氧化苦参碱在制备抗关节软骨退变的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及氧化苦参碱在制备抗关节软骨退变的药物中的应用。

背景技术：

骨关节炎(oa)是一种常见的与老龄化相关的退行性关节病，以骨关节软骨退变为主要特征，临床表现主要为进行性加重的关节疼痛、畸形及活动障碍等。关节软骨由软骨细胞组成，软骨细胞的变性与死亡在oa的发生发展中起到关键性作用。据世界卫生组织报告，全球有逾2亿人饱受oa折磨，严重危害患者生活质量。国内关于oa患病率的报道已高达8.3％，多发于中老年人负重大、活动多的关节，常见于髋、膝等处，以膝关节最为多见。近年来随着世界人口老龄化，oa的发病率在全球范围内呈现出逐年增高的趋势，而我国老龄化来临，预计oa在我国的发病率将会越来越高。现代医学对oa的病变机制目前尚不清楚。目前oa的总体治疗原则是非药物与药物治疗相结合，口服药物如美洛昔康等，必要时手术治疗，其中非手术治疗占主导地位，但疗效不够确切，手术治疗以关节镜清理术去除剥离的关节软骨、修平关节面为主，但疗效有限，且费用较高。

苦参碱是由豆科植物苦参的干燥根、植株、果实经乙醇等有机溶剂提取制成的，是一种生物碱。苦参总碱是苦参所有生物碱的统称，其主要成分以苦参碱、氧化苦参碱含量最高。其他来源为苦豆子果实，山豆根及山豆根地上部分，纯品外观为类白色至白色粉末。氧化苦参碱，又名苦参素，透明颗粒结晶，熔点207℃-208℃，易溶于水、甲醇、氯仿、苯，难溶于乙醚。其分子式为c15h24n2o2，结构式如式i所示。中国专利201610000529.2公开了氧化苦参碱在制备抗肿瘤药物增敏剂中的应用，氧化苦参碱具有增加肿瘤多药耐药细胞对抗肿瘤药物敏感性的作用，可以作为化疗增敏剂使用。中国专利201410396882.8公开了氧化苦参碱注射液抗心绞痛药物的应用，氧化苦参碱注射液是由2mg/ml氧化苦参碱用5％葡萄糖100ml稀释，配制成的静脉注射液；并采取坐位给药，其疗效比对比组硝酸甘油、硝酸异山梨醇酯提高10％。中国专利201510128920.6公开了氧化苦参碱作为治疗新生大鼠缺氧缺血性脑损伤药物的用途，实验结果表明氧化苦参碱剂量为120mg/kg体重时可以降低缺血区域脑梗死体积以及神经元凋亡率，减轻脑组织病理损伤，提高脑组织中抗氧化酶活性，降低丙二醛含量，氧化苦参碱具有预防新生儿缺氧缺血性脑损伤后致伤亡和促进神经功能恢复的作用。然而现有技术中，关于氧化苦参碱在制备抗关节软骨退变的药物中的应用，目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供氧化苦参碱的制药用途。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种抗关节软骨退变的药物。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供氧化苦参碱在制备试剂中的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

氧化苦参碱的用途，用于制备抗关节软骨退变的药物。

作为本发明的一个优选实施方案，所述关节软骨退变是指骨关节炎关节软骨退变。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物抑制基质金属蛋白酶及炎症因子的表达，抑制炎症相关信号通路的激活，降低软骨细胞的凋亡。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种抗关节软骨退变的药物，所述药物由氧化苦参碱和药学上可接受的载体或赋形剂组成。

所述药学上可接受的载体或赋形剂包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂与给药方式相匹配。本发明的氧化苦参碱可以被制成注射剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

