本发明涉及一种化合物及其制备方法，特别涉及一类半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物及其制备方法。技术背景抗体-毒素偶联物(antibodydrugconjugate,adc)是靶向治疗的热点领域，已在美国获批上市的两个药物adcetris和kadcyla表现出良好的临床疗效，并且有超过50个adc药物在进行临床阶段研究。技术实现要素：本发明的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(tdc)，半胱氨酸插入位点包含选自以下3个插入位点的一个或多个位点：轻链第205位(kabat编号，其氨基酸序列为glsspcvtksf)，轻链第206位(kabat编号，其氨基酸序列为glsspvctksf)，重链第439位(kabat编号，其氨基酸序列为ytqkslsclspgk)。包含一个或多个上述半胱氨酸插入突变的抗体保持了其亲本抗体与抗原结合的能力(亲和力)。本发明通过其轻链第205位或/和第206位或/和重链第439位插入的半胱氨酸巯基与linker-drug进行抗体-毒素偶联物(tdc)定点偶联。氨酸改造的抗体-毒素偶联物，抗体为半胱氨酸定点插入抗体，半胱氨酸插入位点包含选自以下3个插入位点的一个或多个位点：kappa/λ轻链恒定区第205位(kabat编号)，轻链恒定区第206位(kabat编号)或igg抗体重链恒定区第439位(kabat编号)。半胱氨酸插入位点氨基酸序列包含以下3个序列的一个或多个：lc-205ins:glsspcvtksf；lc-206ins:glsspvctksf或hc-439ins:tqkslsclspgk。高活性细胞毒素通过连接子与插入的半胱氨酸游离巯基(-sh)进行定点偶联，连接子与插入的半胱氨酸偶联的抗体轻链氨基酸序列为：glsspcvtksf和glsspvctksf，连接子与插入的半胱氨酸偶联的抗体重链氨基酸序列为：tqkslsclspgk，其中，c为目标抗体轻链205位或206位或重链第439位插入的半胱氨酸。作为优选，其中所述抗体轻链包括kappa或λ同种型。作为优选，其中所述抗体重链包括igg1、igg2、igg3或igg4同种型。作为优选，其中所述半胱氨酸包含巯基(-sh)。作为优选，其中巯基(-sh)能够进行化学偶联。作为优选，通过连接子与半胱氨酸插入突变的游离巯基进行定点偶联的小分子高活性细胞毒素包括但不限于mmae、mmaf、pbd、sn-38、dox及其类似物，mmae、mmaf、pbd、sn-38及dox分子式为：主要定点偶联步骤为：首先使用还原剂(如dtt、tcep等)还原抗体，解除抗体上改造的半胱氨酸残基上的屏蔽，并通过阳离子交换层析或超滤换液等方式去除dtt与屏蔽物，然后使用氧化剂(如dhaa、cuso4等)氧化抗体，使抗体的链间二硫键重新连接。最后加入linker-drug与胱氨酸残基上的游离巯基偶联，并通过阳离子交换层析或超滤换液等方式去除未偶联上抗体分子linker-drug。本发明氨基酸简表：中文名称英文名称符号与缩写丙氨酸alaninea或ala精氨酸argininer或arg天冬酰胺asparaginen或asn天冬氨酸asparticacidd或asp半胱氨酸cysteinec或cys谷氨酰胺glutamineq或gln谷氨酸glutamicacide或glu甘氨酸glycineg或gly组氨酸histidineh或his异亮氨酸isoleucinei或ile亮氨酸leucinel或leu赖氨酸lysinek或lys蛋氨酸methioninem或met苯丙氨酸phenylalaninef或phe脯氨酸prolinep或pro丝氨酸serines或ser苏氨酸threoninet或thr色氨酸tryptophanw或trp酪氨酸tyrosiney或tyr缬氨酸valinev或valseqidno:6lc-cys205ins轻链恒定区(kappa)氨基酸序列>lc-cys205ins-kappatvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspcvtksfnrgec其中，glsspcvtksfn序列中标示出的c为定点偶联位点，与mc-vc-pab-payload进行定点偶联。seqidno:8lc-cys206ins轻链恒定区(kappa)氨基酸序列>lc-cys206ins-kappatvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvctksfnrgec其中，glsspvctksfn序列中标示出的c为定点偶联位点，与mc-vc-pab-payload进行定点偶联。seqidno:10igg1-fc-cys439ins重链恒定区(fc)氨基酸序列>igg1-fc-cys439insastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslsclspgk其中，tqkslsclspgk序列中标示出的c为定点偶联位点，与mc-vc-pab-payload进行定点偶联。seqidno:12lc-v205c轻链恒定区(kappa)氨基酸序列>lc-v205c-kappatvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspctksfnrgec其中，glsspctksfn序列中标示出的c为定点偶联位点，与mc-vc-pab-payload进行定点偶联。本发明披露的全新半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(tdc)相较非定点偶联的adc具有药物均一性好，副作用小等优点，临床前研究结果显示其显著优于非定点偶联adc。附图说明图1为实施例25中hic-hplc检测2a1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae的结果图。图2为实施例25中hic-hplc检测2a1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae的结果图。图3为实施例25中hic-hplc检测2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae的结果图。图4为实施例25中hic-hplc检测4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae的结果图。图5为实施例25中hic-hplc检测4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae的结果图。图6为实施例25中hic-hplc检测4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae的结果图。图7为实施例25中hic-hplc检测4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae的结果图。图8为实施例25中hic-hplc检测4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae的结果图。图9为实施例26中rp-hplc检测4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae毒素比抗体比例的结果图。图10为实施例27中sec-hplc检测tdc抗体骨架4d3的聚集情况结果图。