人参多糖在制备保护血管内皮细胞药物中的应用的制作方法

本发明涉人参多糖的用途，具体的，涉及人参多糖在制备保护内皮细胞药物或保健食品中的应用。

背景技术：

人参是一种在亚洲和北美发现的生长缓慢的植物，它的根和叶被认为具有重要的医药价值，几个世纪以来，人参被广泛的应用于植物药、传统医药和保健品中。研究发现,从人参中分离出的多糖成分具有杀伤肿瘤细胞和诱导巨噬细胞产生细胞因子的活性。人参多糖中的人参果胶是人参中的另一种有效成分，表现出多种生物活性，如增强机体免疫能力、辅助防治肿瘤、显著抑制肝损伤和降血糖等。人参多糖是由糖醛酸及各种中性糖组成的酸性杂多糖，酸性多糖(rgap)分离自人参不溶于乙醇而溶于水的部分,化学成分检测发现其含有56.9%酸性糖和28.3%中性糖,蛋白质含量低于0.1%，研究表明糖醛酸本身或含有糖醛酸结构单元的低聚糖或多糖常显示出十分重要的生物活性。

近年来，我国类似人参等的名贵中药材资源越来匮乏，但是利用方式依然相当的落后。例如，每年有数十吨人参用于生产人参精、人参酒等保健产品或中成药制剂中，在生产中仅利用人参有效成分的4％～5％，但是多数都是利用醇提的人参皂苷入药使用，而醇提后的废渣则被遗弃，其余的则被废弃或作为饲料添加剂，十分可惜。其实，在常规的人参提取废料中含有一些具有显著保健作用的有效成分，如人参酸性多糖，则并没有得到合理的利用。本发明工艺本着变废为宝的理念，以人参醇提后的药渣的为原料对人参酸性多糖的制备工艺进行了研究，尤其涉及一种从人参醇提后药渣中提取人参酸性多糖的制备方法。人参发挥作用的确切机制还在研究之中，但目前已分离出其中的一些成分。例如，研究发现从人参中分离得到的人参皂苷和gintonins对包括肿瘤细胞在内的一系列细胞具有生物学作用。gintonins是溶血磷脂酸受体配体，可以抑制由atx诱导的黑色素瘤细胞的趋化作用。atx是肿瘤细胞趋化作用的诱导剂(hwangetal2013)。gintonins可以通过减少淀粉样蛋白的沉积抑制阿尔茨海默病(hwangetal2012)。其还可以通过ca²⁺/cam复合物与kcnq1亚基c端的结合激活人心脏延迟整流钾通道(choietal2014)。人参多糖是从人参中提取的另一种成分，人参多糖具有不同的分子量。北美人参中分离得到的高分子量多糖，能够通过mapk、pi3k及p38通路介导的细胞因子的表达刺激免疫调节(lemmonetal2012)，其可以通过提高细胞的新陈代谢减弱缺血再灌注损伤(chenetal2012)。该多糖对结肠癌细胞具有毒性(kingetal2009)。

目前已有大量的关于人参多糖的体内外作用的研究，但关于其对内皮细胞作用的研究却很少。人参中的其它成分如人参皂苷能够抑制lps诱导的血管内皮细胞黏附因子的表达(choetal2014)。来自人参三七的阿拉伯半乳聚糖具有抑制血管生成的作用(wangetal2015)。在体内，健康志愿者给予人参皂苷提取物和人参根后可以改善血流介导的血管舒张(jonanovskietal2014)。上述结果与该作者的另一篇文献一致，人参皂苷及人参多糖都可以影响动脉的舒张活性(jonanovskietal2010)。人参皂苷也可以抑制huvec细胞的增殖活性(yueetal2006)。人参皂苷对内皮细胞的作用似乎是依赖于不同的组分，如rg3抑制生长和血管生成(yueetal2006)，而rg1刺激生长和血管生成(yueetal2005)。同一植物的一种化合物中的不同组分具有完全不同的效果。该研究还有一个令人关注的发现，人参多糖提取物不影响血流调节的血管舒张。人参皂苷还可以抑制lps诱导的肠系膜小静脉漏出(zhangetal2014)。

内皮细胞，是分布在脑、淋巴结、肺、肝脏、脾脏等等器官组织中的一些有共同特点的吞噬细胞的总称，他们吞噬异物、细菌、坏死和衰老的组织，还参与集体免疫活动。内皮细胞能合成和分泌多种生物活性物质，调节机体功能。

