洛伐他汀在制备治疗HIV‑1药物中的应用的制作方法

本发明涉及抗病毒药物领域，更具体地，涉及一种抗hiv-1病毒药物通过特异性拮抗nef蛋白，恢复细胞表面的mhc分子，从而增强免疫系统识别并清除病毒感染细胞方面的应用。

背景技术：

人类免疫缺陷病毒1型(humanimmunodeficiencyvirus1,hiv-1)感染后，联合抗逆转录病毒疗法(combinedantiretroviraltherapy,cart)可以有效地抑制病毒复制。然而，由于病毒整合在被感染细胞中并形成一个稳定的潜伏感染储存库，被感染者一旦停止cart治疗，病毒血症即在短时间内再爆发，这构成了治愈hiv-1感染的主要障碍。尽管目前市场上有多种抗hiv-1的药物，但是随之产生的耐药性、巨额的医药费用、药物的毒副作用等问题也不容小觑。

当前的研究热点是通过特异性的潜伏感染逆转药物(latency-reversingagents,lras)激活潜伏感染的病毒，进而药物治疗或诱导机体免疫系统杀灭被感染细胞。这种干预策略被称为“shockandkill”。然而，hiv-1可以迅速的发生突变，并且通过编码的nef等蛋白下调被感染细胞膜表面的mhc分子，逃避免疫识别。因此在感染患者体内，即使成功激活了病毒潜伏感染，体内的cd8⁺t淋巴细胞仍缺乏对hiv-1有效的免疫应答，无法彻底清除病毒潜伏感染储藏库。

因此亟需研发针对nef蛋白的特异性的药物，以恢复mhc分子的表达，从而使病毒感染细胞重新暴露于免疫监控之下，并在患者体内重建强有力的免疫监控机能，最大程度上清除病毒储藏库，最终达到功能性治愈艾滋病的目的。

洛伐他汀(化学名称：(s)-2-甲基丁酸-(1s,3s,7s,8s,8ar)-1,2,3,7,8,8a-六氢-3,7-二甲基-8-{2-[(2r,4r)-4-羟基-6氧代-2-四氢，化学式：)在体内竞争性地抑制胆固醇合成过程中的限速酶羟甲戊二酰辅酶a还原酶，使胆固醇的合成减少，也使低密度脂蛋白受体合成增加，主要作用部位在肝脏，结果使血胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平降低，由此对动脉粥样硬化和冠心病的防治产生作用。本品还降低血清甘油三酯水平和增高血高密度脂蛋白水平。在小鼠，给3-4倍人用剂量可以致癌，但在人类大规模长期临床试验中未见肿瘤发生增加。已有的研究未发现本品有致突变作用。未有实验数据显示其可以用于hiv的辅助治疗。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供洛伐他汀在制备hiv-1辅助治疗药物中的应用。

本发明的另一个目的在提供一种治疗hiv-1的组合物。

本发明所采取的技术方案是：

发明人通过研究发现，洛伐他汀可以有效拮抗hiv-1的nef蛋白，通过特异性拮抗nef蛋白，恢复细胞表面的mhc分子，从而增强免疫系统识别并清除病毒感染细胞，实现了hiv-1的治疗。

一种治疗hiv-1的组合物，其活性成分包括潜伏hiv-1激活剂，以及洛伐他汀或其药学上可接受的衍生物中的至少一种。

洛伐他汀药学上可接受的衍生物为在体内可以水解或酶解得到洛伐他汀的洛伐他汀衍生物。

作为上述治疗hiv-1的组合物的进一步改进，还包括hiv-1病毒复制抑制剂。

作为上述治疗hiv-1的组合物的进一步改进，潜伏hiv-1激活剂为单宁酸。。

本发明的有益效果是：

本发明采用小分子药物洛伐他汀通过特异性拮抗nef蛋白，恢复细胞表面的mhc分子，从而增强免疫系统识别并清除病毒感染细胞，并且找出了其抗病毒治疗的最适浓度，该方法具有效果显著、安全性高、成本低廉等优点，为抗病毒治疗与清除病毒潜伏感染储藏库提供了良好的技术支持。

通过与潜伏hiv-1激活剂联合使用，可以有效将潜伏hiv激活，从而实现对hiv潜伏感染的治疗。

附图说明

图1.hek293t细胞中，分别转染了nef-gfp质粒和对照的gfp治疗，加入不同浓度的洛伐他汀，检测mhc阴性细胞的比例(a)以及药物对细胞表面mhc恢复率；

