一种中药组合物及其用途的制作方法

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种中药组合物及其医药用途。

背景技术：

乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，游离的癌细胞可以随血液或淋巴液播散全身，形成远端转移如骨转移、脑转移、肺转移，从而危及生命。迄今为止，并没有很好的治疗和控制乳腺癌增殖和复发的药物。

在乳腺癌的综合治疗中，中医药治疗在缓解术后症状和并发症，减轻放、化疗的毒副作用，抗复发转移等方面优势显著。

肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociatedmacrophage，简称tam)泛指在肿瘤发生过程中浸润于肿瘤并影响其发展转移的巨噬细胞，是众多肿瘤浸润免疫细胞中重要的一个亚群，参与了肿瘤发生演进的整个过程，具有高度的可塑性和异质性，约占所有肿瘤炎性细胞的50％。临床研究证实m2型tam浸润的数量与肿瘤患者的预后呈负相关性，肿瘤组织中的m2型巨噬细胞的大量存在提示预后不良，抑制m2型巨噬细胞是防治肿瘤增殖转移改善预后的新策略。

研究证实，抑制破骨细胞分化是防治骨质疏松和肿瘤骨转移的治疗策略之一。

白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草hedyotisdiffusawilld.[oldenlandiadiffusa(willd.)roxb.]的全草，味甘、淡，性凉，归胃、大肠、小肠经，具有清热解毒、利尿消肿、活血止痛之效。临床常用于咽喉肿痛、肠痈、疖肿疮疡、毒蛇咬伤以及肿瘤等。现代药理学研究证明，白花蛇舌草能增强机体的免疫力，抑制肿瘤细胞的生长和转移，诱导肿瘤细胞凋亡，杀菌，抗炎，乃“清热解毒”之良药。

半枝莲为唇形科黄芩属多年生本草植物半枝莲scutellariabarbatad.don的干燥全草，味辛、苦，性寒，归肺、肝、肾经，具有清热解毒，散瘀活血等功效。常用于治疗肿瘤、黄疸型肝炎、胃肠炎、阑尾炎、扁桃体炎、肺炎等疾病。现代药理研究证实，半枝莲具有调节机体免疫力，增强免疫活性，抗肿瘤，抗炎等作用。

技术实现要素：

本发明的目的旨在提供一种中药组合物及其用途。

具体地说，本发明的第一方面是提供了一种中药组合物，所述中药组合物由下列重量比的原料药制成：白花蛇舌草:半枝莲＝1:1，所述白花蛇舌草和半枝莲经粉碎，用水煎煮3～5次后合并提取液，浓缩得浸膏，将所得浸膏用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯萃取1～6次即得。

