尺寸在200-600nm区间分布。对比图5中复合材料纳米颗粒相貌有所不同。对比例2
按照如下方法制备明胶纳米颗粒：
(1)将1.25g明胶溶解在25ml去离子水中，并保持加热到40℃，得到澄清透明的明胶水溶液，通过滴加naoh溶液将上述水溶液的ph值调至10，得明胶水溶液；
(2)将75ml无水乙醇逐滴滴加入上述明胶水溶液中，并保持加热40℃和持续搅拌(500-1000rpm)，随着滴加过程进行，逐渐形成明胶纳米颗粒的悬液，滴加完毕后，向上述纳米颗粒悬液中加入74μl的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联反应时间在12hr，待反应结束，向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(3)将得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到明胶纳米颗粒，加入适量的在去离子水悬浮，得到明胶纳米颗粒悬浊液；
(4)将上述悬浊液在-60℃下冷冻干燥，得到明胶纳米颗粒干粉。
图3为明胶纳米颗粒的扫描电镜图片，可见明胶纳米颗粒的形貌为球形，微球的粒径在200-300nm范围内。形貌与磷酸钙纳米颗粒和磷酸钙/明胶纳米颗粒的形貌完全不同。
图7为明胶纳米颗粒的透射电镜图片，明胶纳米颗粒的形貌为球形颗粒，微球的粒径在200-400nm范围内。形貌与磷酸钙纳米颗粒和磷酸钙/明胶纳米颗粒的形貌完全不同。
实施例2
按照如下方法制备磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒：
(1)分别在30℃、40℃和60℃温度下，将1.25g明胶溶解在25ml去离子水中，并保持温度，得到澄清透明的明胶水溶液；将0.138g磷酸氢二钠溶解在该明胶水溶液中，并持续搅拌(300rpm)和加热，通过滴加naoh溶液将上述水溶液的ph值调至10，得磷酸氢二钠的明胶水溶液；
(2)将0.106g氯化钙溶解在75ml无水乙醇中，待完全溶解后将该氯化钙乙醇溶液逐滴滴加入上述磷酸氢二钠的明胶水溶液中，并分别30℃、40℃和60℃和持续搅拌(500-1000rpm)，随着滴加过程进行，逐渐形成磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬液，理论计算，最终磷酸钙产物的钙/磷比为1.67；
(3)滴加完毕后，保持加热不同温度，分别向上述纳米颗粒悬液中加入74μl的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联反应时间12hr，待反应结束，向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(4)将步骤(3)得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒，加入适量去离子水，得磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒悬浊液；其中离心的条件为，在5000rpm，室温，离心30分钟，使颗粒和上清液分层。
对上述制备的复合材料颗粒分散液使用激光粒度仪检测粒径，结果如表1所示。随着温度增加，颗粒的尺寸逐渐增加，尺寸分布pdi也逐渐增加。
表1.不同温度下制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的粒径和尺寸分布
实施例3
按照如下方法制备磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒：
(1)将1.25g明胶溶解在25ml去离子水中，并保持温度，得到澄清透明的明胶水溶液；将0.138g磷酸氢二钠溶解在该明胶水溶液中，并持续搅拌(300rpm)和加热，通过滴加naoh溶液将上述水溶液的ph值调至10，得磷酸氢二钠的明胶水溶液；
(2)分别将0.106g氯化钙分别溶解在50、75、125和225ml的无水乙醇中，待完全溶解后将该氯化钙乙醇溶液分别逐滴滴加入步骤(1)得到的磷酸氢二钠的明胶水溶液中，在40℃加热条件下持续搅拌(500-1000rpm)，随着滴加过程进行，逐渐形成磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬液，理论计算，最终磷酸钙产物的钙/磷比为1.67；