内皮素(et)是1988年从猪的主动脉内皮细胞中分离纯化出的一种21个氨基酸组成的血管活性多肽。主要分布于肾、肝、心、脑、主动脉和静脉血管内皮细胞中,是一种内源性常效和强效的血管收缩剂,能引起血管收缩、血小板聚集和平滑肌细胞增殖。1980年首次发现的血管内皮舒张因子(edrf)现已证实为一氧化氮(no)。它来源于内皮细胞、脑神经细胞、非肾上腺非胆碱能神经上皮细胞(nanc)及被毒素、细胞因子激活的巨噬细胞和平滑肌细胞。no一方面具有舒张血管作用,另一方面作为细胞内部及细胞间传递生物信息的信使在缺血等病理条件下发挥作用。内皮素和一氧化氮都是重要的内皮因子。研究提示血浆et水平变化反应了缺血性脑血管疾病的病情严重程度。

本研究发现人参提取成分对内皮细胞的作用，研究人参多糖对血管内皮细胞功能、相关信号通路及与肿瘤细胞相互作用三个方面的的潜在影响。本研究的目的是对人参多糖在内皮细胞完整性、功能提供一个全面的评价，并为以后的生物学和药理学研究提供坚实的基础。

技术实现要素：

本发明涉及人参多糖的新用途，具体地，涉及人参多糖在制备保护内皮细胞药物或保健食品中的应用。

本发明所述的人参多糖是人参药材经提取得到，或者人参经制药后的副产物。

本发明所述人参多糖的制备方法由以下步骤组成：

a、药材提取：取人参药材，粉碎，加水提取，提取液浓缩得浓缩液，备用；

b、醇沉：将步骤a所得浓缩液加入乙醇，至乙醇浓度到50%-80%，0-4℃冷藏静置24-48小时，得醇沉液；

c、离心：将步骤b所得醇沉液离心，收集沉淀，得人参多糖沉淀；

d、干燥：将步骤c所得的人参多糖沉淀40-80℃减压干燥，得人参多糖。

本发明优选的人参多糖的制备方法如下：

a、药材提取：取人参药材，粉碎过20目筛，加药材量的6-10倍量水提取2次，每次2小时，提取液浓缩至1ml含有1g药材的浓缩液，备用；

b、醇沉：将步骤a所得浓缩液加入乙醇，至乙醇浓度到70%，0-4℃冷藏静置48小时，得醇沉液；

c、离心：将步骤b所得醇沉液离心，收集沉淀，得人参多糖沉淀；

d、干燥：将步骤c所得的人参多糖沉淀60℃减压干燥，得人参多糖。

本发明所述人参多糖的制备方法为采用超临界辅助热水浸提法。

本发明所述人参多糖的制备方法为纤维素酶法。

人参多糖的制备方法优选为：人参醇提后药渣经水提取，水提液离心，上清液浓缩后醇沉，沉淀以水溶解后，酶解，脱色、离心，取上清液，滤膜过滤后浓缩、醇沉，得人参多糖。

人参多糖的制备方法还为：称取人参醇提后的药渣，每次加入15-25倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%-0.31%的中温淀粉酶，酶解22-37分钟，加入0.75%-1.25%的多糖专用大孔径活性炭，脱色30-50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖。

人参多糖优选为酸性人参多糖，所述酸性人参多糖是由以下步骤制成：

a．制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入15-25倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%-0.31%的中温淀粉酶，酶解22-37分钟，加入0.75%-1.25%的多糖专用大孔径活性炭，脱色30-50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

b．第一次纯化：取阴离子交换树脂d900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于75-125倍量的纯化水后上树脂柱，用3-5倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5-2.5bv/h，再用4-6倍柱体积浓度为0.3m的nacl溶液洗脱，控制体积流量为1.5-2.5bv/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

c．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，40-75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

d．第三次纯化：步骤c纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75-1.25kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口1.88-3.12bar，回流口1.35-2.35bar，蠕动泵的转速为7.5-12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，40-75℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为45-75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

e.干燥：步骤d纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

再进一步优选为：

a.制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入15倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%的中温淀粉酶，酶解37分钟，加入0.75%的多糖专用大孔径活性炭，脱色50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

b.第一次纯化：取阴离子交换树脂d900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于125倍量的纯化水后上树脂柱，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5bv/h，再用6倍柱体积浓度为0.3m的nacl溶液洗脱，控制体积流量为1.5bv/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

c．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

d．第三次纯化：步骤c纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口3.12bar，回流口1.35bar，蠕动泵的转速为12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，40℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

e.干燥：步骤d纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

本发明所述人参多糖药物剂型为胶囊剂、片剂、散剂、口服液、丸剂、酊剂、糖浆剂、栓剂、凝胶剂、喷雾剂或注射剂。

本发明药物的其他剂型按比例称取原料药后，采用常规的制备方法制备，例如，范碧亭《中药药剂学》（上海科学出版社1997年12月第1版）记载的制备工艺，制成药剂学可接受的常规剂型。

为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：peg6000，peg4000，虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学，需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料（范碧亭《中药药剂学》，上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料）。

本发明所述内皮细胞为非脑组织来源的血管内皮细胞。

本发明所保护内皮细胞为人真皮微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞、人脑微血管内皮细胞或人脑内皮细胞。