氧化苦参碱在制备试剂中的用途，所述的试剂用于：

(1)抑制基质金属蛋白酶mmp2,mmp9,mmp13和炎症因子il-6,il-8,tnf-α的表达；

(2)抑制nf-kb信号通路和mapk信号通路的激活；

(3)降低软骨细胞的凋亡。

本发明优点在于：

本发明首次发现氧化苦参碱可以作为抗关节软骨退变的药物。在细胞实验中，我们发现：(1)在脂多糖的刺激下，基质金属蛋白酶(mmp2,mmp9,mmp13)和炎症因子(il-6,il-8,tnf-α)的表达水平显著增高，而在氧化苦参碱处理组中，这些基因的表达水平得到了明显的抑制。(2)在脂多糖刺激的条件下，软骨细胞发生一定程度的凋亡，而在氧化苦参碱处理组中，软骨细胞的凋亡数显著减少。(3)在脂多糖的刺激下，软骨组织的蛋白聚糖显著丢失，ii型胶原的表达水平降低；而在氧化苦参碱处理组中，蛋白聚糖的丢失和ii型胶原的降解得到了有效的缓解，表明在氧化苦参碱的作用之下，关节软骨的退变得到了有效的抑制。(4)在脂多糖刺激组，上清中的糖胺聚糖含量显著较未处理组升高，而在氧化苦参碱的干预之下，组织糖胺聚糖的释放得到了有效的抑制。(5)氧化苦参碱可以通过抑制炎症相关信号通路的激活，进而抑制软骨细胞的炎性退变。在小鼠骨关节炎模型中，我们发现：(1)在模型组中，小鼠关节软骨磨损严重，而在氧化苦参碱注射组中，小鼠关节软骨的磨损显著减轻。(2)免疫组化结果显示，在模型组中，小鼠关节软骨细胞凋亡明显，而氧化苦参碱可以显著减少关节软骨细胞的凋亡。(3)在模型组中，小鼠关节软骨层中nf-kb信号通路显著激活，相应的分解代谢酶表达升高；而在氧化苦参碱注射组中，关节软骨层nf-kb激活较轻，基质金属蛋白酶的表达水平也较低。上述实验结果表明，氧化苦参碱具有抑制软骨细胞炎症反应和分解代谢反应的作用，保护了软骨细胞，延缓其退变，因此可用于制备抗关节软骨退变的治疗药物。

附图说明

附图1为cck-8实验研究氧化苦参碱对人原代软骨细胞的毒性作用。

附图2为氧化苦参碱抑制脂多糖诱导的炎症因子和基质金属蛋白酶基因表达。

附图3为elisa进一步证实氧化苦参碱可以抑制脂多糖所诱导的软骨原代细胞炎症因子和基质金属蛋白酶的表达。

附图4为流式细胞仪分析软骨细胞凋亡情况，证实脂多糖可以促进软骨细胞的凋亡，而氧化苦参碱保护软骨细胞，减少了脂多糖所诱导的软骨细胞凋亡。

附图5为软骨组织离体培养，氧化苦参碱可以延缓脂多糖所诱导的软骨组织块的退变。

附图6为对离体培养的软骨组织的染色结果进行了统计。

附图7为dmmb检测证实氧化苦参碱可以减少软骨组织糖胺聚糖释放，从而延缓软骨的退变。

附图8为氧化苦参碱抑制软骨细胞中的nf-kb和mapk信号通路的激活。

附图9为运用免疫荧光和核质分离研究了氧化苦参碱对软骨细胞内nf-kb信号通路激活的抑制作用。

附图10为动物实验中，证实氧化苦参碱腹腔注射可以显著抑制小鼠关节软骨的退变，tunel染色说明在氧化苦参碱注射组，小鼠关节软骨凋亡细胞显著减少。

附图11为免疫组化证实氧化苦参碱注射可以抑制软骨组织内的nf-kb信号通路的激活，抑制基质金属蛋白酶的表达，从而延缓软骨退变。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1氧化苦参碱对关节软骨的保护作用

(一)材料和方法

1.人关节软骨原代细胞提取及培养

取老年行膝关节置换患者的软骨手术标本，在无菌操作下，在超净工作台内用手术刀切成大小均匀约1mm³的软骨小块，收集置于离心管中，以pbs冲洗3次，每次3分钟，充分洗净血液及周围非软骨成分的组织。随后，向离心管加10ml2.5％胰酶，于37度培养箱中消化处理30分钟。消化后将离心管置于离心机中离心5分钟，吸出胰蛋白酶。将配好的0.2％ii型胶原酶加入到离心管中，37度培养箱中消化6-8小时，加入含有10％胎牛血清的完全培养基中和消化，离心5分钟后弃去上清，用含有10％胎牛血清的完全培养基重悬，接种于培养瓶中，置于二化碳培养箱中培养(温度37℃，饱和湿度，5％二氧化碳)。每日在倒置显微镜下观察软骨细胞生长情况，视细胞贴壁情况更换培养液。