(3)滴加完毕后，保持加热不同温度，分别向上述纳米颗粒悬液中加入74μl的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联反应时间12hr，待反应结束，向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(4)将步骤(3)得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒，加入适量去离子水，得磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒悬浊液；其中离心的条件为，在5000rpm，室温，离心30分钟，使颗粒和上清液分层。
对上述制备的复合材料颗粒分散液使用激光粒度仪检测粒径，结果如表2所示。随着有机溶剂相体积的增加，颗粒的尺寸逐渐增加，尺寸分布逐渐变大。
表2.不同有机相/水相体积比制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的粒径和尺寸分布
实施例4
(1)将3.75g明胶溶解在40℃的25ml去离子水中，得到澄清透明的明胶水溶液；将1.242g磷酸氢二钠溶解在该明胶水溶液中，并持续搅拌(300rpm)和加热40℃，通过滴加naoh溶液将上述水溶液的ph值调至10，得磷酸氢二钠-明胶水溶液；
(2)将0.954g氯化钙溶解在225ml无水乙醇中，待完全溶解后将该氯化钙乙醇溶液逐滴滴加入上述磷酸氢二钠的明胶水溶液中，并保持加热40℃和持续搅拌(1000rpm)，随着滴加过程进行，逐渐形成磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬液。理论计算，最终磷酸钙产物的钙/磷比为1.67；
(3)滴加完毕后，向上述纳米颗粒悬液中加入222μl的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联反应时间在12hr之间，待反应结束，向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(4)将得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒在去离子水中的悬浊液，其中离心的条件为，在5000rpm，室温，离心30分钟，使颗粒和上清液分层；
(5)将上述悬浊液冷冻干燥，得到磷酸钙/明胶纳米颗粒干粉。
图8是实施例4所述方法制备的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒在戊二醛交联前后的x射线衍射谱图(戊二醛交联)，以及对比例1中所述方法制备的磷酸钙纳米颗粒的x射线衍射谱图(未交联)。其中2θ为25.9°和31.8°处的峰分别是羟基磷灰石晶体002晶面和211晶面的特征峰，而20°的峰分别为明胶的衍射峰，由于明胶为非结晶聚合物，因此衍射峰呈现宽分布的馒头峰。图8中交联和未交联的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的衍射谱可见羟基磷灰石2θ＝25.9°和2θ＝31.8°处的衍射峰，以及明胶2θ＝20°处的宽的衍射峰，再次证实复合材料中同时具有磷酸钙和明胶两种组分。
图9是实施例4所述方法制备的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的红外光谱。图中3297cm-1处的谱峰属于明胶中酰胺键的n-h键的伸缩振动，1631cm-1峰属于酰胺键中c＝o伸缩振动，1527cm-1峰属于酰胺键中n-h的弯曲振动。而单纯的磷酸钙纳米颗粒中的po43-基团在不同位置的分峰分别为σ3-1(1076cm-1)和σ3-2(1019cm-1)，σ3-2特征峰在磷酸钙/明胶复合材料中有所偏移1025cm-1。红外谱图的结果再次证实复合材料中同时具有磷酸钙和明胶两种组分。
图10是实施例4所述方法制备的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的热重分析结果。将磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒干粉加热升温至600℃，升温速度为10℃/min。结果显示，加热过程中复合材料的质量不断损失，在加热至400℃后失重过程进入平台区，最终剩余物质质量占起始样品的质量百分比为34wt％左右。可以判断煅烧后的产物基本为无机的磷酸钙成分其在测试煅烧温度是不会发生分解的，也可以证实该复合材料中磷酸钙的质量百分比在33wt％左右。
实施例5