本发明所保护内皮细胞为化学药物损伤的内皮细胞或机械损伤的内皮细胞。

附图说明：

图1：d900对vcap和a549细胞粘附的影响（4000hz）(误差线为标准差)

图2：d900对panc1和hgc27细胞粘附的影响（4000hz）(误差线为标准差)

图3：d900对rt112细胞粘附和划痕实验的影响（4000hz）(误差线为标准差)

图4：d900对a549、vcap、panc-1、hgc27、ags、pc-3、mda231、ht115细胞划痕实验的影响（4000hz）(误差线为标准差)

图5：d900、diet对hecv、d3、ty9和ty10细胞粘附的影响（4000hz）(误差线为标准差)

图6：d900、diet对d3、ty9、ty10细胞迁移的影响（4000hz）(误差线为标准差)

图7：d900、diet对hecv、d3、ty9、ty10细胞迁移的影响（4000hz）(误差线为标准差)

图8：d900hecvd3sn细胞对于panci细胞的黏附作用的影响（4000hz）(含待测试剂；误差线为标准差)

图9：d900处理hecvd3sn细胞对panci细胞黏附作用的影响（4000hz）(含待测试剂；误差线为标准差)

图10：d900处理hecvd3sn细胞对panci细胞黏附作用的影响（4000hz）(药物预处理，不含待测试剂；误差线为标准差)

图11：d900处理hecvd3sn细胞对panci细胞黏附作用的影响（4000hz）(药物预处理，不含待测试剂；误差线为标准差)

图12：d900处理ty9sn细胞对panci细胞黏附作用的影响（4000hz）(含待测试剂；误差线为标准差)

图13：d900处理ty9sn细胞对panci细胞黏附作用的影响（4000hz）(药物预处理，不含待测试剂；误差线为标准差)

图14：d900处理ty10sn细胞对于panci细胞的黏附作用的影响（4000hz）(含待测试剂；误差线为标准差

图15：d900处理:ty10sn细胞对panci细胞黏附作用的影响（4000hz）(药物预处理，不含待测试剂；误差线为标准差)

图16：d900处理d3sn细胞对panci细胞迁移能力的影响（4000hz）(含待测试剂；误差线为标准差)

图17：d900处理d3sn细胞对panci细胞迁移能力的影响（4000hz）(药物预处理，不含待测试剂；误差线为标准差)

图18：d900处理ty9sn细胞对panci细胞迁移能力的影响（4000hz）(含待测试剂；误差线为标准差

图19：d900处理ty9sn细胞对panci细胞迁移能力的影响（4000hz）(药物预处理，不含待测试剂；误差线为标准差)

图20：d900处理ty10sn细胞对于panci细胞迁移能力的影响（4000hz）(含待测试剂；误差线为标准差)。

具体实施方式

实施例1：

人参多糖的制备方法由以下步骤组成：

a.制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入15倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%的中温淀粉酶，酶解37分钟，加入0.75%的多糖专用大孔径活性炭，脱色50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

b.第一次纯化：取阴离子交换树脂d900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于125倍量的纯化水后上树脂柱，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5bv/h，再用6倍柱体积浓度为0.3m的nacl溶液洗脱，控制体积流量为1.5bv/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

c．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

d．第三次纯化：步骤c纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口3.12bar，回流口1.35bar，蠕动泵的转速为12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，40℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

e.干燥：步骤d纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

实施例2

人参多糖片剂的制备方法

a、药材提取：取人参药材，粉碎过20目筛，加药材量的8倍量水提取2次，每次2小时，提取液浓缩至1ml含有1g药材的浓缩液，备用；

b、醇沉：将步骤a所得浓缩液加入乙醇，至乙醇浓度到80%，0-4℃冷藏静置24小时，得醇沉液；

c、离心：将步骤b所得醇沉液离心，收集沉淀，得人参多糖沉淀；

d、干燥：将步骤c所得的人参多糖沉淀60℃减压干燥，得人参多糖。

e、制剂：将步骤d所得人参多糖干膏粉碎、制粒，按照片剂的常规方法制备成片剂。

实施例3

人参多糖片剂的制备方法

人参多糖提取：取人参药材1kg，粉碎过60目筛，加3l水作为夹带剂，混合均匀，装入萃取斧中，通过泵把二氧化碳打入萃取斧中，升压至25mpa、加热到85℃后关闭泵，进行静态萃取阶段，保持2小时，将处理后的原料置提取罐中，加入12倍量的纯水，100℃浸提2小时，每过10分钟搅拌一次，过滤、滤液浓缩至1ml含有1g药材的浓缩液，加乙醇至浓缩液含醇量达到70%，在0-4℃下静置24小时，离心，收集沉淀，60℃下减压干燥，即得人参多糖干膏。

