一种益生菌组合物、制剂、菌泥和用途的制作方法

本发明涉及医药生物领域，具体涉及一种益生菌组合物、制剂、菌泥和用途。
背景技术：
：医学上将围绕并覆盖在牙齿周围的软组织称为牙龈，发生于牙龈组织的急慢性炎症称为牙龈炎(gingivitis)。表现为牙龈出血，红肿，胀痛，继续发展侵犯硬组织，产生牙周炎，包括牙龈组织的炎症及全身疾病在牙龈的表现。牙周病是指发生在牙支持组织(牙周组织)的疾病，包括仅累及牙龈组织的牙龈病和波及深层牙周组织(牙周膜、牙槽骨、牙骨质)的牙周炎两大类。牙周疾病是常见的口腔疾病，是引起成年人牙齿丧失的主要原因之一，也是危害人类牙齿和全身健康的主要口腔疾病。牙周病的早期症状不易引起重视，造成牙周组织长期慢性感染，炎症反复发作，不仅损害口腔咀嚼系统的功能，还会严重影响健康。因此，研发一种新型的治疗牙部疾病的药物具有非常现实的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种益生菌组合物，该益生菌组合物有利于破坏的牙槽骨再生，同时能抑制牙周致病菌的生长，在一定程度上可以预防和治疗牙周炎能够有效抑制牙周病，解决现代人牙齿不健康的问题。还提供了一种制剂、菌泥和用途。本发明通过下述技术方案实现：一种益生菌组合物，包括嗜酸乳杆菌、唾液链球菌m18、唾液链球菌k12。以菌落数计，嗜酸乳杆菌为10-30％，唾液链球菌m18为10-50％，唾液链球菌k12为20-80％。以菌落数计，由嗜酸乳杆菌为10％，唾液链球菌m18为10％，唾液链球菌k12为80％组成。一种益生菌制剂，由前所述的益生菌组合物和药学上可接受的载体或辅料制成。益生菌制剂，为益生菌凝胶剂或者益生菌口颊片。一种益生菌菌泥，由前所述的益生菌组合物经培养离心洗涤制得。益生菌制剂为益生菌凝胶剂时，由前所述的益生菌组合物制备成菌泥后或经培养后离心洗涤制得的菌泥与凝胶基质混合制得。凝胶基质为高分子凝胶材料、生物粘附材料、保湿剂、蒸馏水组成，所述的高分子材料为卡波姆、泊洛沙姆、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素钠、壳聚糖中的一种或几种；所述的生物粘附材料为透明质酸钠、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述的保湿剂为甘油、丙二醇聚乙二醇、丙三醇、山梨醇中的一种或几种。益生菌制剂为益生菌口颊片时，将前所述的益生菌组合物制备得益生菌组合物冻干粉，再将辅料与益生菌冻干粉混合后直接压片制得。一种如前所述的益生菌组合物在制备治疗牙周炎或牙周病药物上的用途。本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：本发明混合益生菌相互之间的激发和抑制作用给予了牙齿健康生存的口腔环境，混合益生菌在抑制有害菌的同时，还赋予各个益生菌成员之间正向激励的作用，使得牙齿生长的口腔健康环境得以平衡，激发和促进人本体的口腔免疫功能，对牙周病和牙龈炎均有防治作用。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：图1为本发明的对比实验结果小鼠牙槽骨丧失图。图2为本发明的厌氧菌计数图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。实施例1嗜酸乳杆菌为4×108cfu，唾液链球菌m18为4×108cfu，唾液链球菌k12为2×108cfu。实施例2嗜酸乳杆菌为1×108cfu，唾液链球菌m18为1×108cfu，唾液链球菌k12为8×108cfu。由实施例1-2的益生菌组合物和药学上可接受的载体可制成益生菌制剂。实施例1-2中的益生菌组合物的单位不局限于108cfu，在107cfu～1010cfu。如一种实施为益生菌凝胶剂，另一种实施为益生菌口颊片。为进一步说明本发明的有益效果，发明人特意做了几组对比实验。对比内容如下：用以下对比例作为对比组。对比例1嗜酸乳杆菌1×108cfu对比例2唾液链球菌k12为8×108cfu对比例3唾液链球菌m18为1×108cfu对比例4嗜酸乳杆菌3.5×108cfu、唾液链球菌m18为5.5×108cfu、唾液链球菌k12为1×108cfu。实验内容如下：1、实验材料1.1实验设备和器械厌养菌培养箱、台式离心机、光学显微镜、显微照相系统型、牙科专用手术器械一套。