本发明属于降糖药物技术领域，尤其涉及一种超声波辅助法提取大孔树脂分离黄酮类化合物的方法。
背景技术：
目前，中国糖尿病患者数量已超过一亿，已成为仅次于印度位居世界第二的糖尿病国家。其中ⅱ型糖尿病病发率非常严峻，对于糖尿病患者病发率急剧上升的趋势，研究具有降血糖功效的特效药物已迫在眉睫。神秘果含有奇特的神秘果素，是一种变味糖蛋白，能改变人的味觉，使原本酸度强烈的食物变成琼浆玉露般的甘甜，因而又被称为奇迹果、梦幻果。神秘果(synsepalumdulcificum)系山榄科神秘果属，中国云南、海南、广东和福建等地区种植。神秘果叶含有较高的多糖、蛋白质、纤维和矿物质元素等成。其有降低糖尿病和高血压等作用，还可以使胃口变好、降低胃酸、促进消化等功效。其性寒、味苦可入药，有清热燥湿的作用，而且还可以止泻，对手机辐射也有一定的预防作用。神秘果叶可用于治疗糖尿病、高血压、尿酸和动脉硬化的天然药物，并且能够提高免疫力，增强肝胆功能。神秘果茎的功能成分具有抑制黑色素瘤和降低蘑菇络氨酸酶的功效。神秘果除了具有改变味觉功能外，还具有改善胰岛素抵抗及抗氧化能力。神秘果种子可以降低糖尿病小鼠空腹血糖值，促进胰岛素的正常分泌。神秘果含有奇特的神秘果素，是一种变味糖蛋白，能改变人的味觉，使原本酸度强烈的食物变成琼浆玉露般的甘甜，因而又被称为奇迹果、梦幻果。神秘果(synsepalumdulcificum)系山榄科神秘果属，中国云南、海南、广东和福建等地区种植。植物多酚是一类具有独特生理功能和药物活性的植物次生代谢产物，大量研究表明，植物多酚在抗氧化、抗诱变，抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗病毒和预防中风等诸多方面具有显著功效，因而在医药、生化、食品及日用化工等领域具有广阔的开发前景。中国目前糖尿病患者数量已超过四千万，已成为仅次于印度位居世界第二的糖尿病国家。其中ⅱ型糖尿病病发率非常严峻，对于糖尿病患者病发率急剧上升的趋势，研究具有降血糖功效的特效药物已迫在眉睫。
综上所述，现有技术存在的问题是：糖尿病患者病发率逐渐增多，急需更多的降血糖药物，而神秘果不仅营养丰富，且叶子具有很高的药用价值，但目前并没有较为深入的黄酮成分研究报道。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种超声波辅助法提取大孔树脂分离黄酮类化合物的方法。
本发明是这样实现的，一种超声波辅助法提取大孔树脂分离黄酮类化合物的方法，所述超声波辅助法提取神秘果叶黄酮类化合物方法包括：通过采集新鲜神秘果叶，晾干，粉碎过筛60目抽滤，离心分离，减压浓缩得到浓缩物；取一定浓度的神秘果叶黄酮类化合物的溶液，调节ph＝6.0，用恒流泵以40rpm恒流上样放入预处理好的hpd500型大孔树脂中；以水、10-20％乙醇溶液、50-60％乙醇溶液、70-80％乙醇溶液、无水乙醇进行梯度动态洗脱，每次洗脱直至流出液变为无色为止。
进一步，所述方法同时利用高效液相色谱分析各洗脱部位的主要化学成分为：水洗脱液的主要成分：表儿茶素衍生物和黄酮衍生物；50-60％乙醇洗脱液主要成分：表儿茶素、表儿茶素衍生物、对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物；70-80％乙醇洗脱液主要成分：对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物。
进一步，所述方法包括以下步骤：
步骤一，神秘果采集，晾干，粉碎过筛60目备用；
步骤二，利用超声波辅助法提取神秘果叶黄酮类化合物，抽滤，离心分离，减压浓缩，备用。