制剂：将上述步骤所得人参多糖干膏粉碎、制粒，按照片剂的常规方法制备成片剂。

实施例4

人参多糖胶囊剂的制备方法

人参多糖提取：取人参药材500g，粉碎过80目筛，加纤维素酶量为每克药材500u酶，在60℃、ph值为5的溶液中提取5小时，提取液在100℃灭活酶5分钟，冷却过滤，浓缩干燥，即得人参多糖干膏

制剂：将上述步骤所得人参多糖干膏粉碎、制粒，按照胶囊剂的常规方法制备成胶囊剂。

实施例5

人参多糖注射剂的制备方法

人参多糖提取：取人参药材500g，粉碎过100目筛，加纤维素酶量为每克药材400u酶，在70℃、ph值为6的溶液中提取6小时，提取液在100℃灭活酶5分钟，冷却过滤，浓缩得浓缩液。

制剂：将上述步骤所得人参多糖浓缩液脱色，按照注射剂的常规方法制备成注射剂。

实施例6：

人参多糖饼干制备方法

a、药材提取：取人参药材，粉碎过20目筛，加药材量的10倍量水提取2次，每次2小时，提取液浓缩至1ml含有1g药材的浓缩液，备用；

b、醇沉：将步骤a所得浓缩液加入乙醇，至乙醇浓度到70%，0-4℃冷藏静置48小时，得醇沉液；

c、离心：将步骤b所得醇沉液离心，收集沉淀，得人参多糖沉淀；

d、干燥：将步骤c所得的人参多糖沉淀60℃减压干燥，得人参多糖。

e、制剂：将步骤d所得人参多糖干膏粉碎、制粒，按照饼干的常规方法制备成饼干。

实施例7

人参多糖酸奶的制备方法

人参多糖提取：取人参药材500g，粉碎过100目筛，加纤维素酶量为每克药材400u酶，在70℃、ph值为6的溶液中提取6小时，提取液在100℃灭活酶5分钟，冷却过滤，浓缩得浓缩液。

制剂：将上述步骤所得人参多糖浓缩液，按照酸奶的常规方法制备成酸奶。

实施例8

人参多糖口香糖的制备方法：

a.制备人参粗多糖：称取人参醇提后的药渣，每次加入15倍量的水，水提2次，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.19%的中温淀粉酶，酶解37分钟，加入0.75%的多糖专用大孔径活性炭，脱色50分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为45%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，得人参多糖粗品；

b.第一次纯化：取阴离子交换树脂d900处理备用，称取人参多糖粗品，溶于125倍量的纯化水后上树脂柱，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱，控制体积流量为1.5bv/h，再用6倍柱体积浓度为0.3m的nacl溶液洗脱，控制体积流量为1.5bv/h，收集氯化钠洗脱液，即为人参酸性多糖的氯化钠洗脱液；

c．第二次纯化：取人参酸性多糖的氯化钠洗脱液，75℃减压浓缩至溶液变浑浊为止，浑浊液冷藏过夜，离心，收集沉淀，加入纯化水，加热使沉淀溶解至澄清；

d．第三次纯化：步骤c纯化后的溶液用超滤法脱盐，超滤膜包的截留分子量为0.75kd，超滤洗脱溶剂为超纯水，超滤时的压力为进口3.12bar，回流口1.35bar，蠕动泵的转速为12.5rpm，期间不断补充洗脱溶剂，检测溶剂为10%的硝酸银溶液，超滤脱盐的终点为母液和流出液加入硝酸银溶液均无浑浊，40℃,减压浓缩脱盐后的人参酸性多糖溶液至一定体积，加入乙醇制成醇浓度为75%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用纯化水充分溶解，得到人参酸性多糖的精制溶液；

e.干燥：步骤d纯化后的溶液经喷雾干燥机进行干燥，即得人参酸性多糖。

f．制备口香糖：步骤e所得的人参酸性多糖，按照口香糖的常规制法制成口香糖。

实施例9

人参多糖丸剂的制备方法

人参多糖提取：人参醇提后的药渣，水提2次，每次加入20倍量的水，合并水提液离心去沉淀，上清液经减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀用水充分溶解，65℃时，加入0.25%的中温淀粉酶，酶解30分钟，加入0.9%的多糖专用大孔径活性炭，脱色40分钟，离心，去除活性炭，上清液经微孔滤膜过滤，溶液减压浓缩，加入乙醇制成醇浓度为60%醇溶液，醇沉过夜，离心，沉淀经60%醇洗脱两次，沉淀挥尽乙醇，浓缩、干燥，得人参多糖干膏。