图2.cd4⁺t细胞中，感染hivnl4-3以降解mhc分子，然后加入不同浓度的洛伐他汀，检测细胞表面mhc恢复情况；

图3.洛伐他汀促进cd8⁺t细胞清除病毒感染的cd4⁺t细胞的模式图；

图4.hivnl4-3感染的cd4⁺t细胞中，加入不同浓度的洛伐他汀处理细胞，然后与自体cd8⁺t细胞混合培养，检测cd8⁺t细胞对病毒感染的cd4⁺t细胞的杀伤作用；

图5.洛伐他汀与nef蛋白互作的计算机模拟结构示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实验对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

洛伐他汀对细胞mhc分子恢复的影响

1)将一个生长状态的hek293t细胞平均铺于用多聚赖氨酸处理的12孔培养皿中(细胞密度约为6.5×10⁴/cm²)，要求细胞呈单个均匀分布，并置于1ml含10％胎牛血清的dmem完全培养基中；

2)培养约24小时后，细胞汇合度应接近50％，利用脂质体向各孔中转染nef-gfp质粒和对照的gfp质粒，每孔转染的质粒量为1000ng。nef可以降解细胞表面的mhc分子，通过gfp指示转染效率；

3)转染后第12小时，向各孔中加入洛伐他汀处理细胞，浓度依次为0μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μm、4μm、6μm、8μm、10μm、12μm，每个浓度设置3组重复；

4)处理24小时后，收集细胞，对细胞表面的mhc分子进行染色标记，然后利用流式细胞术进行检测mhc阴性细胞的比例，以没有药物处理的nef-gfp转染组组作为阴性对照，以gfp转染组作为阳性对照，通过公式(nef-gfp组-实验组)/(nef-gfp组-gfp组)计算hek293t细胞中下调的mhc分子的恢复比例。

结果如图1显示：随着药物浓度的增加，mhc阴性的细胞随之减少；当药物浓度低于6μm时候，存在明显的剂量依赖效应；当药物浓度达到6μm以上时，mhc分子最高达到70％的恢复率，说明mhc能够在hek293t细胞中拮抗hiv-1编码的nef蛋白对mhc分子下调。

洛伐他汀对感染hiv-1nl4-3的cd4⁺t细胞中mhc恢复的影响

人的外周成分血由广州市血液中心提供，试验中随机选取了4份正常人的血液样本。

1)首先将外周成分血与含2％bsa和0.5％edta的pbs按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g30分钟；

2)小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的含0.5％bsa和2％edta的pbs稀释，混合均匀后，离心300×g15分钟；

3)重复上一步骤一次；孵育cd4⁺t细胞阴选一抗，15分钟；用10倍体积的含0.5％bsa和2％edta的pbs稀释，混合均匀后，离心300×g12分钟；孵育带有磁珠的二抗，30分钟；过柱进行细胞分选，得到cd4⁺t细胞；

4)然后将分选出来的cd4⁺t细胞铺在12孔板中，按照实验设计，每孔细胞数为1×10⁶细胞，并置于1ml含10％胎牛血清的rpmi1640完全培养基中，利用pha(工作浓度为1μg/ml)和il-2(工作浓度为10ng/ml)激活cd4⁺t细胞；

5)细胞激活48小时后，利用野生型病毒hiv-1nl4-3(病毒p24工作浓度相当于100ng/ml)感染1×10⁶个cd4⁺t淋巴细胞，感染体积为1ml，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene来增强病毒感染力；

6)感染后第5天，对cd4⁺t细胞进行药物处理，浓度分别为5μm和10μm，对照为dmso处理组，每种处理方式设置三个复孔作为平行对照；

7)处理48小时后，收集细胞，对细胞表面的cd4、mhc分子以及病毒抗原p24进行染色标记，然后利用流式细胞术检测感染hiv-1nl4-3的cd4⁺t细胞表面mhc阴性和阳性细胞的比例。

结果如图2显示：洛伐他汀可以明显恢复感染hiv-1nl4-3的cd4⁺t细胞中mhc；随着药物浓度的增加，mhc阴性的细胞随之减少，阳性细胞相应增加。进一步说明mhc能够在cd4⁺t细胞中拮抗野生型hiv-1病毒对mhc分子的下调，从而增强免疫系统对病毒感染细胞的识别。

