以蛋黄极性脂质为基础制备的纳米药物载体的制作方法

本发明属肿瘤临床诊断、治疗领域，具体涉及一种能用于肿瘤诊断及靶向治疗的脂质纳米载体，本发明还涉及该载体在药物递送方面的应用。

背景技术：

肿瘤成为当今社会威胁人类生命健康的头号杀手，每年约1400万人受累，寻求新的靶向治疗手段仍是目前肿瘤治疗中亟待解决的关键问题。随着纳米科技的进步，纳米材料介导的肿瘤靶向治疗手段也受到了广泛的关注，它不仅可增加药物的溶解性，降低药物的清除率，最重要的是可减少化疗药物本身对正常组织器官的毒副作用。目前，从无机的金、银、二氧化硅、介孔氧化钽等纳米载体到有机的dotap/dope、peg等，越来越多的纳米材料应用到了生物医药领域，但化学合成纳米材料本身对机体的毒性进一步限制了纳米载体的临床应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于：1、提供一种负载肿瘤化疗药物、小分子核酸的新型天然脂质来源的纳米载体eylns；

2、提供上述纳米载体在肿瘤化疗药物、小分子核酸、荧光染料等负载方面的应用；3、提供制备上述纳米载体的制备方法。

本发明的技术解决方案是该纳米药物载体的制备方法包括以下步骤：

(1)蛋黄极性脂质提取：脂质提取采用极性脂质提取试剂盒(lipidextractionandpolar/neutrallipidseparationcombokit,cellbiolabs,inc.lot:12520164)提取，提取脂质经氮气吹干后备用；

(2)纳米药物载体制备：于干燥后的脂质(含200nmol磷脂的脂质)玻璃安剖瓶中加入400μl的双蒸水，然后置于水浴超声中超声60min至透亮，每10min暂停5min，再将其通过200nm孔径的滤膜反复滤过后备用；取上述新鲜制备的eylns载体溶于约500μl的双蒸水中，然后将其置于检测样品池中，通过nicomp380z3000粒度分析仪分析载体的粒径及zetapotential分布情况。

其中，以该纳米载体为核心，制备负载其它诊断制剂的载体体系。

其中，以该纳米载体为核心，制备负载其它治疗性制剂的载体体系。

其中，所述载体在肿瘤诊断试剂开发中的应用。

其中，所述的载体在肿瘤治疗中的应用。

本发明的优点是：通过蛋黄脂质制备获得了一种新的“绿色”纳米载体eylns(eggyolklipidsderivednanovectors，eylns)，前期数据证实该载体制备工艺简单、成本低廉、对机体的毒副作用小，且可高效负载化疗药物、小分子核酸药物及荧光染料等，是一种具有巨大潜在应用价值的新型纳米药物载体。

附图说明

图1是蛋黄极性脂质纳米载体及载体粒径、表面电势分析；将水浴超声制备的纳米载体进行拍照，并行粒度仪检测发现其粒径约200nm，表面电势约-45mv，较为稳定。

图2是载体体外毒性分析。

图3是携带化疗药物及核酸制剂的载体及分析图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案，但实施例不能理解为是对技术方案的限制。

实施例：依以下步骤制备纳米药物载体

(1)蛋黄极性脂质提取：脂质提取采用极性脂质提取试剂盒(lipidextractionandpolar/neutrallipidseparationcombokit,cellbiolabs,inc.lot:12520164)提取，提取脂质经氮气吹干后备用；

(2)纳米脂质载体制备：于干燥后的脂质(含200nmol磷脂的脂质)玻璃安剖瓶中加入400μl的双蒸水，然后置于水浴超声中超声约60min(每10min暂停5min)至透亮，再将其通过200nm孔径的滤膜反复滤过后备用；取新鲜制备的eylns载体溶于约500μl的双蒸水中，然后将其置于检测样品池中，通过nicomp380z3000粒度分析仪分析载体的粒径及zetapotential分布情况。

载体eylns体外细胞毒性分析：将不同浓度的eylns(5、10、20μg/ml)与体外培养的肿瘤细胞如人结肠癌细胞hct116、食管癌细胞eca109及白血病细胞molt4等孵育不同时间，通过实时无标记检测技术检测其对细胞增殖能力的影响，同时通过流式细胞术利用annexinv/pi凋亡检测试剂盒检测其对细胞凋亡的检测。

载体eylns体内细胞毒性分析：将不同量的eylns(5、10、20μg/kg)分别注射正常小鼠，注射后24h取小鼠外周血及脾脏，分别检测其中免疫细胞分群(cd4，cd8t细胞，b细胞，dc细胞，粒细胞)变化及血清中细胞因子表达谱的变化。

载体eylns负载化疗药物、小分子核酸制剂(sirna、mirna)及荧光染料：取1μmol蛋黄来源极性脂质，20μg多柔比星(做化疗药物代表)或叶酸，通过水浴超声(60min，每10min暂停5min)制备获得携带多柔比星的蛋黄脂质纳米载体eylns-dox，超速离心(36000rpm，30min)去除游离的多柔比星；负载荧光染料的方法同上；负载小分子核酸制剂时，取2μg小分子核酸于含有1μmol蛋黄来源极性脂质中，350mj/cm2紫外照射后置于水浴超声器中超声，36000rpm，离心30min去除游离的小分子核酸。

结果显示：我们制备获得了粒径约200nm的脂质载体，其表面电势约-45mv，较为稳定；另外，该载体体外对细胞的增殖、凋亡没有影响，也不会改变正常小鼠免疫细胞及细胞因子的数量及表达；同时，该载体可高效的负载肿瘤化疗药物如多柔比星，小分子核酸如sirna、mirna，荧光染料如dir，是一种极具潜力的脂质纳米载体，具有良好的临床应用前景。

图1是蛋黄极性脂质纳米载体及载体粒径、表面电势分析；将水浴超声制备的纳米载体进行拍照，并行粒度仪检测发现其粒径约200nm，表面电势约-45mv，较为稳定；图2是载体体外毒性分析。

技术特征：

技术总结
本发明公开了一种以蛋黄极性脂质为基础制备的纳米药物载体，该纳米载体以蛋黄极性脂质为基础，制备获得具有负载化疗药物、小分子核酸药物如siRNA、miRNA等能力的纳米载体，该载体制备工艺简单、成本低廉、对机体的毒副作用小，是一种具有巨大潜在应用价值的纳米药物载体，具有广泛的临床应用前景。

技术研发人员：王其龙;张莉;尹凤娟;姚梦础
受保护的技术使用者：淮安市第一人民医院
技术研发日：2017.10.30
技术公布日：2018.03.23