采用微流控芯片装置制备本发明的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒：
所述微流控芯片装置可以采用如图11所示的常规微流控芯片装置，制备方法，包括如下步骤：
(1)按照实施例1中所述方法分别配置磷酸氢二钠-明胶水溶液、氯化钙-乙醇溶液、和交联剂25wt％戊二醛水溶液；
(2)以磷酸氢二钠-明胶水溶液为内相，以氯化钙-乙醇溶液为外相，以交联剂为第三相；
(3)将内相从输入端口1注入到芯片反应器中的第一微通道，将外相从输入端口2注入注入到第二微通道内，两溶液在反应器中的u型混合通道i中共混，并形成浑浊的纳米颗粒悬浊液；
(4)再进一步将第三相从输入端口3注入到第三微通道中，与上述悬浊液进一步在u型混合通道ii中共混，得到交联的磷酸钙/明胶纳米颗粒悬液；
(5)将该悬液经输出通道输出端口导出芯片，收集在容器中持续搅拌；向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(6)将步骤(5)得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒在去离子水中的悬浊液，其中离心的条件为，在5000rpm，室温，离心30分钟，使颗粒和上清液分层；
(7)将上述悬液冷冻干燥即得到磷酸钙/明胶纳米颗粒干粉。
其中：
所述的微流反应芯片中，所述的各通道为均匀直径的圆形管道，其横截面为1mm2。
在步骤(3)中，所述的内相的注入速度为1ml/min，所述的外相注入速度为3ml/min；在步骤(4)中，所述的第三相的注入速度为0.013ml/min。
在上述方法中，微流控芯片的通道结构具有u型共混通道结构，内外相流体以层流形式共混，利用通道不规则集合结构逐渐形成湍流，实现两相流体的物理共混。
图12为实施例5的方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的透射电镜照片，显示复合材料纳米颗粒的形貌为片状颗粒。与实施例1中使用普通烧杯反应制备的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的形貌有相近。
图13为实施例5的方法制备得到的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的x射线元素分析。结果显示，纳米颗粒的主要元素组成包括c、n、o、ca、p、c、n、o是明胶的主要元素组成，而ca、p是磷酸钙的主要元素组成。证实复合材料中的组分是由明胶和磷酸钙组成。
实施例6
采用微流控芯片装置制备本发明的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒：
所述微流控芯片装置可以采用如图14所示的微流控芯片装置，该装置包括内相流体微通道、一个外相流体微通道、附加相流体微通道、输出通道和收集容器，所述的内相流体微通道的一端非密封地插入于外相流体微通道的一端，输出通道的一端密封地插入于外相流体微通道的另一端，与插入于外相流体微通道内的内相流体微通道的端口非端到端连接，所述附加相流体微通道与未插入于外相流体微通道的输出通道相交相连通，输出通道的另一端与收集容器相连；该装置可以固定于基台，便于使用，所述各通道在同一水平面上，各微通道内壁表面进行亲水处理。
其中插入于外相流体微通道内的内相流体微通道的端口和插入于外相流体微通道中的输出通道端口为锥形；所述的内相流体微通道、外相流体微通道和附加相流体微通道分别与微蠕动泵或微注射器相连，以实现自动进样；在所述外相流体微通道内，所述的内相流体微通道的端口与输出通道的端口的距离为200μm。在输出通道的未插入于外相流体通道内的部分设置有排气口，用于在流体首次注入芯片时将芯片中气体排出。
该微流控芯片装置中，外相流体微通道为内经均一(内径为1.05μm)的方形ait玻璃毛细管。内相流体微通道为内径均一(内径为560μm)的圆柱形ait玻璃毛细管，插入于外相流体通道中的端口为锥形端口，端口内径为30μm。输出通道为内径均一(内径为560μm)的圆柱形ait玻璃毛细管，插入于外相流体微通道中的端口为锥形端口，端口内径为60μm。图1b为图1a中a-a'线上的剖视图。
制备方法，包括如下步骤：
(1)按照实施例1中所述方法分别配置磷酸-氢二钠明胶水溶液、氯化钙-乙醇溶液、和交联剂25wt％戊二醛水溶液；
(2)以磷酸-氢二钠明胶水溶液为内相，以氯化钙-乙醇溶液为外相，以交联剂为第三相；