图11为实施例27中sec-hplc检测tdc抗体骨架4d3-lc-cys205ins的聚集情况结果图。图12为实施例27中sec-hplc检测tdc抗体骨架4d3-lc-cys206ins的聚集情况结果图。图13为实施例27中sec-hplc检测tdc抗体骨架4d3-hc-cys439ins的聚集情况结果图。图14为实施例28中实验结果图。图15为实施例29中4e1-lc-cys205ins-mvpm、4e1-lc-cys206ins-mvpm、4e1-hc-cys439ins-mvpm抗体与抗原c-met的亲和力结果图。图16为实施例29中tdc4d3-lc-cys205ins-mvpm、4d3-lc-cys206ins-mvpm、4d3-hc-cys439ins-mvpm抗体与抗原trop2的亲和力结果图。图17为2a1-lc-v205c-mc-vc-pab-mmae、2a1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、2a1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mma对egfrwt过表达的人皮肤鳞癌细胞a431的ic50检测结果图。图18为2a1-lc-v205c-mc-vc-pab-mmae、2a1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、2a1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae对fgrviii过表达的人脑胶质瘤细胞株u87-egfrviii的ic50检测结果图。图19为4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae、4e1对c-met中高度表达的恶性胶质瘤细胞株u87-mg的ic50检测结果图。图20为d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae、4d3对trop2高度表达的胰腺癌细胞株bxpc-3的ic50检测结果图。图21为4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae在人血浆中稳定性的考察结果图。图22为4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae在人血浆中稳定性的考察结果图。图23为4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae在人血浆中稳定性的考察结果图。图24为4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae在人血浆中稳定性的考察结果图。图25为4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae在人血浆中稳定性的考察结果图。图26为4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae在人血浆中稳定性的考察结果图。图27为4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae、4d3亲本抗体在荷瘤小鼠药效上测试结果图。图28为4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae、4d3亲本抗体在荷瘤小鼠药效上测试结果图。具体实施方式实施例1mc的合成于30ml冰醋酸中加入6-氨基己酸3.9g(0.03mol)和1.2eq的马来酸酐3.5g(0.036mol)。反应液于120℃搅拌反应4～6h。反应完毕后，停止加热，自然冷却到室温。60℃减压浓缩除去大部分醋酸。所得棕黄色粘稠液倒入水中，再加入乙酸乙酯20ml×3萃取，合并有机层。有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到棕黄色油状物，加入50ml水搅拌，有类白色固体析出，过滤，50℃减压干燥的目标产品5.08g，收率80％。mp：89-92℃。m/z：212.2[m+h]+。1hnmr(400mz,dmso)：13.21(br,1h,cooh)、6.75(s,2h,coch＝chco)、3.63(t,2h,j＝7.2hz,nch2ch2)、2.42(t,2h,j＝7.4hz,ch2cooh)、1.52-1.68(m,4h,nch2ch2ch2ch2)、1.30-1.42(m,2h,nch2ch2ch2ch2)。实施例2mc-osu的合成在氮气保护下于50ml乙腈中加入4.7g(22mmol)mc和25g(22mmol)hosu。另取4.5g(22mmol)dcc溶于25ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于0℃反应2小时后再室温反应过夜。过滤，滤饼用乙腈10ml×3洗涤，滤液减压浓缩至干。所得油状物于室温减压干燥6h得到浅棕色固体6.4g，收率95％。(不纯化直接投下一步反应)m/z：309.2[m+h]+。1hnmr(400mz,cdcl3)：1～2(m,6h,cch2ch2ch2c)、2.68(t,2h,ch2co)，2.95(s,4h,coch2ch2co)、3.68(t,2h,ch2n)、6.81(s,2h,ch＝ch)。实施例3fmoc-val-osu的合成于100mlthf中加入fmoc-val10g和hosu3.4g。另取dcc6g溶于50ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于室温搅拌反应24小时。过滤，滤饼用thf洗涤，滤液减压浓缩得到透明油状物。油状物未经纯化直接投下一步反应。m/z：437.4[m+h]+。实施例4.fmoc-vc的合成于20mlthf中加入cit4.0g(1.05eq)和碳酸氢钠的水溶液60ml(nahco32g,1.05eq)。另取22.35mmolfmoc-val-osu溶于60mldme中，再将其加入反应液中。反应液于室温下搅拌反应24小时。反应完毕后，向体系中加入15％柠檬酸水溶液110ml，然后再用ea萃取两次，合并有机层，减压浓缩得到白色固体。并向白色固体中加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼于40℃减压干燥4h得产品4.83g，收率65％。m/z：497.6(m+h)+。1hnmr(400mz,dmso):0.92(6h,m)、1.35～1.65(4h,m)、2.10(1h,m)、3.01(2h,q)、3.99(1h,t)、4.01-4.45(2h,m)、4.45(2h,t)、5.46(2h,br)、6.03(1h,t)、7.20-8.02(8h,m)、8.25(1h,d)。实施例5.fmoc-vc-paboh的合成于反应瓶中加入dcm/meoh＝2/1混合溶剂60ml，再加入fmoc-vc2g(4.2mmol)和paboh1.04g(2eq)，搅拌溶解部分后再加入eedq2.0g(2eq)。反应体系在室温条件下避光搅拌反应2.0d。反应完毕后，40℃减压浓缩得到白色固体。收集白色固体，加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，所得白色固体40℃减压干燥得到2.2g，收率约88％。m/z：602.6(m+h)+。