1.2实验试剂厌氧血琼脂平板、pbs磷酸盐缓冲剂、4％多聚甲醛溶液、亚甲蓝染色剂。1.3实验方法1.3.1动物实验及分组将spf级c57bl/6雄性小鼠80只，随机分成8组即:空白组(未处理组)，模型组(结扎牙线后给予溶剂组)及给药组1-6(结扎牙线后给予益生菌组；给药组1对应对比例1，给药组2对应对比例2，给药组3对应对比例3，给药组4对应实施例1，给药组5对应实施例2，给药组6对应对比例4。各组小鼠均用4％水合氯醛(0.1ml/10g，腹腔注射)麻醉，正常对照组不作干预待其苏醒，其余7组均采用丝线围绕左上第二磨牙结扎。从实验当天起空白组喂食水不做其他处理；模型组给予溶剂0.07ml/次，一天两次；1.3.2结扎定位小鼠用丝线结扎上颌左侧第二磨牙，同时相对一侧不做处理，作为骨高度测量基线，且保持实验全程丝线不脱落。每周检查一次丝线，失去丝线的小鼠进行标记并重新结扎，所有小鼠共观察4周，在第4周处死小鼠，观察牙釉质牙骨质界至牙槽嵴顶距离，并取丝线培养细菌。1.3.3骨丧失观察将小鼠处死，取其上颚并于显微镜下去其软组织后固定于4％多聚甲醛溶液中固定后，牙齿于1％亚甲蓝中染色。在尼康smz800显微镜40×光镜下观察骨丧失情况，即釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离，同时照片记录小鼠上颌骨骨丧失情况。1.3.4细菌测定将实验小鼠处死，取下丝线用pbs磷酸盐缓冲液冲洗掉食物残渣后，加入1mlpbs离心。再将细菌提取液稀释几倍后种于血琼脂培养基中，37℃厌氧环境下培养7d，记录下cfu数据，通过丝线对应长度计算cfu/mm。1.3.5数据分析方法应用instat方差分析和多重比较检验法，采用t检验比较各组间骨吸收的差异。以p<0.05为差异有统计学意义。2实验结果2.1牙槽骨骨吸收结果图1显示，空白组大鼠牙周组织正常，釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离非常低，而模型组与空白组相比，第二磨牙牙槽骨骨吸收明显高于基线水平。给药组1、2、3、6其釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离与模型组相比有一定降低，给药组4、5与模型组相比釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离大大减少。给药组1、2、3与给药4、5相比釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离明显增加，给药组6与给药组4、5相比釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离增加很多，说明第一：实施例1和2给出的益生菌组合物相对于单个组份具有显著的有益效果；第二，非本发明配比范围的组合物并不一定能够达到单组份的效果，因为给药组6与给药组2相比釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离有所增加。2.2细菌计数由图2，给药组1-6厌氧菌数量较低，其中给药组1、3、6有显著差异(*p＜0.05)，给药组2、4、5有极显著差异(**p＜0.01)，且给药组4、5抑菌效果最佳，给药组均显示出较强的牙周厌氧致病菌抑制作用。由以上的对比实验总结可知，牙周炎是细菌菌斑生物膜导致的一种以骨吸收、软组织炎症为主要表现的慢性、破坏性疾病，治疗不及时，最终导致牙齿拔除。本实验进行了4周的动物实验，通过丝线结扎小鼠左上颌第二磨牙牙颈部的方法创建模型，观察牙槽骨骨吸收程度。实验包括8组：空白组、模型组和给药组1-6，在第4周并比较各组釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离作为牙槽骨丧失的指标。给药组釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离与模型组相比大大降低，尤其是给药组(实施例1组)、给药组5(实施例2组)有显著差异，可见混合益生菌组合对丝线结扎诱导的小鼠牙槽骨丧失有显著的缓解作用，使牙槽骨能够再生。此外，已证实的牙周致病菌包括牙龈卟啉单胞菌、伴放线聚集杆菌、福赛坦氏菌、粘放线菌、齿垢密螺旋体、具核梭杆菌、中间普氏菌等厌氧菌。