制剂：将所得人参多糖干膏粉碎，按照丸剂的常规方法制备成丸剂。

实施例10

人参多糖口腔崩解片的制备方法

人参多糖的制备：

a、药材提取：取人参药材，粉碎过20目筛，加药材量的8倍量水提取2次，每次2小时，提取液浓缩至1ml含有1g药材的浓缩液，备用；

b、醇沉：将步骤a所得浓缩液加入乙醇，至乙醇浓度到70%，0-4℃冷藏静置48小时，得醇沉液；

c、离心：将步骤b所得醇沉液离心，收集沉淀，得人参多糖沉淀；

d、干燥：将步骤c所得的人参多糖沉淀60℃减压干燥，得人参多糖。

制剂：将所得人参多糖干膏粉碎，按照口腔崩解片的常规方法制备成片剂。

实施例11

人参多糖缓释片的制备方法

人参多糖的制备：a、药材提取：取人参药材，粉碎，加水提取，提取液浓缩得浓缩液，备用；b、醇沉：将步骤a所得浓缩液加入乙醇，至乙醇浓度到80%，0-4℃冷藏静置48小时，得醇沉液；c、离心：将步骤b所得醇沉液离心，收集沉淀，得人参多糖沉淀；d、干燥：将步骤c所得的人参多糖沉淀60℃减压干燥，得人参多糖。

制剂：将所得人参多糖干膏粉碎，按照缓释片的常规方法制备成片剂。

实验例：

为证实本发明药物的治疗效果，用按实施例1制得的人参多糖（以下称d900），进行了以下试验研究：

一、材料和方法

1.1细胞和材料.

内皮细胞：原代培养的人真皮微血管内皮细胞（hmvec-d）购自龙沙（巴塞尔，瑞士）。一种永生化的人脐静脉内皮细胞hecv购自意大利米兰interlab。人脑微血管内皮细胞hmes-d3（d3）来自法国巴黎笛卡尔大学的couraud博士。人脑内皮细胞ty9和ty10来自日本山口大学神经内科的sano博士。

非内皮细胞：人癌细胞mdamb-231(乳腺癌)，mcf10a(乳腺癌)，mcf-7(乳腺癌)，hgc27(胃癌)，ej138(膀胱癌),rt112(膀胱癌),panc1(胰腺癌),miapaca-2(胰腺癌),a549(肺癌),vcap(前列腺癌),pc3(前列腺癌),ags(胃癌)和ht115(结直肠癌)购自lgc标准/atcc(特丁顿,米德尔赛克斯，英国)。

人参提取物：实施例1制备的人参多糖胶囊剂，现被称为“d900”，由以岭药业供应。人参的一组关键成分人参皂苷组合购自于sigma-aldrich公司（g-015），并作为人参提取物的对照品使用。人参皂苷的组合包括：rb1，rb2，rc，rd，re，rf，rg1，和rg2，为水溶性混合物，甲醇提取，用dmemf12稀释且甲醇浓度在1％以下使用。

其它材料：己烯雌酚（diet）和硫唑嘌呤（aza）购自sigma-aldrich（英国，多塞特郡，普尔）。化合物首先溶于dmso，后用bss梯度稀释。-80℃保存备用。其它主要材料包括fitc-conjugateddextra10、结晶紫溶液、rna提取试剂等，除另有说明外均购自sigma-aldrich。人源claudin-1,claudin-5,zo-1,af6,jam-a和jam-b一抗均购自圣克鲁斯生物技术有限公司（美国，ca，圣克鲁斯）。人源hsp27，磷酸化-hsp27(s86)，桩蛋白，caspase-9和gapdh一抗均购自圣克鲁斯。

损伤内皮细胞的条件培养基

化学损伤内皮细胞的条件培养基:相同数量的内皮细胞（hmvec-d，d3，ty9，ty10或hecv）接种于25平方厘米的培养皿中孵育直到接近汇合。然后用培养基轻轻地清洗平皿，分别分组如下：①空白对照组：空白对照培养基小心地加入细胞中（每皿4ml）；②化学损伤组：采用单独化学因素（diet），用正常培养液培养内皮细胞；③药物干预组：将含化学/人参多糖联合的培养基小心地加入细胞中（每皿4ml）。单独人参多糖组：将人参多糖小心地加入细胞中（每皿4ml）。8小时后，除去培养基并收集（以处理方式命名）。培养皿用普通培养基洗涤三次，后加入新鲜培养基。进一步培养8小时后，收集条件培养基并储存于-80℃备用。这种内皮细胞的条件培养基（处理后）随后作用于癌细胞。

机械损伤内皮细胞的条件培养基:相同数量的内皮细胞（hmvec-d，d3，ty9，ty10或hecv）接种于25平方厘米的培养皿中孵育直到接近汇合。然后用培养基轻轻地清洗平皿，分别分组如下：①空白对照组：空白对照培养基小心地加入细胞中（每皿4ml）；②机械损伤组：采用多移液管装置损伤单层内皮细胞后，用正常培养液培养内皮细胞；③药物干预组：采用多移液管装置损伤单层内皮细胞后，用含有人参多糖的培养液培养。单独人参多糖组：将人参多糖小心地加入细胞中（每皿4ml）。8小时后，除去培养基并收集（以处理方式命名）。培养皿用普通培养基洗涤三次，后加入新鲜培养基。进一步培养8小时后，收集条件培养基并储存于-80℃备用。这种内皮细胞的条件培养基（处理后）随后作用于癌细胞。