步骤三，将预处理好的hpd500型大孔树脂，湿法装入层析柱中。取200ml2.0mg/ml的神秘果叶黄酮类化合物的溶液(50-60％乙醇溶剂溶解)，调节ph＝6.0，用恒流泵以40rpm恒流上样，动态吸附后测定流出液的体积及浓度(即吸光度值)。再分别以水、10-20％乙醇溶液、50-60％乙醇溶液、70-80％乙醇溶液、无水乙醇进行梯度动态洗脱，每次洗脱直至流出液变为无色为止。分别收集洗脱液，减压浓缩，备用。
步骤四，利用高效液相色谱分析各洗脱部位的主要化学成分。
色谱条件：色谱柱：c18；柱温：30℃，流动相：水:甲醇2:8，进样量：50ul；流速：1ml/min；检测波长：208nm、254nm。
标准品的制备：精密称取5mg熊果酸、表儿茶素、芦丁、没食子酸、柚皮素、槲皮素、绿原酸、齐墩果酸、对羟基肉桂酸、儿茶素等标准样品及混合标样，水、60％、80％洗脱部位，用5ml无水甲醇(分析纯)完全溶解，进行成分分析。
本发明的另一目的在于提供一种由所述超声波辅助法提取具有降糖功效的神秘果叶黄酮类化合物。
本发明的优点及积极效果为：通过超声波辅助法提取神秘果叶中黄酮类的化合物，探讨对α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的抑制活性以及对链脲佐菌素(streptozotocin,stz)诱导的ⅱ型糖尿病雄性昆明小鼠的降血糖作用，从而得出神秘果叶具有降血糖的功效，为我国乃至全世界糖尿病的治疗提供更多帮助。
本发明提取的神秘果叶黄酮类化合物具有降血糖功效，其活性优于格列本脲组。
附图说明
图1是本发明实施例提供的超声波辅助法提取神秘果叶黄酮类化合物的制备方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明主要是利用超声波辅助法提取具有降糖功效的神秘果叶黄酮类化合物。通过采集新鲜神秘果叶，晾干，粉碎过筛60目抽滤，离心分离，减压浓缩得到浓缩物。取一定浓度的神秘果叶黄酮类化合物的溶液，调节ph＝6.0，用恒流泵以40rpm恒流上样放入预处理好的hpd500型大孔树脂中。以水、10-20％乙醇溶液、50-60％乙醇溶液、70-80％乙醇溶液、无水乙醇进行梯度动态洗脱，每次洗脱直至流出液变为无色为止。其中，50-60％乙醇能较好的抑制α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的活性以及对链脲佐菌素(streptozotocin,stz)诱导的ⅱ型糖尿病雄性昆明小鼠的降血糖作用。
同时，利用高效液相色谱分析各洗脱部位的主要化学成分为：水洗脱液的主要成分：表儿茶素衍生物和黄酮衍生物；50-60％乙醇洗脱液主要成分：表儿茶素、表儿茶素衍生物、对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物；70-80％乙醇洗脱液主要成分：对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的超声波辅助法提取神秘果叶黄酮类化合物的制备方法包括以下步骤：
s101：神秘果采集，晾干，粉碎过筛60目备用；
s102：利用超声波辅助法提取神秘果叶黄酮类化合物，抽滤，离心分离，减压浓缩，备用；
s103：大孔树脂洗脱分离，得到含有表儿茶素、表儿茶素衍生物、对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
(1)神秘果叶于2013年7月采集于海南省保亭县，经海南师范大学生命科学学院钟琼心高级实验师鉴定为神秘果的叶。晾干，粉碎过筛60目备用。
(2)根据最佳提取工艺条件，利用超声波辅助法提取神秘果叶黄酮类化合物，抽滤，离心分离，减压浓缩，备用。
(3)将预处理好的hpd500型大孔树脂，湿法装入层析柱中。取200ml2.0mg/ml的神秘果叶黄酮类化合物的溶液(60％乙醇溶剂溶解)，调节ph＝6.0，用恒流泵以40rpm恒流上样，动态吸附后测定流出液的体积及浓度(即吸光度值)。再分别以水、20％乙醇溶液、60％乙醇溶液、80％乙醇溶液、无水乙醇进行梯度动态洗脱，每次洗脱直至流出液变为无色为止。分别收集洗脱液，减压浓缩，备用。