本发明的第二方面是提供了上述中药组合物在制备防治乳腺癌的药物或保健品中的用途。

本发明的第三方面是提供了上述中药组合物在制备抗炎药物或保健品中的用途。

本发明的第四方面是提供了上述中药组合物在制备抑制肿瘤相关巨噬细胞活性的药物或保健品中的用途。

本发明的第五方面是提供了上述中药组合物在制备抑制破骨细胞分化的药物或保健品中的用途。

本发明各个方面的细节将在随后的章节中得以详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。

附图说明

图1本发明的药物组合物ydw11抗乳腺癌研究

图1a显示ydw11对正常乳腺上皮细胞10a1体外增殖无影响(n＝3)；

图1b显示ydw11呈剂量和时间依赖性抑制mda-mb-231的体外增殖(n＝3)；

图1c显示ydw11呈剂量和时间依赖性抑制hs578t的体外增殖(n＝3)；

图1d显示ydw11呈剂量和时间依赖性抑制bt549的体外增殖(n＝3)；

图2本发明的中药组合物ydw11对mda-mb-231中p21表达影响

图2a显示ydw11抑制mda-mb-231中p21的基因表达(n＝2)；

图2b显示ydw11抑制mda-mb-231中p21的蛋白表达的wb条带图；

图2c显示ydw11抑制mda-mb-231中p21的蛋白表达(n＝3)；

图3本发明的中药组合物ydw11抗炎活性研究

图3a显示ydw11对静息态巨噬细胞m0活力无影响(n＝3)；

图3b显示ydw11对细胞上清液中亚硝酸盐含量的影响(n＝3)；

图4本发明的中药组合物ydw11抗炎机制研究

图4a显示ydw11抑制巨噬细胞炎症模型中inos致炎基因的表达(n＝3)；

图4b显示ydw11抑制巨噬细胞炎症模型中il-1β致炎基因的表达(n＝2)；

图4c显示ydw11抑制巨噬细胞炎症模型中ho-1抗炎基因的表达(n＝2)；

图5本发明的中药组合物ydw11抗炎机制研究

图5a显示ydw11对巨噬细胞炎症模型中inos，ho-1，ppar-γ蛋白表达的wb条带图；

图5b显示ydw11抑制巨噬细胞炎症模型中inos的蛋白表达(n＝3)；

图5c显示ydw11提高巨噬细胞炎症模型中ho-1的蛋白表达(n＝3)；

图5d显示ydw11提高巨噬细胞炎症模型中ppar-γ的蛋白表达(n＝2)；

图6本发明的中药组合物ydw11抗炎机制研究

图6a显示ydw11对巨噬细胞炎症模型中jnk/mapk信号通路的wb条带图；

图6b显示ydw11抑制巨噬细胞中jnk/mapk信号通路即抑制jnk磷酸化(n＝2)；

图6c显示ydw11对巨噬细胞炎症模型中p38/mapk信号通路的wb条带图；

图6d显示ydw11对巨噬细胞中p38/mapk信号通路无影响(n＝3)；

图6e显示ydw11对巨噬细胞炎症模型中erk/mapk信号通路的wb条带图；

图6f显示ydw11对巨噬细胞中erk/mapk信号通路无影响(n＝3)；

图7本发明的中药组合物ydw11抑制巨噬细胞炎症模型中mir155表达(n＝2)

图8本发明的中药组合物ydw11抑制肿瘤相关巨噬细胞活性研究

图8a显示m2型巨噬细胞促乳腺癌4t1细胞的体外迁移及ydw11干预的细胞迁移图；

图8b显示m2型巨噬细胞促乳腺癌4t1细胞的体外迁移及ydw11干预的影响；

图9本发明的中药组合物ydw11抑制肿瘤相关巨噬细胞机制研究

图9a显示ydw11对m2型巨噬细胞中arg-1蛋白表达的wb条带图；

图9b显示ydw11对m2型巨噬细胞中arg-1蛋白表达的影响(n＝3)；

图10本发明的中药组合物ydw11抑制破骨细胞分化活性研究

图10a显示ydw11抑制srnakl诱导鼠源巨噬细胞raw264.7分化为破骨细胞；

图10b显示ydw11抑破骨细胞分化(n＝2)；

图11本发明的中药组合物ydw11抑制细胞内抗酒石酸酸性磷酸酯酶的活性(n＝2)

图12qrt-pcr考察本发明的中药组合物ydw11对细胞内trap、dc-stamp、nfatc1基因表达的影响

图12a显示ydw11抑制细胞内trap的基因表达(n＝2)；

图12b显示ydw11抑制细胞内dc-stamp的基因表达(n＝2)；

图12c显示ydw11抑制细胞内nfatc1的基因表达(n＝2)；

图13westernblot法检测本发明的中药组合物ydw11对细胞内rank、traf6、nfatc1、cathepsink蛋白表达的影响

图13a显示ydw11对破骨细胞分化过程中关键蛋白的影响wb条带图；

图13b显示ydw11抑制破骨细胞分化过程中关键蛋白rank的表达(n＝2)；

图13c显示ydw11抑制破骨细胞分化过程中关键蛋白traf6的表达(n＝2)；

图13d显示ydw11抑制破骨细胞分化过程中关键蛋白nfatc1的表达(n＝3)；

图13e显示ydw11抑制破骨细胞分化过程中关键蛋白cathepsink的表达(n＝2)。

具体实施方式

本发明的问世部分是基于这样一个意外发现：白花蛇舌草和半枝莲以1：1配比进行水煎提取，经石油醚脱脂后，用乙酸乙酯萃取获得的提取物可抗乳腺癌、抗骨质疏松、抗炎和抑制肿瘤相关巨噬细胞活性。