体外细胞生长试验

含3000个细胞的一百微升培养基接种于96孔板中，随后加入一定浓度范围的d900。然后将这些板置于37℃，5％co2孵育，分别孵育24小时、72小时和120小时。孵育结束后，细胞用4%福尔马林固定10-20分钟，随后用0.5%的结晶紫染色10分钟。染料用水洗掉，并将板放置干燥。然后用200μl醋酸溶解染料，使用分光光度计（bio-tek，elx800，英国）检测540nm处的吸光度值来评估细胞生长。以24小时时检测的吸光度值为基准，计算生长速率的百分比。

流式细胞仪检测细胞凋亡

磷脂酰丝氨酸（ps），细胞膜的磷脂组分在正常活细胞中通常位于细胞膜的细胞质一侧。然而，当细胞发生凋亡，ps从细胞膜的内侧移至外侧，从而导致它暴露于外部细胞周围。在白细胞中，这种作用触发巨噬细胞吞噬凋亡的细胞。

为了检测凋亡的细胞，本研究使用vybrant®凋亡检测试剂盒（invitrogen,inc.,paisley,uk）进行细胞凋亡检测。此试剂盒含重组荧光素缀合的膜联蛋白v（fitc膜联蛋白v）和碘化丙啶（pi）溶液。钙依赖性磷脂-结合蛋白annexinv，与ps以高的亲和力结合，因此当用荧光团或生物素标记时，可通过结合细胞膜外部的ps来检测细胞凋亡。

另一方面，pi是一种红色荧光染料，仅能够透过非存活细胞的细胞膜，并结合其核酸。因此，任何丧失膜完整性的细胞将被pi染成红色，而凋亡细胞，不能透过pi，将被fitc膜联蛋白ⅴ染成绿色。溶液中任何存活的细胞将显示很弱的荧光或无荧光。

这部分染色可以通过流式细胞仪和附带的flomax软件包很容易地鉴定。操作步骤如下：收集所有细胞包括贴壁与培基中悬浮的细胞，用pbs洗涤，离心后去上清。以1xannexin-binding缓冲液重悬细胞，使细胞密度在1x10⁶cell/ml，保证每个分析样品100µl。随后取5µlannexinv-fitc和1µlpi工作液（100µg/ml）加入每份检测的100µl样品中，然后孵育15min。

孵育完后，每份样品加入400µlannexin-binding缓冲液，轻轻混匀，放到冰上。

染色完成后，立即使用流式细胞仪和flowmax软件进行检测、分析，测定在530nm（fl1）和>575nm(fl2)发射光的荧光强度。

1.5以pi染色分析细胞周期

·收集所有贴壁和悬浮的细胞（包括处于有丝分裂期，凋亡及坏死的细胞），离心去上清；然后以pbs洗涤2次并计数。

·随后，以500µlpbs重悬细胞，使密度在1x10⁶cell/ml，然后采用4.5ml70%乙醇4度固定2小时。

·采用乙醇固定细胞后，细胞对pi染色更敏感。

·固定完成后，以pbs洗涤细胞，然后以1ml含tritonx-100的pi溶液对细胞进行染色，另外增加细胞通透性；rnasea用于消化能结合pi的双链rna，从而增加dna的特异性结合。

·室温孵育30min后，以流式细胞仪检测pi发出的荧光，并使用flowmax软件对细胞周期进行分析。

细胞基质电阻抗传感技术

·细胞基质电阻抗传感技术（ecis）是一种用于替代上述提到的传统功能分析的新方法。它采用96孔微阵列进行分析，每孔包括两个金电极。它们通过测定电极的电流和电压，计算阻抗和电阻。通过电阻抗的改变，使用96w1e+微阵列（ecistm培养皿，ab公司，纽约，usa）检测对细胞的粘附性和能动性的作用，每孔使用200µl的电极稳定液（ecistm，ab公司，纽约，usa），室温条件下稳定20min。

·接着吸弃稳定液，加入200µl含有hepes缓冲液（lonza，verviers，belgium）的dmemf12培养基，放置直到使用。

·吸弃培养基，每孔接种200µl含40000细胞的dmem，并加入所需的感兴趣的蛋白。

·将96孔微阵列板放入ecistmco2孵育箱内（rsbiotech9600，rgalaxyr+），连接ecistm9600模型控制器（ab公司，纽约，美国）。设置软件测定4000赫兹时电流流动的阻力。细胞粘附性在第一个40min时被评估，接着在第14小时阻抗达到平台期时设定电损伤，可以获得超过6小时的迁移数据。数据根据第一时间点的电阻标准化。