1hnmr(400mz,dmso):0.95(6h,m)、1.45～1.69(4h,m)、2.10(1h,m)、3.11(2h,m)、3.99(1h,m)、4.30(2h,d)、4.05～-4.66(2h,m)、4.55(2h,d)、5.21(1h,t)、5.51(2h,br)、6.11(1h,t)、7.09-8.10(12h,m)、8.21(1h,d)、10.51(1h,br)。实施例6.vc-paboh的合成于10mlnmp中加入fmoc-vc-paboh490mg(0.815mmol)搅拌溶解，再加入二乙胺2ml。于室温下搅拌反应24h。反应完毕后，于40℃减压浓缩，所得油状物中加入20mldcm搅拌析晶，过滤，滤饼用dcm洗涤，所得固体减压干燥得到277mg,收率90％。m/z：380.2(m+h)+。1hnmr(400mz,dmso):0.89(6h,m),1.31～1.61(4h,m),1.82(1h,m),2.86(1h,m),2.89(2h,d),4.38(2h,d),4.44(1h,m),5.01(1h,br),5.35(2h,br),5.84(1h,br),7.14(2h,d),7.42(2h,d),8.08(1h,br),9.88(1h,br)。实施例7.mc-vc-paboh的合成于10mlnmp中加入vc-paboh205mg(0.54mmol)和mc-osu184mg(1.1eq)，加毕于室温下搅拌反应24h。反应完毕，于40℃减压浓缩，所得油状物中加入20ml甲基叔丁基醚搅拌析晶。过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，得到310mg产品，收率100％。m/z:573.3(m+h)+。1hnmr(400mz,dmso):0.89(6h,m)、1.15-1.99(10h,m)、2.11(1h,m)、2.31(2h,t)、3.21(2h,m)、3.53(2h,t)、4.32(1h,t)、4.51(1h,m)、4.59(2h,br)、5.24(1h,br)、5.56(2h,br)、6.20(1h,br)、7.12(2h,s)、7.23(2h,d),7.58(2h,d)、7.94(1h,d),8.17(1h,d)、10.21(1h,br)。实施例8.mc-vc-pab-pnp的合成在氮气保护下取mc-vc-paboh168.6mg(0.294mmol)溶于5ml无水吡啶中，反应体系冷却到0℃左右。另取pnp179mg(3eq)溶于5mldcm中，再将其缓慢加入到反应体系中。并于0℃左右保持10min后除去冰浴，再于室温搅拌反应3h。反应完毕，加入70mlea和100ml15％柠檬酸水溶液，分取有机层。有机层依次用柠檬酸，水，饱和食盐水洗涤，再无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干得到浅黄色油状物，加入甲基叔丁基醚析晶得到类白色固体86mg,收率40％。m/z:738(m+h)+。1hnmr(400mz,cdcl3/cd3od):0.84(6h,m)、1.11-1.84(10h,m)、2.05(1h,m)、2.15(2h,t)、3.09(2h,m)、3.32(2h,t)、4.12(1h,m)、4.38(1h,m)、5.15(2h,s)、6.61(2h,s)、6.84(1h,d),7.61(1h,d)、7.21(2h,d),7.50(2h,d)、7.61(2h,d),8.18(2h,d)、9.59(1h,br)。实施例9.mc-vc-pab-mmae的合成于2mldmf中加入20mgmc-vc-pab-pnp(1.5eq)和3mghobt。室温搅拌片刻后，加入13mgmmae，0.5ml吡啶，25uldiea。反应液于室温下搅拌反应2d。反应完毕后，反应液直接用制备柱纯化，收集所需成分浓缩后冻干，得到约10mg产品，收率约42％。m/z:1317.1(m+h)+。实施例10.mc-vc-pab-mmaf的合成按照实施例9的操作，得到mc-vc-pab-mmaf约12.5mg，收率45.2％，m/z:1345.7(m+h)+。实施例11mc-vc-pab-pbd的合成按照实施例9的操作，得到mc-vc-pab-pbd约9.5mg，收率32.5％，m/z:1325.4(m+h)+。实施例12mc-vc-pab-dox的合成按照实施例9的操作，得到mc-vc-pab-dox约11.2mg，收率38.9％，m/z:1143.2(m+h)+。实施例14mc-vc-pab-sn-38的合成将100mg购买的10-o-boc-sn-38用10ml干燥的二氯甲烷溶解后，加入25.6mg(1eq)dmap，于0℃下滴加三光气的二氯甲烷溶液(62mg三光气用2ml二氯甲烷溶解)，滴毕，继续于0℃下反应12h，减压除去二氯甲烷，用10ml干燥的dmf溶解后，加入144mgmc-vc-paboh，转至室温搅拌24h，经过制备液相分离得到mc-vc-pab-sn-3841mg，两步收率总的为19.7％，m/z:1063.2(m+h)+。实施例15、目标抗体的表达与纯化使用freestyletm293-f(invitrogen)悬浮细胞表达目标抗体。转染前一天，以6×105个/ml密度将细胞接种于含300mlf17完全培养基(freestyletmf17表达培养基，gibco公司)的1l摇瓶中，37℃，5％co2，120rpm细胞培养摇床过夜培养。次日，用pei进行抗体表达质粒的转染，其中质粒:pei比例为2:1。转染后一天，按2.5％(v/v)加入tn1补料培养基，继续培养4天后离心收集上清。收集得到的细胞表达上清，经proteina亲和层析柱(mabselectsurelx，ge公司)，以0.1m柠檬酸(ph3.0)洗脱，捕获的抗体用1mtris-hcl(ph9.0)按1/10(v/v)调节至ph7.0，再通过凝胶过滤层析柱sec(superdex200，ge公司)去除多聚体和内毒素等杂质，同时将抗体缓冲液置换成pbs(ph7.4)，收集uv280nm目标峰样品经超滤离心管(30kd，pall公司)浓缩至2mg/ml。通过此方法获得的目标抗体单体(poi％)大于90％，用于后续试验。实施例16、通过偶联2a1-hc-cys439ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的2a1-hc-cys439ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入2a1-hc-cys439ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例17、通过偶联2a1-lc-cys205ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备2a1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的2a1-lc-cys205ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入2a1-lc-cys205ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到2a1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例18、通过偶联2a1-lc-cys206ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备2a1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的2a1-lc-cys206ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入2a1-lc-cys206ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到2a1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例19、通过偶联4d3-hc-cys439ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的4d3-hc-cys439ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入4d3-hc-cys439ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例20、通过偶联4d3-lc-cys205ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的4d3-lc-cys205ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入4d3-lc-cys205ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例21、通过偶联4d3-lc-cys206ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的4d3-lc-cys206ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入4d3-lc-cys206ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例22、通过偶联4e1-hc-cys439ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的4e1-hc-cys439ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入4e1-hc-cys439ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例23、通过偶联4e1-lc-cys205ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的4e1-lc-cys205ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入4e1-lc-cys205ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例24、通过偶联4e1-lc-cys206ins抗体和mc-vc-pab-mmae制备4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品细胞表达的4e1-lc-cys206ins抗体，经过mabselectsure纯化，低ph洗脱后马上加入tris溶液中和，并换液为ph7.5的tris-hcl缓冲液。化合物mc-vc-pab-mmae，白色粉末，将其溶解于dma中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照40倍分子比将1m的dtt水溶液加入4e1-lc-cys206ins抗体溶液中，混匀后20℃反应2小时。反应时间到后将样品的ph调整至5.0，并通过spsepharosef.f.阳离子交换层析去除样品中的dtt和屏蔽物。随后按照20倍分子比将dhaa溶液加入样品中，25℃避光反应4小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-pab-mmae溶液，使得mc-vc-pab-mmae与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应2小时。反应结束后使用spsepharosef.f.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-pab-mmae,得到4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc样品。实施例25、hic-hplc检测毒素比抗体比例dar用高效液相色谱疏水层析方法分析tdc样品，根据对应峰面积计算dar。具体方法如下：色谱柱：hicbu‐np5(5μm,4.6x35mm)；流动相：a:2m硫酸铵，0.025m、ph7的磷酸盐缓冲液；b：0.025m、ph7的磷酸盐缓冲液；c：100％异丙醇；缓冲液a平衡，缓冲液b与缓冲液c梯度洗脱，25℃，214nm和280波长下检测。根据附图1-3计算得到定点偶联dar在1.6-1.7之间，其化合物均一性很好。根据附图4-6计算得到定点偶联dar在1.60-1.95之间，其化合物均一性很好。根据附图7-8计算得到定点偶联dar在1.60-1.90之间，其化合物均一性很好。实施例26、rp-hplc检测毒素比抗体比例darrp-hplc检测毒素比抗体比例dar，采用反相疏水高效液相色谱法分析用dtt处理的样品，根据对应峰面积计算dar。具体方法如下：色谱柱：proteomixrp-1000(5μm,4.6×100mm)流动相：a：0.1％tfa水溶液；b：0.1％乙腈溶液流动相a与流动相b按比例梯度洗脱，80℃，214nm和280波长下检测。根据附图9计算得到定点偶联dar为1.82，其化合物均一性很好。附表1.2a1-lc-v205c-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-lc-cys206ins--mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae的偶联效率dar表.附表1显示，通过半胱氨酸插入突变改造进行定点偶联的tdc化合物偶联效率均较高(理论最高值为2.0)，dar≥1.6。实施例27、sec-hplc检测tdc抗体骨架聚集情况将tdc抗体骨架样品保存于37℃，第0、7、21、29天分别用sec-hplc分析其聚集情况，具体方法如下：色谱柱：tskgelsuperswmabhr(7.8mm×30cm)流动相：0.1m硫酸钠、0.1m，ph6.7的磷酸盐缓冲液。25℃，280nm检测附图10-13，sec-hplc检测tdc抗体骨架4d3、4d3-lc-cys205ins、4d3-lc-cys206ins和4d3-hc-cys439ins的聚集情况，样品于37℃存放4周，聚集体含量基本没有变化。同上述抗体的检测方法，将2a1-lc-v205c-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-lc-cys206ins--mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc进行sec检测。附表2.2a1-lc-v205c-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-lc-cys206ins--mc-vc-pab-mmaetdc和2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae、4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc目标单体含量列表附表2显示，通过半胱氨酸定点偶联的tdc化合物目标单体含量在90％以上。