本发明中药组合物的制备过程为将白花蛇舌草和半枝莲打粉，用水多次煎煮后合并提取液，浓缩为浸膏。将所得浸膏经石油醚脱脂后，用乙酸乙酯萃取获得。

随后的药效实验将证明，本发明的中药组合物可替代化疗药物防治乳腺癌、骨质疏松、炎症和抑制肿瘤相关巨噬细胞活性。

本发明中药组合物是药食兼用的纯天然的植物提取物，其同时对乳腺癌细胞增殖、肿瘤免疫应答细胞活性、破骨细胞分化和炎症发挥作用。

本发明的中药组合物可以单独使用或以药物制剂的形式使用。药物制剂包括作为本发明的中药组合物及可药用载体。“可药用载体”不会破坏本发明的白花蛇舌草和半枝莲或其提取物的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无害。

所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。

其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联pvp、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。

本发明的中药组合物及其药物制剂可按本领域常规方法制备并可以通过肠道或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等；非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。优选为口服制剂。

本发明的中药组合物以及其药物制剂的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、尿道、阴道等。

除了制成药剂之外，亦可在本发明的中药组合物中加入抗氧化剂、色素、酶制剂等各种食品添加剂，按本领域的常规方法制成保健食品。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

实施例1本发明的中药组合物(ydw11)的制备实施例

取白花蛇舌草500克和半枝莲500克(以1:1重量比配伍)，粉碎，用水煎煮4次后合并提取液，浓缩得浸膏189.68克，将所得浸膏用纯水溶解，经等体积石油醚萃取6次进行脱脂，水相浓缩经冷冻干燥至恒重为134.6克，将脱脂后水提取物用纯水溶解，用乙酸乙酯萃取6次，得提取液，经浓缩干燥得提取物0.28克(ydw11)

实施例2本发明的中药组合物(ydw11)抗乳腺癌的实验研究

2.1.mtt法考察ydw11对人正常乳腺上皮细胞10a1、人乳腺癌细胞株mda-mb-231、bt549、hs578t体外增殖活力的影响

10a1和mda-mb-231细胞分别以5000/100μl种于96孔板中，bt549以2500/100μl种于96孔板中，hs578t以2000/100μl种于96孔板中，培养过夜。ydw11以25，50μg·ml^-1剂量处理细胞，分别处理24h，48h，72h后，每孔加入mtt(用pbs溶解为5mg·ml^-1)10μl，继续培养4h，弃去上清，加入dmso100μl后置于摇床上至结晶完全溶解，读取490nm下的吸光度值a，计算ydw11各剂量处理组对细胞活力的影响。各组设3个复孔，独立实验重复3次。以对照组为100％，计算ydw11各剂量对不同细胞活力的影响。

实验结果表明：ydw11在25-50μg/ml呈时间和剂量依赖性显著抑制mda-mb-231(图1b，表2)、hs578t(图1c，表3)和bt549(图1d，表4)的体外增殖，而该剂量对正常乳腺上皮细胞10a1体外增殖无明显影响(图1a，表1)。

表1

注：与对照组比较比较**p<0.01，*p<0.05

表2

注：与对照组比较比较**p<0.01，*p<0.05

表3

注：与对照组比较比较**p<0.01，*p<0.05

表4

注：与对照组比较比较**p<0.01，*p<0.05

2.2.qrt-pcr考察ydw11对mda-mb-231中p21基因表达影响

mda-mb-231细胞以1×10⁵/孔种于六孔板中，贴壁生长过夜后，无血清处理24h，ydw11以25，50μg·ml^-1剂量处理细胞，收取给药处理24h的rna样品。trizol法提取rna，并测定od260与od280，计算其od260与od280比值检测rna纯度后，计算rna浓度，并调整浓度至500ng·μl^-1。根据逆转录试剂盒说明书逆转为cdna模板后，进行聚合酶链式反应。引物序列如下：