洛伐他汀对cd8⁺t细胞杀伤效果的影响

利用cd4⁺t细胞作为hiv-1的感染靶标，并加入洛伐他汀处理病毒感染的cd4⁺t细胞；同时利用特异性抗原刺激并教育cd8⁺t细胞，然后将cd4⁺t和cd8⁺t细胞混合培养，并检测洛伐他汀处理后能否增强cd8⁺t细胞的杀伤效果(图3)。

具体实施步骤如下：

人的外周成分血由广州市血液中心提供，试验中随机选取了4份正常人的血液样本。

1)首先将外周成分血与含2％bsa和0.5％edta的pbs按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g30分钟；

2)小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的含0.5％bsa和2％edta的pbs稀释，混合均匀后，离心300×g15分钟；重复上一步骤一次；

3)让后将分离的得到的pbmc平均分成2份，分别进行cd4⁺和cd8⁺t细胞的分离富集；

4)分别孵育cd4⁺和cd8⁺t细胞阴选一抗，15分钟；用10倍体积的含0.5％bsa和2％edta的pbs稀释，混合均匀后，离心300×g12分钟；孵育带有磁珠的二抗，30分钟；过柱进行细胞分选，得到cd4⁺t和cd8⁺t细胞；

5)然后将分选出来的cd4⁺t细胞铺在12孔板中，按照实验设计，每孔细胞数为1×10⁶细胞，并置于1ml含10％胎牛血清的rpmi1640完全培养基中，利用pha(工作浓度为1μg/ml)和il-2(工作浓度为10ng/ml)激活cd4⁺t细胞；

6)细胞激活48小时后，利用野生型病毒hiv-1nl4-3(病毒p24工作浓度相当于100ng/ml)感染1×10⁶个cd4⁺t淋巴细胞，感染体积为1ml，并加入终浓度为8μg/ml的polybrene来增强病毒感染力；

7)野生型hiv-1nl4-3感染后第8天，对cd4⁺t细胞进行药物处理，浓度分别为1μm、2μm和4μm，对照为dmso处理组，每种处理方式设置三个复孔作为平行对照；

8)处理48小时后，1:1加入特异性抗原刺激的cd8⁺t细胞，继续进行培养。共培养48小时候后，收集细胞，对细胞表面的cd4、cd8分子以及病毒抗原p24进行染色标记，然后利用流式细胞术检测感染hiv-1nl4-3感染的cd4⁺t的比例(cd4⁺p24⁺)。

结果如图4显示：洛伐他汀可以明显提高cd8⁺t细胞的杀伤效果；随着药物浓度的增加，cd4⁺p24⁺的细胞随之减少。进一步说明洛伐他汀从而增强免疫系统对病毒感染细胞的识别，从而更有效地清除hiv-1病毒感染细胞。

洛伐他汀对hiv-nef蛋白的影响

从proteindatabank上下载蛋白hiv-nef、mhc-1和ap-1的mu1亚基复合体(pdbcode:4emz，分辨率：)。该蛋白符合体中bc链为nef，de链为mhc-1,am链为ap-1。采用chemdrew准备化合物洛伐他丁的结构。使用ligandscourt软件的autodock4.1程序预测化合物与蛋白复合体的结合模式，先选择整个蛋白复合体作为结合口袋，保留最多20个构象，对各构象的结合能进行打分，打分较高的构象集中在ab链，然后选定ab链作为结合口袋，再进行对接，最终选择构象9为最可能结合构象，结合能量为-6.8kcal/mol。

对该结合构象进行分析，化合物中的-oh与ap-1蛋白的lys302有氢键相互作用，萘环及萘环上的取代基与nef蛋白上的phe68及leu112有疏水相互作用。结果如图5显示：在蛋白模拟结构接结合模型中，nef蛋白和mhc蛋白的结合界面的口袋位置有洛伐他汀的结合位点，进一步说明了洛伐他汀直接影响了二者的结合，从而拮抗了nef对mhc的降解。

本发明采用小分子药物洛伐他汀通过特异性拮抗nef蛋白，恢复细胞表面的mhc分子，从而增强免疫系统识别并清除病毒感染细胞，并且找出了其抗病毒治疗的最适浓度，该方法具有效果显著、安全性高、成本低廉等优点，为抗病毒治疗与清除病毒潜伏感染储藏库提供了良好的技术支持。

通过与潜伏hiv-1激活剂联合使用，可以有效将潜伏hiv激活，从而实现对hiv潜伏感染的治疗。