本发明提供用超声波提取神秘果叶中黄酮类化合物的方法，及对比水、60％乙醇和80％乙醇洗脱物的洗脱效果，其中60％乙醇能较好的抑制α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的活性。
本发明利用高效液相色谱分析各洗脱部位的主要化学成分为：表儿茶素、表儿茶素衍生物、对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物等。
下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。
1、sdlf水洗脱物对ⅱ型糖尿病小鼠的降血糖作用
选正常的5只小鼠作为正常对照组z。将造模成功的糖尿病小鼠，按血糖值、体重分为5组，每组5只，即高剂量组t1(灌胃400mg/kgsdlf水洗脱物)、中剂量组t2(灌胃200mg/kgsdlf水洗脱物)、低剂量组t3(灌胃100mg/kgsdlf水洗脱物)、阳性对照组t4(注射110mg/kg格列本脲)、模型组t5(喂生理盐水)。各个实验组每天都喂以相应的药物剂量，连续灌胃12天。正常对照组和模型组t5则喂以生理盐水。让小鼠自由进食、饮水，记录饮水量。每3-5天测一次小鼠的体重和血糖值(空腹时尾静脉采血)并记录。
实验后期，对各个组小鼠眼眶取血，离心分离，取上清液，根据谷丙转氨酶(alt/gpt)测定试剂盒说明书测定各个组小鼠血清中含有的gpt/卡门氏单位。脱颈处死，解剖取出肝脏、心、腰、胰腺等组织器官，用生理盐水洗去血水，吸干，称重，记录数据。肝脏捣碎，根据总抗氧化(t-aoc)测定试剂盒、肝糖原测定试剂盒说明书测定小鼠肝脏的总抗氧化能力及肝脏中肝糖原的含量。
表1不同浓度sdlf对ⅱ型糖尿病小鼠体重的影响
由表1可以看出，10天期间，除中剂量组t2小鼠外，其他小鼠的体重总体均增加了，但与正常组z比较，其中经过stz诱导形成ⅱ型糖尿病的小鼠的体重增加缓慢；与模型组比较，其中给药小鼠的体重增加不显著，还出现体重降低的例子(中剂量组t2)。综上所述，sdlf可能具有抑制体重增长的作用，有待验证。
2、不同浓度sdlf对ⅱ型糖尿病小鼠血糖值的影响
表2不同浓度sdlf对ⅱ型糖尿病小鼠血糖值的影响
由表2可以看出，与阳性对照组t4比较，各sdlf给药组的降血糖效果更显著，其中sdlf中剂量组t2表现出极显著的降血糖作用；与正常组比较，在第3、7、12天，各给药组都表现出显著的降血糖作用，第3、7天模型组t5小鼠也通过自身机能调节降低了血糖，但在第12天，血糖值又升高，说明ⅱ型糖尿病小鼠不能通过自身机能调节治愈ⅱ型糖尿病，还得需要药物的治疗。
sdlf剂量组中，高剂量组导致gpt高于正常值40，但总体来说，sdlf剂量组中、低剂量组不会引起小鼠的gpt增高。相对于阳性对照组和模型组，sdlf剂量组可降低gpt水平值。
与正常组小鼠比较，给药组的抗氧化能力都降低，其中sdlf剂量组剂量的降低总抗氧化能力也随之降低。与阳性对照组比较，sdlf剂量组的总抗氧化能力比其小。
与正常组z比较，各sdlf给药组小鼠肝脏中肝糖原的含量都上升了，其中sdlf中剂量组小鼠肝脏中肝糖原的含量较高，综合3.5节的结论：sdlf中剂量组t2与其他给药组相比，具有极显著的降血糖作用，说明小鼠把糖转化为肝糖原储存到肝脏中了。
3、不同梯度洗脱物质对正常小鼠的降糖作用
将购回的小鼠适应性饲养一周后，预选9只健康小鼠，测其血糖值，3只一组，每组分别灌胃以水、60％乙醇溶液、80％乙醇溶液洗脱下来的物质50mg/kg。每隔30min测一次血糖值(30min、60min、90min、120min)。