p21forward:5’-tgagccgcgactgtgatg-3’(seqidno.1)，

reverse:5’-gtctcggtgacaaagtcgaagtt-3’(seqidno.2)。

实验结果表明：ydw11显著提升mda-mb-231中p21基因表达(图2a，表5)。

表5

注：与对照组比较比较，^**p<0.01，^*p<0.05

2.3.westernblotting法检测ydw11对mda-mb-231中p21蛋白表达的影响

mda-mb-231细胞以1×10⁵/孔种于六孔板中，贴壁生长过夜后，无血清处理24h，ydw11以25，50μg·ml^-1剂量处理细胞，收取给药处理24h的蛋白样品。以100w功率超声3次，每次3s，超声后在提前预冷至4℃的低温高速离心机中4℃，12000rpm/min离心15min，取上清，用bca蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度。每孔上样30μg蛋白在sds-page凝胶中电泳，转膜后用5％牛奶封闭，检测p21蛋白表达。独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11显著提升mda-mb-231中p21蛋白表达(图2b；图2c，表6)。

表6

注：与对照组比较比较，^**p<0.01，^*p<0.05

2.4.小结：ydw11通过上调p21的表达阻滞细胞周期而影响乳腺癌细胞增殖。

实施例3本发明的中药组合物ydw11抗炎及其机制的研究

3.1.mtt法考察ydw11对巨噬细胞的细胞活力的影响

鼠源巨噬细胞raw264.7细胞以1×10⁴/100μl接种于96孔板中，培养过夜。ydw11以25，50μg/ml剂量处理细胞。刺激处理24h后，每孔加入mtt(用pbs溶解为5mg·ml^-1)10μl，继续培养4h，弃去上清，加入dmso100μl后置于摇床上至结晶完全溶解，用酶标仪读取490nm下的吸光度值a，计算ydw11各剂量处理组对细胞活力的影响。各组设3个复孔，独立实验重复3次。以对照组为100％，计算ydw11各剂量对细胞活力的影响。

实验结果表明：ydw11在25～50μg·ml^-1剂量对处于静息态的m0细胞无影响(图3a，表7)。

表7

注：给药组与空白对照组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

3.2.griess反应法检测细胞上清液中亚硝酸盐含量的变化

raw264.7细胞培养于30mm的培养皿中，贴壁生长过夜后，无血清处理24h，对照组采用无血清的rmpi1640培养细胞，模型组采用lps和ifn-γ(终浓度分别为100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)协同刺激细胞，ydw11分别以10，50，100，200μg/ml剂量处理细胞。培养24h后，吸取上清100μl至96孔板中，加入等量的griess反应试剂，反应10min，在540nm下读数。计算ydw11对细胞上清中亚硝酸盐抑制率及ic50。各组设3个复孔，独立实验重复3次。

抑制率＝(a模型组-a给药组)/(a模型组-a对照组)×100％。

实验结果表明：ydw11可以显著抑制细胞上清中亚硝酸盐的含量，其ic50约为27.74μg·ml^-1。(图3b，表8)

表8

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

3.3.qrt-pcr考察ydw11对细胞内inos、il-1β、ho-1基因表达的影响

raw264.7细胞培养于30mm的培养皿中，分别设置对照组、模型组、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜后，无血清处理24h，用ydw11预处理24h后，加入lps和ifn-γ(终浓度分别为100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)，收取诱导剂刺激4h和24h后各组的rna样品，trizol法提取rna，根据样品的吸光度值计算rna浓度，并调整rna浓度至500ng·μl^-1。按rt试剂盒说明书逆转成cdna样品后根据pcr试剂盒说明书进行聚合酶链式反应。引物序列如下：