细胞生长增殖形成单层细胞后，镜下观察软骨细胞聚集成片，待约80％的细胞汇合，即进行细胞传代。吸除培养液，pbs清洗后，加入0.25％的胰蛋白酶2ml，室温下静置消化3分钟，倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞重新变成圆形，细胞间隙增加，少量细胞开始浮游，此时迅速用含有10％胎牛血清的完全培养基中和。离心，弃上清，用完全培养基重悬，接种于新的培养瓶或者进行下一步的实验。

2.cck-8检测细胞活力

将离体软骨原代细胞接种于96孔板中，将培养板在培养箱预培养过夜，待细胞贴壁后，向培养板加入不同浓度的氧化苦参碱，浓度梯度分别为0.5，1，2，4mg/ml，将培养板在培养箱孵育一段时间(12,24和48小时)后，向每孔加入10μlcck-8溶液(注意不要在加的过程中生成气泡，否则会影响o.d值的读数)。将培养板在培养箱内孵育1-4小时后用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

活力计算：细胞活力(％)＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]×100％。具体：a(加药)：具有细胞、cck-8溶液和药物溶液的孔的吸光度；a(空白)：具有培养基和cck-8溶液而没有细胞的孔的吸光度；a(0加药)：具有细胞、cck-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

3.时荧光定量pcr检测炎症因子和基质金属蛋白酶基因表达水平

研究氧化苦参碱对于脂多糖所诱导的软骨细胞炎症反应和分解代谢反应的影响。先将软骨细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁汇合至80％时，先以不同浓度梯度的氧化苦参碱(0.5，1，2mg/ml)预处理2小时，再以脂多糖(1μg/ml)刺激24小时后，trizol法抽提样品总rna。将6孔板中的培养基洗掉，pbs洗一遍，每孔加入trizol裂解液，充分裂解后吸入ep管中，置于-80度冰箱保存，后续的抽提时，取出冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。每1ml的trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。rna全部被分配于水相中。小心将上层水相转移到一干净无rna酶的离心管中。加等体积异丙醇，此时离心前不可见的rna沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。移去上清液，每1mltrizol试剂裂解的样品中加入至少1ml的75％乙醇(75％乙醇用depch2o配制)，清洗rna沉淀。混匀后，4℃下7500rpm离心5分钟。小心吸去大部分乙醇溶液，使rna沉淀在室温空气中干燥5分钟。加入无rna酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的rna溶液保存于-80℃待用。

取1ug总rna进行反转录，加入2ulmix，其余用depc水补齐。总体系放入pcr仪进行反转录，取反转录后的cdna进行后续的定量分析，反应体系为cdna：2ul；sybrgreen：10ul；上下游引物分别为0.8ul，rox：0.4ul；双蒸水：6ul。反应结束后，运用2^-δδct法分析基因表达差异。

4.elisa检测炎症因子和基质金属蛋白酶蛋白表达水平

研究氧化苦参碱对于脂多糖所诱导的软骨细胞炎症反应和分解代谢反应的影响。先将软骨细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁汇合至80％时，先以不同浓度梯度的氧化苦参碱(1，2mg/ml)预处理2小时，再以脂多糖(1μg/ml)刺激24小时后，invitrogenelisa试剂盒检测软骨细胞培养液中的基质金属蛋白酶(mmp2，mmp9和mmp13)和炎症因子(il-6和tnf-α)的含量。

5.流式细胞仪检测软骨细胞凋亡情况

研究氧化苦参碱对于脂多糖所诱导的软骨细胞炎症反应和分解代谢反应凋亡的影响。先将软骨细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁汇合至80％时，先以不同浓度梯度的氧化苦参碱(1mg/ml)预处理2小时，再以脂多糖(1μg/ml)联合氧化苦参碱刺激24小时后，运用invitrogen的细胞凋亡检测试剂盒检测软骨细胞的凋亡情况，分析氧化苦参碱对于软骨细胞凋亡的挽救作用。