实施例28、经半胱氨酸定点突变和插入突变改造后的骨架抗体与亲本抗体2a1对于egfrviii的亲和力,4e1对于c-met的亲和力，4d3对于trop2的亲和力。用间接elisa法对比2a1-lc-v205c、2a1-lc-cys205ins、2a1-lc-cys206ins、2a1-hc-cys439ins及2a1对于egfrviii的相对亲和力。具体步骤如下：重组egfrviii-his*6抗原包板；鱼皮明胶封闭；分别稀释2a1、2a1-lc-v205c、2a1-lc-cys205ins、2a1-lc-cys206ins和2a1-hc-cys439ins，最高浓度10ug/ml，4倍梯度稀释，共11个浓度；hrp标记的二抗孵育；tmb显色，检测450nm处吸收。检测结果以a450对浓度作图，半胱氨酸定点突变或插入突变后的抗体2a1-lc-v205c、2a1-lc-cys205ins、2a1-lc-cys206ins和2a1-hc-cys439ins保持了与2a1相似的亲和力，ec50值很接近；说明2a1上轻链v205c的定点突变、第205位插入突变或第206位插入突变，或重链第439位插入突变不影响其与egfrviii抗原的亲和力。如附图可见，2a1-lc-v205c、2a1-lc-cys205ins、2a1-lc-cys206ins、2a1-hc-cys439ins抗体保持了2a1与抗原egfrviii的亲和力。实施例29、经半胱氨酸定点突变和插入突变改造后的骨架抗体与tdc对于相应抗原的亲和力。4e1对于c-met的亲和力，4d3对于trop2的亲和力。用间接elisa法对比4e1-lc-cys205ins-mvpm、4e1-lc-cys206ins-mvpm、4e1-hc-cys439ins-mvpm及4e1对于egfrviii的相对亲和力。具体步骤如下：重组c-met-his*10抗原包板；鱼皮明胶封闭；分别稀释4e1-lc-cys205ins-mvpm、4e1-lc-cys206ins-mvpm、4e1-hc-cys439ins-mvpm和4e1，最高浓度10ug/ml，4倍梯度稀释，共11个浓度；hrp标记的二抗孵育；tmb显色，检测450nm处吸收。检测结果以a450对浓度作图，半胱氨酸定点插入突变后偶联得到的tdc4e1-lc-cys205ins-mvpm、4e1-lc-cys206ins-mvpm、4e1-hc-cys439ins-mvpm保持了与亲本抗体4e1相似的亲和力，ec50值很接近；说明4e1轻链第205位插入突变或第206位插入突变，或重链第439位插入突变所得到的tdc不影响其与c-met抗原的亲和力。用间接elisa法对比4d3-lc-cys205ins-mvpm、4d3-lc-cys206ins-mvpm、4d3-hc-cys439ins-mvpm及4d3对于egfrviii的相对亲和力。具体步骤如下：重组trop2-his*10抗原包板；鱼皮明胶封闭；分别稀释4d3-lc-cys205ins-mvpm、4d3-lc-cys206ins-mvpm、4d3-hc-cys439ins-mvpm和4d3，最高浓度10ug/ml，4倍梯度稀释，共11个浓度；hrp标记的二抗孵育；tmb显色，检测450nm处吸收。检测结果以a450对浓度作图，半胱氨酸定点插入突变后偶联得到的tdc4d3-lc-cys205ins-mvpm、4d3-lc-cys206ins-mvpm、4d3-hc-cys439ins-mvpm保持了与亲本抗体4d3相似的亲和力，ec50值很接近；说明4d3轻链第205位插入突变或第206位插入突变，或重链第439位插入突变所得到的tdc不影响其与trop2抗原的亲和力。如图15，4e1-lc-cys205ins-mvpm、4e1-lc-cys206ins-mvpm、4e1-hc-cys439ins-mvpm抗体保持了4e1与抗原c-met的亲和力。如图16，4d3-lc-cys205ins-mvpm、4d3-lc-cys206ins-mvpm、4d3-hc-cys439ins-mvpm抗体保持了4d3与抗原trop2的亲和力。实施例30、细胞毒性药效检测通过下列实验过程测定tdc细胞毒性活性：将tdc分别加入到egfr过量表达或egfrviii表达的人的肿瘤细胞培养基中，细胞培养72小时后测定细胞存活率。基于细胞的体外实验用于测定细胞存活率、细胞毒性和本发明tdc诱导的细胞程序性死亡。通过细胞增殖试验测定抗体-毒素偶联物的体外药效。celltitersolutioncellproliferationassay为商购的(promegacorp.，madison,wi)。aqueousonesolutioncellproliferationassay(a)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒性实验中的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2h-tetrazolium,innersalt；mts]和一种电子偶联剂(phenazineethosulfate；pes)。pes具有增强的化学稳定性，这使它可与mts混合形成稳定的溶液。这种方便的“单溶液”模式，是在第一代celltiterassay的基础上的改进，celltiterassay中使用的电子偶联剂pms与mts溶液是分开提供的。mts(owen’sreagent)被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中(图1)。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的nadph或nadh的作用下完成的。检测时，只需将少量的celltiteraqueousonesolutionreagent直接加入培养板孔的培养基中，孵育1–4小时，然后以酶标仪读取490nm的吸光度值。在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。由于mts的甲臜产物在组织培养基中可溶，celltiteraqueousonesolutionassay与mtt或int法相比操作步骤更少。本发明中采用a431(egfr过表达细胞)、u87-egfrviii(egfr突变体稳定细胞系)、u87-mg(c-met中高度表达的恶性胶质瘤细胞株)和bxpc-3(trop2高度表达的胰腺癌细胞株)作为体外药效检测的研究体系。在96孔板中，进行细胞铺板6000/孔，24小时后，进行抗体加药。a431,u87-egfrviii细胞株对应的各种tdc始浓度为10um,依次按照5倍梯度稀释,u87-mg,bxpc-3细胞株对应的各种tdc始浓度为1um,依次按照5倍梯度稀释。处理72小时后mts检测细胞活性。附表3、tdc、adc对egfrwt过表达细胞系a431及egfrviii表达稳定性株u87-egfrviii细胞毒性ic50检测结果附表3结果显示，2a1-lc-v205c-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-lc-cys205cins-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc、2a1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc对egfrwt过表达细胞系a431及egfrviii表达稳定性株u87-egfrviii细胞毒性活性相当,439位插入的突变的tdc活性略好于205位和206位插入突变的tdc,4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc和4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc在u87-mg细胞毒性活性和偶联位置有一定的关联,439位插入的突变的tdc活性略好于205位和206位插入突变的tdc,tdc的活性要显著好于亲本抗体的活性。