inosforward:5’-ggagcgagttgtggattgtc-3’(seqidno.3)，

reverse:5’-gtgagggcttggctgagtgag-3’(seqidno.4)；

il-1βforward:5’-tgggaaacaacagtggtcagg-3’(seqidno.5)，

reverse:5’-ctgctcattcacgaaaaggga-3’(seqidno.6)；

ho-1forward:5’-cacagatggcgtcacttcgtc-3’(seqidno.7)，

reverse:5’-gtgaggacccactggaggag-3’(seqidno.8)；

gapdhforward:5’-aacggatttggtcgtattggg-3’(seqidno.9)，

reverse:5’-caggggtgctaagcagttgg(seqidno.10)。

独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11下调m1炎症模型中致炎基因inos(图4a，表9)、il-1β的基因(图4b，表10)表达，上调抗炎基因ho-1的基因表达(图4c，表11)。

表9

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表10

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表11

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

3.4.westernblot法检测ydw11对inos、ho-1、ppar-γ蛋白表达的影响

raw264.7细胞培养于30mm的培养皿中，分别设置对照组、模型组、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜后，无血清处理24h，用ydw11预处理1h后，加入lps和ifn-γ(终浓度分别为100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)，收取诱导剂分别刺激6h和24h的蛋白样品。功率100w，超声3次，每次超声3s，间歇2s，超声后在提前预冷至4℃的低温高速离心机中4℃，12000rpm/min离心15min，取上清，用bca蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度。每孔上样15μg蛋白在sds-page凝胶中电泳，转膜后用5％牛奶封闭，6h的样品检测inos和ppar-γ蛋白表达，24h样品检测ho-1蛋白表达。独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11下调巨噬细胞炎症模型中inos蛋白表达(图5a；图5b，表12)，上调ho-1(图5c，表13)和ppar-γ(图5d，表14)蛋白表达。

表12

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表13

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表14

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

3.5.westernblot法检测ydw11对mapk信号通路的影响

raw264.7细胞培养于30mm的培养皿中，分别设置对照组、模型组、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜后，无血清处理24h，用ydw11预处理1h后，加入lps和ifn-γ(终浓度分别为100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)，收取诱导剂刺激30min的蛋白样品。功率100w，超声3次，每次超声3s，间歇2s，超声后在提前预冷至4℃的低温高速离心机中4℃，12000rpm/min离心15min，取上清，用bca蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度。每孔上样15μg蛋白在sds-page凝胶中电泳，转膜后用5％牛奶封闭，检测mapk信号通路中t-erk、p-erk、t-jnk、p-jnk、t-p38、p-p38蛋白表达。独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11剂量依赖性抑制jnk的磷酸化(图6a；6b，表15)，而对p38(图6c；6d，表16)和erk(图6e；6f，表17)的磷酸化没有明显影响。

表15

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表16

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表17

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

3.6.taqmanmicrornart-pcr法检测ydw11对mir155表达的影响

raw264.7细胞培养于30mm的培养皿中，分别设置对照组、模型组、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜后，无血清处理24h，用ydw11预处理24h后，加入lps和ifn-γ(终浓度分别为100μg·l^－1和1×10⁴u·l^－1)，收取诱导剂刺激24h各组的rna样品。采用trizol法提取总rna，根据taqmansmallrna试剂盒说明书，各样品取10ng总rna逆转成cdna后进行qpcr反应，检测各样品中mir155表达情况。独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11剂量依赖性抑制mir155表达(图7，表18)。

表18

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

3.7.小结：ydw11在巨噬细胞炎症模型中发挥抗炎作用一方面是通过抑制mapk中jnk通路的磷酸化和mir155的表达来下调炎症因子inos的基因和蛋白表达，另一方面则通过上调抗炎因子ho-1和ppar-γ的表达来发挥作用。