各洗脱部位都能使小鼠血糖值降低的降糖作用。但是水洗脱物先使小鼠的血糖值上升再下降，由于用水洗脱大孔树脂上被吸附的黄酮类化合物，有大量的糖份被洗下来，所以水洗脱物中含糖量高，导致了小鼠在60min前的血糖升高了，但后面药物起了药效，使小鼠的血糖值降低了且效果明显。
4、不同梯度洗脱物质对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性
各样品对a-葡萄糖苷酶的抑制活性顺序为：60％洗脱物>80％洗脱物>水洗脱物>芦丁。计算得水洗脱物、60％及80％乙醇洗脱物的ic50值分别为1.98mg/ml、1.04mg/ml、1.20mg/ml。
比较各样品对α-淀粉酶的抑制活性强弱，在1～3mg/ml之间，各样品对α-淀粉酶的抑制活性顺序为：芦丁>60％乙醇洗脱物>80％乙醇洗脱物>水洗脱物。
高效液相色谱分析各洗脱部位的主要化学成分为：水洗脱液的主要成分：表儿茶素衍生物和黄酮衍生物；60％乙醇洗脱液主要成分：表儿茶素、表儿茶素衍生物、对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物；80％乙醇洗脱液主要成分：对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物。神秘果叶黄酮类化合物的降糖活性优于格列本脲组，sdlf剂量组中200mg/kg剂量组的降血糖作用效果极显著。sdlf剂量组中，低剂量组不会引起小鼠的gpt增高。抗氧性随sdlf剂量增大而增大，sdlf剂量组相对正常组、模型组和阳性对照组有利于增加小鼠肝脏中肝糖原含量。神秘果叶黄酮类化合物经过大孔树脂吸附和洗脱得到水、60％乙醇和80％乙醇洗脱物，其中60％乙醇能较好的抑制α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的活性。
利用超声波辅助法提取神秘果叶黄酮类化合物。通过抽滤，离心分离，减压浓缩得到浓缩物。取一定浓度的神秘果叶黄酮类化合物的溶液，调节ph＝6.0，用恒流泵以40rpm恒流上样放入预处理好的hpd500型大孔树脂中。以水、20％乙醇溶液、60％乙醇溶液、80％乙醇溶液、无水乙醇进行梯度动态洗脱，每次洗脱直至流出液变为无色为止。其中，60％乙醇能较好的抑制α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的活性。
同时，利用高效液相色谱分析各洗脱部位的主要化学成分为：水洗脱液的主要成分：表儿茶素衍生物和黄酮衍生物；60％乙醇洗脱液主要成分：表儿茶素、表儿茶素衍生物、对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物；80％乙醇洗脱液主要成分：对羟基肉桂酸、芦丁衍生物和黄酮衍生物。
本发明涉及研究神秘果叶黄酮类化合物(synsepalumdulcificumleavesflavonoids，sdlf)对α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的抑制活性以及对链脲佐菌素(streptozotocin,stz)诱导的ⅱ型糖尿病雄性昆明小鼠的降血糖作用。将动物实验分为正常组和糖尿病小鼠组，糖尿病小鼠按血糖值、体重分为5组，高剂量组、中剂量组、低剂量组、阳性对照组、模型组。各个实验组每天都喂以相应的药物剂量，连续灌胃12天后测定小鼠血清中的gpt、肝脏中的总抗氧化能力及肝糖原含量，而血糖值每隔3-5天测定一次；实验结果表明神秘果叶黄酮类化合物的降糖活性优于格列本脲组，sdlf剂量组中200mg/kg剂量组的降血糖作用效果极显著。sdlf剂量组中、低剂量组不会引起小鼠的gpt增高。抗氧性随sdlf剂量增大而增大，sdlf剂量组相对正常组、模型组和阳性对照组有利于增加小鼠肝脏中肝糖原含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。