6.软骨离体培养检测氧化苦参碱对于离体软骨组织退变的保护作用

取因骨性关节炎而行手术治疗的患者的手术标本，刀片切取患者软骨组织，用刀片切成1mm³大小的软骨块，置于24孔板中加入完全培养基培养7天和14天，实验分为空白对照组，10ug/ml的lps刺激组，10ug/ml的lps联合1mg/ml的氧化苦参碱处理组，于培养的第七天和第十四天分别对软骨块进行固定，行h&e,safranino染色，免疫组化检测软骨组织ii型胶原的表达水平。同时培养的上清液取出后，糖胺聚糖检测试剂盒检测软骨组织糖胺聚糖释放情况。

7.westernblot

检测氧化苦参碱对于nf-kb和mapk信号通路的影响。软骨细胞接种于6cm皿中，待细胞贴壁汇合至80％左右时，先用1mg/ml的氧化苦参碱预处理细胞2小时，再以脂多糖刺激5,10,15,30,60分钟，在每个时间点收集蛋白样品，收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，用bca检测试剂盒测定每个蛋白样品的蛋白浓度。在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的5x的sds-page蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热10分钟，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到sds-page胶加样孔内进行蛋白电泳。检测指标包括：p65，p-p65，ikbα,jnk,p-jnk,erk,p-erk,p38,p-p38,gapdh等。

8.机械破坏造小鼠骨关节炎模型，研究动物模型中氧化苦参碱对关节软骨的保护作用

本部分我们运用前叉韧带离断的方法进行c57小鼠骨性关节炎造模，小鼠麻醉后，备皮，消毒，膝关节屈曲后于前方置入一细针，左右摆动离断小鼠的前交叉韧带，术后3天开始腹腔注射氧化苦参碱。本实验分为四组，第一组假手术组，改组小鼠不做前叉韧带离断，小鼠作为空白对照；第二组小鼠行前叉韧带离断术造骨性关节炎模型；第三组行骨性关节炎造模，同时腹腔注射低剂量氧化苦参碱(25mg/kg)；第四组行骨性关节炎造模，同时腹腔注射高剂量氧化苦参碱(50mg/kg)。

术后第6周取材，小鼠关节标本用4％多聚甲醛固定后，脱钙，脱水包埋，切片，行后续染色处理。分别对几组小鼠的膝关节切片行h&e染色，safranino/fastgreen染色检测软骨破坏程度，并行oarsi关节组织学评分，tunel染色检测软骨细胞的凋亡情况，与此同时，我们行免疫组化染色检测nf-kb信号通路的激活情况，以及基质金属蛋白酶mmp9和mmp13的表达水平，综合判断在体情况下，腹腔注射氧化苦参碱对于前叉韧带离断所导致的软骨磨损的延缓作用。

(二)结果

(1)图1是cck-8实验研究氧化苦参碱对人原代软骨细胞的毒性作用。由图我们可以看到，氧化苦参碱的药物毒性很低，在2mg/ml的浓度下，氧化苦参碱对于软骨细胞没有明显的毒性作用。

(2)图2是氧化苦参碱抑制脂多糖诱导的炎症因子和基质金属蛋白酶基因表达。由图我们可以看出，在脂多糖的刺激下，基质金属蛋白酶(mmp2,mmp9,mmp13)和炎症因子(il-6,il-8,tnf-α)的表达水平显著增高，而在氧化苦参碱处理组中，这些基因的表达水平得到了明显的抑制。

(3)进一步研究，我们运用elisa检测软骨细胞培养上清液中的炎症因子和基质金属蛋白酶的分泌量。结果如图3所示，我们发现，其结果与定量pcr的结果基本一致，这说明氧化苦参碱可以有效的抑制软骨细胞的炎症反应和分解代谢反应，从而起到保护软骨细胞的作用。

(4)图4是流式细胞仪分析软骨细胞凋亡情况，证实脂多糖可以促进软骨细胞的凋亡，而氧化苦参碱保护软骨细胞，减少了脂多糖所诱导的软骨细胞凋亡。流式结果显示，在脂多糖刺激的条件下，软骨细胞发生一定程度的凋亡，而在氧化苦参碱处理组中，软骨细胞的凋亡数显著减少。