实施例4.本发明的中药组合物ydw11抑制肿瘤相关巨噬细胞活性及机制研究

4.1.trans-well小室迁移法考察m2型巨噬细胞对鼠源乳腺癌细胞4t1细胞的迁移力变化及ydw11干预的影响

raw264.7细胞在10％fbs1640条件下以1*10⁶/孔培养于24孔板中，分别设置对照组、模型组、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜，在无血清条件下加药预处理24h后，对照组采用无血清的rmpi1640培养细胞，模型组和ydw11组采用il-4和il-13(终浓度均为20ng·ml^-1)协同刺激细胞，同时ydw11组以25，50μg·ml^-1剂量药物处理细胞，24h后，收集细胞培养上清，取600μl置于24孔板下室后放入trans-well小室，在trans-well小室上室加入无血清培养基调整的细胞密度为5*10⁵/ml的4t1细胞，体积均为100μl，迁移24h。24h后，取出trans-well小室，以4％多聚甲醛固定30min，0.5％结晶紫染色30min，自来水漂洗后用棉签轻轻拭去trans-well小室上层未迁移的细胞。400倍镜下随机5个视野观察细胞并计数。

实验结果表明：yd显著抑制m2巨噬细胞促进乳腺癌4t1细胞的迁移加剧(图8a；8b，表19)。

表19

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较^**p<0.01，^*p<0.05

4.2.westernblot法检测ydw11对m2型巨噬细胞中arg-1蛋白表达的影响

raw264.7细胞在10％fbs1640条件下以1*10⁶/皿培养于30mm培养皿中，分别设置对照组、模型组、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜，在无血清条件下加药预处理24h后，对照组采用无血清的rmpi1640培养细胞，模型组和ydw11组采用il-4和il-13(终浓度均为20ng·ml^-1)协同刺激细胞，同时ydw11组以25，50μg·ml^-1剂量药物处理细胞，48h后收集蛋白。功率100w，超声3次，每次超声3s，间歇2s，超声后在提前预冷至4℃的低温高速离心机中4℃，12000rpm/min离心15min，取上清，用bca蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度。每孔上样20μg蛋白在sds-page凝胶中电泳，转膜后用5％牛奶封闭，检测arg-1蛋白表达。独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11剂量依赖性抑制m2型巨噬细胞中arg-1蛋白表达(图9a；9b，表20)。

表20

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

4.3.小结：ydw11抑制m2促进乳腺癌细胞4t1的体外迁移加剧，部分通过抑制肿瘤相关巨噬细胞m2型中精氨酸酶1表达而达到的。

实施例5.本发明的中药组合物ydw11抑制破骨细胞分化及其机制研究

5.1.trap染色考察ydw11对srnakl诱导鼠源巨噬细胞raw264.7分化为破骨细胞(ms)的影响

raw264.7细胞在10％fbs1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分别设置对照组、模型组(ms)、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜，第2天在10％fbs1640条件下加药物预处理24h，第3天在10％fbs1640条件加入诱导剂srnakl(终浓度为100ng/ml)并加药物处理，隔天换液并加诱导剂srnakl和药物，srnakl诱导处理7天后根据抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色试剂盒说明书进行trap染色。200倍镜下随机5个视野观察细胞分化情况，具有3个及以上细胞核的多核细胞认定为破骨样细胞，进行多核细胞计数，并进行典型的破骨样细胞图像采集。独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11呈剂量依赖性抑制trap阳性细胞的数量，抑制破骨细胞分化(图10a；10b，表21)。

表21

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

5.2.抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒检测细胞内抗酒石酸酸性磷酸酯酶(trap)活性

raw264.7细胞在10％fbs1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分别设置对照组、模型组(ms)、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜，第2天在10％fbs1640条件下加药物预处理24h，第3天在10％fbs1640条件加入诱导剂srnakl(终浓度为100ng/ml)并加药物处理，隔天换液并加诱导剂srnakl和药物，srnakl诱导处理7天后，弃去上清，pbs洗一遍后每孔分别加入100μlpbs，刮取细胞并收集细胞悬液，以150w功率超声3次，每次超声3s，间歇2s，超声后在提前预冷至4℃的低温高速离心机中4℃，12000rpm/min离心15min，取上清，根据抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒说明书检测样品中的抗酒石酸酸性磷酸酯酶的活性，同时采用bca蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度。独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11抑制破骨细胞中抗酒石酸酸性磷酸磷酸酯酶活性(图11，表22)。