本仪器为研究者提供了自动化的、非侵入性的实时检测细胞行为的能力，且不使用标签。ecis®zθ测定了在金电极贴壁生长的细胞的复阻抗谱（z，r，c）。

在透明pet基底上，每个96孔标准板结构包括两个直径为350微米的圆形活性电极。与其他1e数组一样，主要使用这个数组用于创伤愈合分析，小规模的电极保证了高电流脉冲将导致细胞完全杀死。只有小部分细胞在小电极上被监测到，由于细胞的随机运动导致了阻抗信号的波动。

1.7免疫荧光染色（ifc）

16孔的小室（nunc，飞世尔实验器材，莱斯特郡，英国）用100μl无血清培养基处理1小时。弃去培养基，平均每孔接种200μl含20000个细胞的培养基，孵育过夜使其形成单层融合。然后吸出培养基，细胞用无水乙醇在-20℃固定20分钟。细胞在bss液中平衡10分钟，0.1%tritonx-100通透5分钟后用tbs洗3遍。用含10%马血清（vectorlabs.,peterborough,uk）的tbs封闭40分钟，之后用tbs清洗。用含3%马血清的tbs按1:100稀释一抗，加入一抗孵育1小时。细胞用3%的马血清洗4次再用tbs洗4次。用1:1000倍数稀释二抗，细胞避光孵育1小时，二抗根据一抗的种属选择，荧光标记物可选用fitc和tritc。二抗溶液中加入dapi用于染核。细胞用3%马血清洗8次后，放在tbs里，加入fluorsave试剂（默克，达姆施塔特，德国）和铝箔包裹储存在4°c直到使用olympusbx51荧光显微镜观察。图像用滨松的数码相机拍摄。

1.8跨内皮电阻的测定（ter）

hecv或hmes-d3细胞（50000个）接种到一个孔径为0.4μm的透明小室（greinerbio-one,stonehouse，英国），插入到含200μl普通培基的24孔板中，生长至汇合，吸出旧培基，加入新鲜的含15mmhepes和l-谷氨酰胺的dulbecco’smodifiedeagle’s培养液中，（龙沙实验室verviers，比利时）。小室中加入单独的培养基（对照）或不同浓度的d900人参多糖（从10ng/ml到100μg/ml）。跨细胞层的电阻用evomvolt-ohmmeter(evom,世界精密仪器，阿斯顿，赫特福德郡，英国)测定，该仪器配备有多个静态电极（wpi，佛罗里达州，美国）。一个电极被放置在上，另一个放置在孔的下室，从0到240分钟内间隔测量电阻。在每个实验结束时，去除培养基，细胞用结晶紫染色，并在显微镜下观察，以确保整个实验过程中细胞没有脱落。

1.9对血管内皮细胞通透性（pcp）测量

类似于ter研究，hecv或hmes-d3细胞（50000个）接种到一个孔径为0.4μm的透明小室（greinerbio-one,stonehouse，英国），插入到含200μl普通培基的24孔板中，生长至融合，吸出旧培基，加入新鲜的含15mmhepes和l-谷氨酰胺的dulbecco’smodifiedeagle’s培养液（龙沙实验室verviers，比利时）。小室中加入基础培养基作为对照或加入不同浓度的d900人参多糖（从10ng/ml到100μg/ml）。所有插入孔均含有fitc-dextra（10kda）（sigma-aldrich公司）。在给定时间点，在每个孔的下室取20μl培养基，并放置到一个96孔板中。实验结束后，使用荧光分析仪(lomax,promega)测量荧光信号（反映葡聚糖通过内皮细胞单层的漏出情况）。

、统计分析

数据分析：结果以平均数±方差显示，采用studentttests进行统计分析。

结果

3.1d900对内皮细胞和癌细胞的生长和死亡都没有明显影响

我们首先检测d900对细胞是否有毒，并试图确定d900对非细胞生长相关研究操作的安全浓度范围。我们选择宽泛的浓度范围，即终浓度为10ng/ml到1000µg/ml(1mg/ml)，最高浓度之所以选用1mg/ml(1000µg/ml)，首先是根据样品存储量能够使用的最高浓度，其次在体内达到此浓度也是不切实际的。

我们检测d900对各种内皮细胞和癌细胞的作用效果，d900在10-10000ng/ml的浓度范围内对hecv和hmvec-d内皮细胞的生长基本没有影响，尽管最大浓度(1mg/ml)在体内已经是无法实现的。

同样的，d900对各种不同癌细胞的生长也是没有效果的，包括内分泌、胃肠道、肺癌细胞。

通过此次实验，我们选定了一个浓度范围来检测d900在后续实验中对细胞其他功能（包括粘附，细胞凋亡，迁移和屏障功能）的作用效果。一个远离潜在抑制点的浓度范围，即从最高的10000ng/ml降到1.0ng/ml。