(5)图5是软骨组织离体培养，氧化苦参碱可以延缓脂多糖所诱导的软骨组织块的退变。在软骨组织离体培养实验中，我们发现脂多糖的刺激下，软骨组织的蛋白聚糖显著丢失，表现为番红染色的丢失，与此同时，关节软骨特异性标记物ii型胶原的染色结果显示，在脂多糖的刺激下，ii型胶原的表达水平降低。而在氧化苦参碱处理组中，蛋白聚糖的丢失和ii型胶原的降解得到了有效的缓解，表明在氧化苦参碱的作用之下，关节软骨的退变得到了有效的抑制。

(6)图6是对离体培养的软骨组织的染色结果进行了统计。我们根据safranino和ii型胶原的强度对组织学染色进行了统计，发现组间比较具有统计学差异。

(7)图7是dmmb检测证实氧化苦参碱可以减少软骨组织糖胺聚糖释放，从而延缓软骨的退变。我们对软骨组织离体培养的上清液进行了糖胺聚糖含量的检测，结果发现，脂多糖刺激组，上清中的糖胺聚糖含量显著较未处理组升高，而在氧化苦参碱的干预之下，组织糖胺聚糖的释放得到了有效的抑制。

(8)图8是氧化苦参碱抑制软骨细胞中的nf-kb和mapk信号通路的激活。我们对氧化苦参碱抑制软骨细胞的机制进行了进一步的研究，我们发现，在软骨细胞中，氧化苦参碱可以明显抑制nf-kb信号通路的激活，同时mapk信号通路的激活也可以被氧化苦参碱显著抑制。这些炎症损伤相关信号通过激活所引起的炎症级联反应和加速软骨细胞的炎症反应和分解代谢，氧化苦参碱抑制了这些信号通路的激活，进而抑制了软骨细胞的炎性退变。

(9)进一步，我们运用核质分离和免疫荧光进一步验证了nf-kb信号通路中p65的入核情况，如图9所示。以上结果均与westernblot结果一致，说明，氧化苦参碱可以通过抑制炎症相关信号通路的激活，进而抑制软骨细胞的炎性退变。

(10)进一步，我们在动物实验中对我们的结果进行了进一步的验证，如图10所示。我们先运用h&e，safranino/fastgreen染色检测了小鼠关节软骨的退变情况。结果发现，与空白对照组相比，在前叉韧带切断组中，关节软骨磨损严重，局部可见软骨完全剥脱，露出软骨下骨，而在氧化苦参碱注射组中，小鼠关节软骨的磨损显著减轻。同时，我们对各组切片做了tunel染色，检测小鼠关节软骨细胞的凋亡情况，结果显示，在前叉韧带离断组中，关节软骨细胞凋亡明显，而氧化苦参碱可以显著减少关节软骨细胞的凋亡。综合以上结果，腹腔注射氧化苦参碱即可减轻小鼠关节软骨损伤退变。

(11)图11是免疫组化证实氧化苦参碱注射可以抑制软骨组织内的nf-kb信号通路的激活，抑制基质金属蛋白酶的表达，从而延缓软骨退变。我们运用免疫组化染色检测了各种小鼠关节软骨的nf-kb信号通路激活情况，同时检测了基质金属蛋白酶mmp9和mmp13的表达水平，结果显示，在前叉韧带离断组中，小鼠关节软骨层中nf-kb信号通路显著激活，相应的分解代谢酶表达升高；而在氧化苦参碱注射组中，关节软骨层nf-kb激活较轻，基质金属蛋白酶的表达水平也较低。结果表明，在体条件下，氧化苦参碱显示出了满意的软骨保护作用效应。

结论：我们研究了氧化苦参碱对于软骨细胞炎症反应和分解代谢反应的抑制作用，氧化苦参碱在细胞水平保护了软骨细胞，延缓其退变。与此同时，我们建立小鼠关节炎模型，腹腔注射氧化苦参碱，在体内进一步验证了氧化苦参碱对于软骨的保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。