表22

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

5.3.qrt-pcr考察ydw11对细胞内trap、dc-stamp、nfatc1基因表达的影响

raw264.7细胞在10％fbs1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分别设置对照组、模型组(ms)、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜，第2天在10％fbs1640条件下加药物预处理24h，第3天在10％fbs1640条件加入诱导剂srnakl(终浓度为100ng/ml)并加药物处理，隔天换液并加诱导剂srnakl和药物，srnakl诱导处理7天后，收集rna样品，trizol法提取rna，根据样品的吸光度值计算rna浓度，并调整rna浓度至500ng·μl^-1。按rt试剂盒说明书逆转成cdna样品后根据pcr试剂盒说明书进行聚合酶链式反应。引物序列如下：

trapforward:5’-tgacaagaggttccagga-3’(seqidno.11)，

reverse:5’-agccaggacagctgagtg-3’(seqidno.12)；

dc-stampforward:5’-ctgtgttactgagggctctttg-3’(seqidno.13)，

reverse:5’-cagagaagtcttccaggatctc-3’(seqidno.14)；

nfatc1forward:5’-gtctctttccccgacatcat-3’(seqidno.15)，

reverse:5’-tctccaagtaaccgtgtagc-3’(seqidno.16)。

实验结果表明：ydw11下调细胞内trap(图12a，表23)、dc-stamp(图12b，表24)、nfatc1(图12c，表25)基因表达。

表23

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表24

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表25

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

5.4.westernblot法检测ydw11对细胞内rank、traf6、nfatc1、cathepsink蛋白表达的影响。

raw264.7细胞在10％fbs1640条件下以10000/孔培养于24孔板中，分别设置对照组、模型组(ms)、ydw11组(25、50μg·ml^-1)，贴壁生长过夜，第2天在10％fbs1640条件下加药物预处理24h，第3天在10％fbs1640条件加入诱导剂srnakl(终浓度为100ng/ml)并加药物处理，隔天换液并加诱导剂srnakl和药物，srnakl诱导处理7天后，收集蛋白样品。功率100w，超声3次，每次超声3s，间歇2s，超声后在提前预冷至4℃的低温高速离心机中4℃，12000rpm/min离心15min，取上清，用bca蛋白测定试剂盒测定样品蛋白浓度。每孔上样30μg蛋白在sds-page凝胶中电泳，转膜后用5％牛奶封闭，检测rank、traf6、nfatc1、cathepsink蛋白表达。独立实验重复3次。

实验结果表明：ydw11下调细胞内rank(图13a；13b，表26)、traf6(图13c，表27)、nfatc1(图13d，表28)、cathepsink(图13e)蛋白的表达。

表26

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表27

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表28

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

表29

注：与对照组比较，^##p<0.01，^#p<0.05；与模型组比较，^**p<0.01，^*p<0.05

5.5.小结：ydw11呈剂量依赖性抑制trap阳性细胞的数量，抑制破骨细胞特异酶trap的活性及其基因的表达，抑制破骨细胞的分化中关键蛋白rank、traf6、nfatc1和cathepsink蛋白的表达。

实验总结：

1.白花蛇舌草半枝莲等比配伍水提取物的乙酸乙酯组分(ydw11)在25-50μg·ml^-1对正常乳腺上皮细胞没有毒性，具有抑制三阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231、hs578t、bt549)体外增殖的活性。

2.基于脂多糖(lps)和干扰素γ(ifn-γ)联合诱导鼠源巨噬细胞raw264.7为炎症模型，ydw11具有抗炎活性。

3.基于白介素4(il-4)和白介素13(il-13)联合诱导鼠源巨噬细胞raw264.7为肿瘤相关巨噬细胞模型，ydw11可抑制肿瘤相关巨噬细胞协助乳腺癌体外转移的活性，有提高免疫的功能。

4.基于细胞因子srnakl诱导鼠源巨噬细胞raw264.7为破骨细胞分化模型(ms)，ydw11抑制破骨细胞分化，具有抗骨质疏松、抑制乳腺癌骨转移的活性。

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<110>上海中医药大学

<120>一种中药组合物及其用途

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