(3)将内相从内相流体送样端，将外相从外相流体送样端注入反应器中相应的微通道中，芯片的流体聚焦结构使两相溶液在芯片中形成同心轴流体，利用两相流体在微流通道中的快速物质扩散实现共混，并形成浑浊的纳米颗粒悬浊液；
(4)将第三相从输出通道中设置的交联剂微通道注入反应器内，与步骤(2)形成的悬浊液共混，得到交联的磷酸钙/明胶纳米颗粒悬液；
(5)该悬液经输出通道输出端导出芯片，收集在容器中持续搅拌；
(6)向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(7)将得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒在去离子水中的悬浊液，其中离心的条件为，在5000rpm，室温，离心30分钟，使颗粒和上清液分层；
(8)将上述悬液冷冻干燥即得到磷酸钙/明胶纳米颗粒干粉。
在步骤(3)中，所述的内相的注入速度为500μl/hr，所述的外相的注入速度为1.5ml/hr；在步骤(4)中，所述的第三相的注入速度为6.5μl/hr。
在上述方法中，微流控芯片装置具有能形成同心轴流体的流体聚焦的微通道结构，内外相形成流体聚焦的同心轴流体，通过两相间的快速物质扩散形成共混，从而促使明胶分子快速成核生长，并逐渐生长形成纳米颗粒。
通过激光粒度仪对实施例1、5、6中不同方式制备的磷酸钙/明胶复合材料颗粒的粒径分析，如表1。
表3不同方法制备的磷酸钙/明胶复合材料颗粒的粒径
表3的结果可见，实施例1中的传统工艺在烧杯中制备得到的磷酸钙/明胶纳米颗粒的粒径为371.3±17.3nm；而实施例5中通过u形混合流体反应器和实施例6中通过流体聚焦微流芯片制备的磷酸钙/明胶纳米颗粒尺寸更小，尺寸分布更窄。
实施例7
(1)将3.75g明胶溶解在40℃的75ml去离子水中，得到澄清透明的明胶水溶液；将0.828g磷酸氢二钠溶解在该明胶水溶液中，并持续搅拌(300rpm)和加热40℃，通过滴加naoh溶液将上述水溶液的ph值调至10，得磷酸氢二钠-明胶水溶液；
(2)将0.636g氯化钙溶解在225ml无水乙醇中，待完全溶解后将该氯化钙乙醇溶液逐滴滴加入上述磷酸氢二钠的明胶水溶液中，并保持加热40℃和持续搅拌(500-1000rpm)，随着滴加过程进行，逐渐形成磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬液。理论计算，最终磷酸钙产物的钙/磷比为1.67。
(3)滴加完毕后，向上述纳米颗粒悬液中加入222μl的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联反应12h，待反应结束，向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(4)将得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒在去离子水中的悬浊液，其中离心的条件为，在5000rpm，室温，离心30分钟，使颗粒和上清液分层；
(5)将上述悬液冷冻干燥即得到磷酸钙/明胶纳米颗粒干粉，纳米颗粒的粒径分布在300-400nm之间；
(6)将上述纳米颗粒干粉与不同体积的去离子水共混，制备含有不同纳米颗粒含量的胶体凝胶，使用流变仪测量凝胶的弹性模量，结果如表4所示，随着凝胶中纳米颗粒含量的增加，凝胶的力学强度不断增加。当颗粒浓度达到25w/v％时，制备得到的凝胶的弹性模量值达到～100kpa。
表4.含有不同纳米颗粒含量的胶体凝胶的弹性模量
实施例8
(1)将3.75g明胶溶解在40℃的75ml的去离子水中，得到澄清透明的明胶水溶液；分别将0.414g、0.828g、1.242g的磷酸氢二钠溶解在上述明胶水溶液中，分别得到水溶液i、ii、iii，持续加热40℃，通过滴加naoh溶液将上述水溶液的ph值调至10，得含有不同磷酸氢二钠的明胶水溶液；
(2)分别将0.318g、0.636g、0.954g的氯化钙溶解在225ml无水乙醇中，分别制备不同氯化钙浓度的乙醇溶液i、ii、iii；
(3)待完全溶解后将上述氯化钙-乙醇溶液分别逐滴滴加入上述不同浓度的磷酸氢二钠-明胶水溶液中，即将溶液i滴加至溶液i中，将溶液ii滴加至溶液ii中，将溶液iii滴加至溶液iii中，并保持加热40℃和持续搅拌(500-1000rpm)。随着滴加过程进行，逐渐形成磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒的悬液；
(3)滴加完毕后，向上述纳米颗粒悬液中分别加入222μl的交联剂戊二醛(25wt％水溶液)，交联反应时间为12hr，待反应结束，向混合物中加入100mm浓度的甘氨酸，从而终止未反应完全的戊二醛的端基；