给药组的厌氧菌数量较模型组厌氧菌数量大大减少，可见混合益生菌组合对小鼠口腔中的厌氧菌有较强的抑制作用。出现这样的结果可能是，组合中不同益生菌对口腔有害菌抑制作用不同，不同比例的混合益生菌之间的协同作用也各有差异，在一定比例范围内，混合益生菌之间相互作用，相互促进，起到群体的协同作用，使得其抑制有害菌的生长繁殖作用比单独使用益生菌的抑菌作用大大增强，给予了牙齿健康生存的口腔环境。综上所述，混合益生菌组合有利于破坏的牙槽骨再生，同时能抑制牙周致病菌的生长，在一定程度上可以预防和治疗牙周炎。实施例5益生菌凝胶剂一种益生菌凝胶剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)益生菌菌泥的制备：取益生菌菌种于bhi液体培养基中，5％co2、37℃条件下，厌氧环境中培养12h，益生菌培养液以3000r/min的转速离心10min，反复用生理盐水洗涤，得到益生菌菌泥。(2)凝胶基质：凝胶基质由高分子凝胶材料、生物粘附材料、保湿剂、蒸馏水组成，所述的高分子材料为卡波姆、泊洛沙姆、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素钠、壳聚糖中的一种或几种；所述的生物粘附材料为透明质酸钠、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠中的一种或几种；所述的保湿剂为甘油、丙二醇聚乙二醇、丙三醇、山梨醇中的一种或几种。表1组成用量/份菌泥10卡波姆500三乙醇胺1甘油50透明质酸20蒸馏水1000(1)益生菌菌泥的制备：取益生菌菌种于bhi液体培养基中，5％co2、37℃条件下，厌氧环境中培养12h，益生菌培养液以3000r/min的转速离心10min，反复用生理盐水洗涤，得到益生菌菌泥。(2)凝胶基质：卡波姆分散于蒸馏水中溶胀，浓度为1-10％，加入三乙醇胺调ph至4-12，加入甘油，加入透明质酸，搅拌均匀，得到凝胶基质。(3)将益生菌菌泥用蒸馏水分散，于凝胶基质混合，搅拌均匀，得到益生菌凝胶。实施例6表2(1)益生菌菌泥的制备：取益生菌菌种于bhi液体培养基中，5％co2、37℃条件下，厌氧环境中培养12h，益生菌培养液以3000r/min的转速离心10min，反复用生理盐水洗涤，得到益生菌菌泥。(2)凝胶基质：泊洛沙姆分散于蒸馏水中溶胀，浓度为1-10％，加入甘油，加入透明质酸，搅拌均匀，得到凝胶基质。(3)将益生菌菌泥用蒸馏水分散，于凝胶基质混合，搅拌均匀，得到益生菌凝胶。实施例7表3组成用量/份菌泥10泊洛沙姆500甘油50羟丙基甲基纤维素20蒸馏水1000(1)益生菌菌泥的制备：取益生菌菌种于bhi液体培养基中，5％co2、37℃条件下，厌氧环境中培养12h，益生菌培养液以3000r/min的转速离心10min，反复用生理盐水洗涤，得到益生菌菌泥。(2)凝胶基质：泊洛沙姆分散于蒸馏水中溶胀，浓度为1-10％，加入甘油，加入羟丙基甲基纤维素，搅拌均匀，得到凝胶基质。(3)将益生菌菌泥用蒸馏水分散，于凝胶基质混合，搅拌均匀，得到益生菌凝胶。实施例8表4(1)益生菌菌泥的制备：取益生菌菌种于bhi液体培养基中，5％co2、37℃条件下，厌氧环境中培养12h，益生菌培养液以3000r/min的转速离心10min，反复用生理盐水洗涤，得到益生菌菌泥。(2)凝胶基质：卡波姆分散于蒸馏水中溶胀，浓度为1-10％，加入三乙醇胺调ph至4-12，加入甘油，加入羟丙基甲基纤维素，搅拌均匀，得到凝胶基质。(3)将益生菌菌泥用蒸馏水分散，于凝胶基质混合，搅拌均匀，得到益生菌凝胶。测定实施例5-8中所获得益生菌凝胶剂的活菌含量。分别取实施例5-8中所得益生菌凝胶剂，加入50ml生理盐水，待片剂溶解后，静止5min，用生理盐水梯度稀释至合适浓度，在mrs琼脂培养基上培养，5％co2、37℃条件下厌氧培养24小时，进行菌落计数。表5活菌含量测定结果组别活菌含量(cfu/g)实施例53.1×108实施例62.3×108实施例74.9×108实施例83.6×108测定实施例5-8中所获得益生菌凝胶剂的透光率考察。分别取实施例5-8中所得益生菌凝胶剂，常温保存1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月后，测定透光率。