4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc和4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc在胰腺癌细胞株bxpc-3上细胞毒性活性上相当,439位插入的突变的tdc活性略好于205位和206位插入突变的tdc，tdc的活性要显著好于亲本抗体的活性。实施例31、血浆稳定性检测取取一定量的adc样品，加入到已去除人igg的人血浆中,每种adc重复2管，放置37℃水浴中孵育,分别孵育0h,72h后，取出adc样品，每管加入proteina(mabselectsuretmlxlot:#10221479ge，用取pbs洗涤过的)100ul，垂直混合仪晃动吸附2h,经过洗涤洗脱步骤,获得孵育后的adc。对孵育特定时间的adc样品进行hic-hplc和rp-hplc检测，判定样品的血浆稳定性。附图21-23，4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc和4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc在人血浆中稳定性的考察结果，其中4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmae的检测方法是rp-hplc,4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmae的检测方法是hic-hplc。附图24-26,4e1-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4e1-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc和4e1-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc、在人血浆中稳定性的考察结果，检测方法为hic-hplc。附表4.tdc血浆稳定性检测结果表(以dar的变化情况计算)上述tdc加入人血浆样品中37℃孵育72小时后均相对稳定，具备良好的成药性。比较而言，439位插入突变的tdc稳定性最佳，205位、206位插入突变的tdc次之。实施例32、荷瘤小鼠药效检测本发明中建立了bxpc-3荷瘤小鼠模型，以评价tdc和亲本抗体的体内药效。即以3×106bxpc-3细胞通过皮下注射到4～6周鼠龄的balb/c裸鼠背部一侧，待小鼠肿瘤平均大小生长至400～500mm3，随机分组，每组5只，在第0天和第7天，4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc和4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc分别以5mg/kg剂量进行单次静脉给药，亲本抗体4d3以5mg/kg剂量给药。数据a显示为测量时肿瘤平均体积±se,数据b显示为测量时小鼠平均体重±se。附图27、4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc和4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc以及4d3亲本抗体在荷瘤小鼠药效上测试结果，相对于亲本抗体，tdc能显著体现出体内抑瘤效果。附图28、4d3-lc-cys205ins-mc-vc-pab-mmaetdc、4d3-lc-cys206ins-mc-vc-pab-mmaetdc和4d3-hc-cys439ins-mc-vc-pab-mmaetdc以及4d3亲本抗体在荷瘤小鼠药效上测试，小鼠体重没有明显的改变，证明tdc体内毒性较小或无体内毒性。本发明并不限于由实施例中披露的具体实施方案的范围，这些实施例用来例示本发明的几个方面，在功能上等效的任意实施方案均属于本发明的范围。实际上，除本文所示和所述的以外，本发明的各种变型对本领域技术人员而言也是显而易见的并且属于本文所附权利要求的范围。序列表<110>四川百利药业有限责任公司<120>半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物<150>cn201610876568.9<151>2016-10-08<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>990<212>dna<213>重链恒定区(fcdna序列)<400>1gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagccc300aaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggga360ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccct420gaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg480tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac540agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag600gagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc660aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgag720ctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc780gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg840ctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg900cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg960cagaagagcctctccctgtctccgggtaaa990<210>2<211>330<212>prt<213>重链恒定区(fc氨基酸序列)<400>2alaserthrleuglyproservalproproleualaproserserleu151015serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvalleualathr202530proproglyprovalthrvalserthralaserglyalaleuthrser354045glyvalhisthrproproalavalleuglyserserglyleuthrser505560leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglythr65707580thrilecysalavalalahisleuproseralathrleuvalalaleu859095alavalglyproleusercysalaleuthrhisthrcysproprocys100105110proalaproglyleuleuglyglyproservalproleupropropro115120125leuproleualathrleumetileseralathrproglyvalthrcys130135140valvalvalalavalserhisglyalaproglyvalleuproalathr145150155160thrvalalaglyvalglyvalhisalaalaleuthrleuproalagly165170175glyglythralaserthrthralavalvalservalleuthrvalleu180185190hisglyalathrleualaglyleuglythrleucysleuvalserala195200205leualaleuproalaproileglyleuthrileserleualaleugly210215220glyproalaglyproglyvalthrthrleuproproseralaalagly225230235240leuthrleualaglyvalserleuthrcysleuvalleuglyprothr245250255proseralailealavalglythrglyseralaglyglyproglyala260265270alathrleuthrthrproprovalleualaseralaglyserpropro275280285leuthrserleuleuthrvalalaleuseralathrglyglyglyala290295300valprosercysservalmethisglyalaleuhisalahisthrthr305310315320glyleuserleuserleuserproglyleu325330<210>3<211>321<212>dna<213>轻链恒定区(kappadna序列)<400>3acggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga60actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgg120aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc180aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaa240cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc300ttcaacaggggagagtgttag321<210>4<211>106<212>prt<213>轻链恒定区(kappa氨基酸序列)<400>4thrvalalaalaproservalproileproproproseralaglygly151015leuleuserglythralaservalvalcysleuleualaalaprothr202530proalaglyalaleuvalglythrleuvalalaalaalaleuglyser354045glyalaserglyglyservalthrglyglyalaserleualaserthr505560thrserleuserserthrleuthrleuserleualaalathrglyleu65707580hisleuvalthralacysglyvalthrhisglyglyleuserserpro859095valthrleuserproalaalaglyglycys100105<210>5<211>324<212>dna<213>2a1-lc-cys205ins轻链恒定区(kappadna序列)<400>5acggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga60actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgg120aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc180aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaa240cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccctgcgtcacaaag300agcttcaacaggggagagtgttag324<210>6<211>107<212>prt<213>lc-cys205ins轻链恒定区(kappa氨基酸序列)<400>6thrvalalaalaproservalproileproproproseralaglygly151015leuleuserglythralaservalvalcysleuleualaalaprothr202530proalaglyalaleuvalglythrleuvalalaalaalaleuglyser354045glyalaserglyglyservalthrglyglyalaserleualaserthr505560thrserleuserserthrleuthrleuserleualaalathrglyleu65707580hisleuvalthralacysglyvalthrhisglyglyleuserserpro859095cysvalthrleuserproalaalaglyglycys100105<210>7<211>324<212>dna<213>lc-cys206ins轻链恒定区(kappadna序列)<400>7acggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga60actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgg120aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc180aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaa240cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtctgcacaaag300agcttcaacaggggagagtgttag324<210>8<211>107<212>prt<213>lc-cys206ins轻链恒定区(kappa氨基酸序列)<400>8thrvalalaalaproservalproileproproproseralaglygly151015leuleuserglythralaservalvalcysleuleualaalaprothr202530proalaglyalaleuvalglythrleuvalalaalaalaleuglyser354045glyalaserglyglyservalthrglyglyalaserleualaserthr505560thrserleuserserthrleuthrleuserleualaalathrglyleu65707580hisleuvalthralacysglyvalthrhisglyglyleuserserpro859095valcysthrleuserproalaalaglyglycys100105<210>9<211>993<212>dna<213>igg1-fc-cys439ins重链恒定区(fcdna序列)<400>9gctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctggg60ggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcg120tggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctca180ggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacc240tacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagccc300aaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctgggggga360ccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccct420gaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactgg480tacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaac540agcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaag600gagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctcc660aaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgag720ctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatc780gccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtg840ctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg900cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacg960cagaagagcctctcctgcctgtctccgggtaaa993<210>10<211>331<212>prt<213>igg1-fc-cys439ins重链恒定区(fc氨基酸序列)<400>10alaserthrleuglyproservalproproleualaproserserleu151015serthrserglyglythralaalaleuglycysleuvalleualathr202530proproglyprovalthrvalserthralaserglyalaleuthrser354045glyvalhisthrproproalavalleuglyserserglyleuthrser505560leuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglythr65707580thrilecysalavalalahisleuproseralathrleuvalalaleu859095alavalglyproleusercysalaleuthrhisthrcysproprocys100105110proalaproglyleuleuglyglyproservalproleupropropro115120125leuproleualathrleumetileseralathrproglyvalthrcys130135140valvalvalalavalserhisglyalaproglyvalleuproalathr145150155160thrvalalaglyvalglyvalhisalaalaleuthrleuproalagly165170175glyglythralaserthrthralavalvalservalleuthrvalleu180185190hisglyalathrleualaglyleuglythrleucysleuvalserala195200205leualaleuproalaproileglyleuthrileserleualaleugly210215220glyproalaglyproglyvalthrthrleuproproseralaalagly225230235240leuthrleualaglyvalserleuthrcysleuvalleuglyprothr245250255proseralailealavalglythrglyseralaglyglyproglyala260265270alathrleuthrthrproprovalleualaseralaglyserpropro275280285leuthrserleuleuthrvalalaleuseralathrglyglyglyala290295300valprosercysservalmethisglyalaleuhisalahisthrthr305310315320glyleuserleusercysleuserproglyleu325330<210>11<211>321<212>dna<213>lc-v205c轻链恒定区(kappadna序列)<400>11acggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctgga60actgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtgg120aaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc180aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaa240cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccctgcacaaagagc300ttcaacaggggagagtgttag321<210>12<211>106<212>prt<213>lc-v205c轻链恒定区(kappa氨基酸序列)<400>12thrvalalaalaproservalproileproproproseralaglygly151015leuleuserglythralaservalvalcysleuleualaalaprothr202530proalaglyalaleuvalglythrleuvalalaalaalaleuglyser354045glyalaserglyglyservalthrglyglyalaserleualaserthr505560thrserleuserserthrleuthrleuserleualaalathrglyleu65707580hisleuvalthralacysglyvalthrhisglyglyleuserserpro859095cysthrleuserproalaalaglyglycys100105当前第1页12