(4)将得到的纳米颗粒悬浮液进行反复离心和在去离子水中重悬，最终得到磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒在去离子水中的悬浊液；
(5)将上述悬液冷冻干燥即得到磷酸钙/明胶纳米颗粒干粉；
其中，通过上述方法制备的三种磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒，其中磷酸钙在复合材料中的理论质量分数分别为10、20、30w/v％；
(6)将上述三种不同复合材料纳米颗粒干粉与一定体积的去离子水共混，制备颗粒浓度达到20w/v％的胶体凝胶，使用流变仪测量凝胶的弹性模量，结果如表5所示，随着组成胶体凝胶的磷酸钙/明胶复合材料纳米颗粒中的磷酸钙相含量从10w/v％增加到30w/v％，凝胶的力学强度先增加后递减。复合材料纳米颗粒中的磷酸钙相含量为20w/v％时，制备得到的复合材料凝胶的弹性模量值达到～43kpa，达到最高值；此后随着凝胶中磷酸钙含量的增加凝胶的力学强度反而逐渐下降，这是由于尽管具有更高力学强度的磷酸钙相含量增加，但由于相同纳米颗粒质量分数含量的情况下，无机相增加意味着凝胶体系中颗粒的体积分数下降。这复合胶体物理学定律，即体积分数下降时胶体体系的力学强度降低的规律。但与对比例3中所述方法制备的单纯明胶胶体凝胶相比，复合材料胶体凝胶的弹性模量显著提高，这是由于磷酸钙无机相在凝胶材料中起到增强的作用。
将上述不同磷酸钙含量的胶体凝胶进行自修复效率测试，结果如表6所示。首先在低剪切力情况下(0.1％应变)测试凝胶的初始弹性模量；随后对凝胶施加逐渐增大的剪切力(应变从0.1％增加到1000％)，凝胶结构被破坏；随即取消破坏性剪切力后，静置30min后再次测量凝胶的修复弹性模量。最终凝胶的自修复效率＝(修复弹性模量/初始弹性模量)×100％。结果显示，随着凝胶中磷酸钙无机相含量的增加，复合材料的自修复效率逐渐下降。
表5.不同磷酸钙含量的胶体凝胶的弹性模量
表6.不同磷酸钙含量的胶体凝胶进行自修复效率
对比例3
(1)按照上述对比例2的方法，制备得到明胶纳米颗粒干粉。
(2)上述明胶纳米颗粒干粉与一定体积的去离子水共混，制备颗粒浓度达到20w/v％的胶体凝胶，使用流变仪测量凝胶的弹性模量，结果如表5所示，在所述制备条件下得到的凝胶弹性模量为7kpa，远低于复合材料凝胶的强度。
将上述明胶基胶体凝胶按照实施例4中的方法进行自修复效率测试，结果如表6所示。结果显示，单纯明胶胶体凝胶材料在受到外力破坏后30分钟内自修复效率为67％，比复合材料凝胶的自修复效率更高。
实施例9
(1)按照上述实施例1的方法，制备得到明胶纳米颗粒干粉。
(2)将上述纳米颗粒干粉与不同体积的去离子水在普通10ml医用针管中共混，制备得到颗粒浓度达到20w/v％的胶体凝胶，使用万能力学测试机测量使用普通医用针管注射凝胶过程中所需的压力，结果如图15所示。磷酸钙/明胶复合材料胶体凝胶注射过程中所施加的推力仅为4.2±1.3n，证实材料的可注射性能优异。注射过程的样品照片如图16所示。
实施例10
(1)按照实施例4中所述方法分别配置磷酸氢二钠-明胶水溶液、氯化钙-乙醇溶液、和交联剂25wt％戊二醛水溶液；
(2)按照实施例5所述的方法，采用微流控芯片装置制备得到磷酸钙/明胶纳米颗粒干粉。
(3)将上述2g纳米颗粒干粉与10ml去离子水共混，并使用漩涡震荡器混匀得到颗粒浓度达到20w/v％的胶体凝胶，静置2分钟即形成复合凝胶以备使用。
通过体外细胞培养实验考察该凝胶材料的生物相容性和是否存在细胞毒性。具体实施步骤如下：
(i)细胞培养：
以大鼠骨髓间充质干细胞rmscs(
(ii)作为细胞二维培养基底材料的可注射胶体凝胶的制备：
将上述制备的复合胶体凝胶直接通过注射器注入pdms硅胶加工的模具(5毫米直径为2mm深度)中成型，并放置入细胞培养6孔板中。以该凝胶材料作为细胞二维培养的基底，将步骤i中制备的细胞悬液直接滴加在凝胶表面，按照细胞浓度为5000个/cm2接种，静置1小时后，加入培养基没过凝胶的表面，每24小时更换培养基。
图17为msc细胞在上述磷酸钙/明胶复合材料胶体凝胶表面培养不同时间点的扫描电镜照片。结果显示，在细胞种植在凝胶表面1天后，细胞完全黏附在凝胶的表面；培养4天后，细胞在凝胶表面增殖。证实磷酸钙/明胶复合胶体凝胶具有良好的生物相容性，支持细胞的黏附和生长。
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