表6组别透光率实施例592％实施例690％实施例795％实施例892％测定实施例5-8中所获得益生菌凝胶剂的活菌存活率考察分别取实施例5-8中所得益生菌凝胶剂，常温保存1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月后，测定活菌含量。表7实施例9益生菌口颊片总体方法如下：(1)益生菌冻干粉的制备：益生菌培养液以3000r/min的转速离心10min，得到益生菌菌泥；在益生菌菌泥中添加脱脂奶粉为冻干保护剂，浓度为1-10％；冻干厚度为1.5-2cm，冷却至-80℃，预冻4h，冷冻干燥处理；出箱，得益生菌冻干粉；(2)药用辅料：以下组分按重量份进行配制，其中辅料分别为异麦芽酮糖、甘露醇、微晶纤维素、硬脂酸镁、二氧化硅、甜菊素、薄荷提取物；(3)粉末直接压片：将所述辅料粉碎过80目筛，益生菌冻干粉过80目筛，过筛后将辅料与益生菌粉按重量比5:100-1混合，混合后得到可直接压片的原料；(4)压片：将混合的原料投入压片机压片，调节压力为20-60kn，得到益生菌片剂。具体实施为：(1)药用辅料的配制：按重量份配制，其中异麦芽酮糖醇50份、甘露醇30份、微晶纤维素10份、薄荷提取物4份、甜菊素4份、硬脂酸镁1份、二氧化硅1份；(2)原料混合：将所述辅料粉碎过80目筛，益生菌冻干粉过80目筛，过筛后将辅料与益生菌粉按重量比50-1混合，混合后得到可直接压片的原料；(3)压片：将混合的原料投入压片机压片，调节压力为20kn，得到益生菌片剂。实施例10:一种含有口腔益生菌的口颊片，其制备方法包括以下步骤：(1)药用辅料的配制：按重量份配制，其中异麦芽酮糖醇20份、甘露醇50份、微晶纤维素20份、薄荷提取物4份、甜菊素4份、硬脂酸镁0.5份、二氧化硅1.5份；(2)原料混合：将所述辅料粉碎过80目筛，益生菌冻干粉过80目筛，过筛后将辅料与益生菌粉按重量比50-1混合，混合后得到可直接压片的原料；(3)压片：将混合的原料投入压片机压片，调节压力为20kn，得到益生菌片剂。实施例11:一种含有口腔益生菌的口颊片，其制备方法包括以下步骤：(1)药用辅料的配制：按重量份配制，其中异麦芽酮糖醇40份、甘露醇20份、微晶纤维素30份、薄荷提取物4份、甜菊素4份、硬脂酸镁1.5份、二氧化硅0.5份；(2)原料混合：将所述辅料粉碎过80目筛，益生菌冻干粉过80目筛，过筛后将辅料与益生菌粉按重量比100-1混合，混合后得到可直接压片的原料；(3)压片：将混合的原料投入压片机压片，调节压力为40kn，得到益生菌片剂。实施例12:一种含有口腔益生菌的口颊片，其制备方法包括以下步骤：(1)药用辅料的配制：按重量份配制，其中异麦芽酮糖醇50份、甘露醇15份、微晶纤维素25份、薄荷提取物4份、甜菊素4份、硬脂酸镁1份、二氧化硅1份；(2)原料混合：将所述辅料粉碎过80目筛，益生菌冻干粉过80目筛，过筛后将辅料与益生菌粉按重量比100-1混合，混合后得到可直接压片的原料；(3)压片：将混合的原料投入压片机压片，调节压力为40kn，得到益生菌片剂。测定实施例9-12中所获得口颊片的活菌含量。分别取实施例9-12中所得口颊片，加入50ml生理盐水，待片剂溶解后，静止5min，用生理盐水梯度稀释至合适浓度，在mrs琼脂培养基上培养，5％co2、37℃条件下厌氧培养24小时，进行菌落计数。表8活菌含量测定结果组别活菌含量(cfu/片)实施例92.2×108实施例103.5×108实施例112.7×108实施例124.1×108实验实施例2：测定实施例9-12中所获得口颊片的稳定性考察分别取实施例9-12中所得口颊片，常温保存1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月后，按照实验实施例2中方法，测定片剂中的活菌含量。表9稳定性考察实施例9实施例10实施例11实施例121个月2.1×1083.1×1082.5×1084.0×1082个月1.7×1082.9×1082.1×1083.6×1083个月1.4×1082.3×1081.8×1083.3×1084个月1.3×1081.8×1081.4×1082.1×1085个月0.9×1081.1×1081.1×1081.8×1086个月0.3×1081.0×1080.7×1081.6×108以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12