对癌细胞的粘附没有显著的影响

为了了解d900是否以及如何影响癌细胞，我们用无毒性的浓度范围测试了d900对人类癌细胞黏附和迁移的影响。虽然panc1和hgc27在100ng/ml-1000μg/ml高浓度时可以降低细胞粘连性，但是d900对a549和vcap没有作用，试验结果见图1-3。

对肿瘤细胞的迁移没有显著的影响

经试验研究，没有观察到d900对肿瘤细胞迁移的作用，然后用相同的浓度检测了其对内皮细胞的作用，试验结果见图4。

致癌物和d900对脑源性内皮细胞的直接作用较弱

我们首先测试脑内皮细胞是否以及如何应答d900和致癌物质。在这里，我们采用3种脑内皮细胞，即hmes-d3，ty9和ty10。这些脑内皮细胞在粘附性和迁移方面对d900和diet的敏感程度远不如hecv细胞对d900和diet的敏感程度高（请参阅以前章节），试验结果见图5-7。

致癌物和d900处理的脑内皮细胞条件培养液对肿瘤细胞的影响

测试了两种情况：来自含待测试剂（即d900和致癌物质）的脑内皮细胞条件培养液和不含d900和致癌物（用d900和致癌物预处理）的条件培养液。我们以细胞粘附和迁移能力以及各组细胞上清液中no和et-1含量的变化为指标,测试这些条件培养液对癌症细胞的影响，结果如下：含有己烯雌酚（diet）的hecv细胞条件培养液能够显著刺激panc1，然而，硫唑嘌呤(aza)对于癌细胞的刺激比己烯雌酚（diet）要小，含d900的条件培养液能够逆转内皮诱导的肿瘤细胞刺激，比如通过降低内皮细胞中致癌物质的诱导活化。

经研究发现来自d3脑内皮细胞的条件培养基对panc1细胞影响不大，含有己烯雌酚(diet)硫唑嘌呤(aza)的培养基类似，试验结果见图8。ty9脑内皮细胞的条件培养液（含有己烯雌酚(diet)硫唑嘌呤(aza)）对panc1胰腺癌细胞粘附显示了一定程度的刺激作用。然而，ty10细胞的敏感性低于ty9，试验结果见图9-11。来自ty9和ty10脑内皮细胞的条件培养基（含有己烯雌酚(diet)硫唑嘌呤(aza)）对胰腺癌细胞迁移能力显示出一定程度的刺激，试验结果见图12-20。

损伤内皮细胞各组上清液no和et-1含量的变化

3.6.1化学药物损伤各组上清液no和et-1含量的变化

收集各组细胞培养上清液，1000rpm离心2min后，去除细胞碎片，取上清液。采用硝酸还原酶法和酶联免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa法）分别检测细胞上清液中no及et-1含量。

diet损伤内皮细胞各组上清液no水平的变化(±s)

diet损伤内皮细胞各组上清液et-1水平的变化(±s)

diet损伤组上清液no水平降低（p<0.05），et-1水平明显升高（p<0.01）；与diet损伤组相比，药物干预组上清液no含量显著升高（p<0.01），et-1含量显著降低（p<0.01）。

3.6.2机械损伤内皮细胞各组上清液no和et-1含量的变化：

收集各组细胞培养上清液，1000rpm离心2min后，去除细胞碎片，取上清液。采用硝酸还原酶法和酶联免疫吸附法（enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa法）分别检测细胞上清液中no及et-1含量。

机械损伤内皮细胞各组上清液no含量的变化(±s)

机械损伤内皮细胞各组上清液et-1含量的变化(±s)

与空白对照组比较，机械损伤内皮细胞后，no水平降低（p<0.05，p<0.01），et-1水平升高（p<0.05，p<0.01）；与机械损伤组比较，药物干预组上清液no含量明显升高（p<0.01），et-1含量显著降低（p<0.01）。

讨论

本研究首次表明人参组分人参多糖在调节血管内皮细胞迁移和粘附方面具有一定的活性，本研究也首次表明人参多糖能够减轻受致癌物损伤的内皮细胞对肿瘤细胞的激活作用。实验结果表明，人参多糖并不影响内皮细胞或肿瘤细胞的生长。人参多糖也不影响内皮细胞的坏死/凋亡，即人参多糖不参与正常或非正常细胞增殖行为的调控。研究显示，人参多糖对肿瘤细胞无论是增殖、细胞粘附或者是细胞迁移都没有较强的直接作用。通过比较脑微血管内皮细胞和非脑源的血管内皮细胞发现，非脑源内皮细胞对人参多糖更敏感，人参多糖能够减少非脑源内皮细胞的粘附和迁移，而脑源的内皮细胞在这方面则不那么敏感。人参多糖对脑源的内皮细胞作用则是通过减少细胞旁渗透、增加跨内皮细胞电阻而加强其屏障功能。