一种pH敏感聚离子胶束和嵌段聚合物的制备方法与流程

本发明属于高分子功能材料领域，具体涉及一种ph敏感聚离子胶束和嵌段聚合物的制备方法。

背景技术：

龋病是人类最常见的细菌性疾病，世界卫生组织已将其与肿瘤和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。菌斑生物膜是粘附于牙齿表面的微生物团体，是龋病发生的始动因子。正常情况下，生物膜内部的微生态处于平衡状态。若摄糖频率增加，致龋菌在菌斑中代谢产酸，ph值会达到4.5-5.5。这种酸性微环境有利于致龋菌的增殖，使得微生态平衡向脱矿方向转变，最终导致龋病的发生。氯己定(chx)是一种带正电荷的广谱性抗菌剂，主要通过附着细菌的细胞膜，破坏其渗透平衡并导致细胞内物质漏出，从而起到良好的抗菌作用。三十年来，它一直被认为是龋病和齿龈炎的金指标并且广泛地应用于临床牙科。然而，持续使用氯己定可能会导致味觉失调和牙齿着色。

基于以上现状，需要构思一个方案来减小抗菌药物氯己定对口腔正常组织的危害，并且提高它对致龋菌生物膜的生物利用度。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种ph敏感聚离子胶束和嵌段聚合物的制备方法，这种ph敏感的聚离子胶束具有显著的ph敏感性和良好的抗菌性能。

具体地说，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种ph敏感聚离子胶束，为核壳结构，由ph敏感且末端带有负电荷的嵌段聚合物与带有正电荷的抗菌药物氯己定通过电荷作用制备而成。

具体的，ph敏感聚离子胶束的制备方法包括以下过程：将嵌段聚合物溶于超纯水，配制成浓度为2mg/ml的聚合物溶液；然后将聚合物溶液过220nm滤膜，将浓度为2mg/ml抗菌药物葡萄糖酸氯己定溶液使用微量注射泵滴加到过滤后的聚合物溶液中，搅拌均匀；所得的混合物在冰浴条件下继续搅拌2.5小时得到聚离子胶束溶液，选用截留分子量1000da透析袋，将聚离子胶束溶液在冰浴条件下透析，除去未吸附的抗菌药物，收集到ph敏感聚离子胶束溶液。

上述结构的ph敏感聚离子胶束，由于其核壳结构，在中性ph环境下能较稳定地存在并将抗菌药物包载于胶束核心处，而在酸性ph环境下迅速崩解并释放抗菌药物氯己定。该ph敏感聚离子胶束本身能在中性环境下稳定存在，从而减小抗菌药物氯己定对正常口腔组织的毒性。

同时，上述的聚离子胶束具有显著的ph敏感性，能在致龋菌生物膜这种酸性位点处能迅速崩解，释放正电荷的抗菌药物氯己定并进行抗菌作用。

作为一种具体的工艺实现，本发明还提供一种用于制备ph敏感聚离子胶束的嵌段聚合物，所述嵌段聚合物的化学结构式如下：

该嵌段聚合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)基于化学反应i合成大分子引发剂peg-br：

(2)基于化学反应ⅱ合成嵌段聚合物peg-b-phema：

(3)基于化学反应ⅲ合成嵌段聚合物peg-b-paecoema：

(4)基于化学反应ⅳ合成嵌段聚合物peg-b-paecoema/ca：

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明提供了一种新型聚合物纳米载体，能够减小抗菌药物氯己定对口腔健康组织的毒副作用，提高它对致龋菌生物膜的生物利用度。

2.实验表明：本发明所述ph敏感聚离子胶束证实了所述聚离子胶束的ph敏感性，即该胶束在中性ph环境下能较稳定地存在并将抗菌药物包载于胶束核心处，而在酸性ph环境下迅速崩解并释放抗菌药物氯己定。本发明通过实验证实了所述聚离子胶束能在致龋菌生物膜这种酸性位点处进行崩解释药，体现出良好的抗菌性能。

3.本发明还提供了上述ph敏感嵌段聚合物的制备方法，该方法采用常规原料及设备即可实现。

附图说明

图1是实施例1制备的peg-br(a)，peg-b-phema(b)，peg-b-paecoema(c)和peg-b-paecoema/ca(d)的核磁氢谱图；

图2是实施例1制备的peg-br，peg-b-phema，peg-b-paecoema和peg-b-paecoema/ca的分子量以及分子量分布；

图3是实施例1制备的嵌段聚合物peg-b-paecoema/ca的柠康酰胺键在不同ph值下的断裂率；

图4是实施例3制备的ph敏感聚离子胶束的afm图；

图5(a)是实施例3制备的ph敏感聚离子胶束的粒径分布在ph5.5条件下的变化趋势；

图5(b)是实施例3制备的ph敏感聚离子胶束的粒径分布在ph7.4条件下的变化趋势；

图6是实施例3制备的ph敏感聚离子胶束在不同ph值下的释药曲线；

图7(a)是用超纯水处理致龋菌生物膜的死活染图片；

图7(b)是用实施例3制备的ph敏感聚离子胶束处理致龋菌生物膜的死活染图片。

具体实施方式

以下通过实施例并结合附图对本发明所述ph敏感聚离子胶束及其制备方法与应用作进一步说明。

实施例1

本实施例中，提供ph敏感嵌段聚合物的制备方法，其合成步骤如下：

(1)合成大分子引发剂peg-br：

首先，将聚乙二醇单甲醚peg(mn＝2000，2g，1mmol)和三乙胺(417μl，3mmol)溶于10ml二氯甲烷中，冰浴15分钟，然后滴加2-溴异丁酰溴(378μl，3mmol)。混合溶液先在冰浴条件下搅拌2小时，然后再在室温条件下反应24小时。将反应完的混合溶液过滤除去不溶性盐，再将过滤后的产物经旋转蒸发器浓缩除去有机溶剂。将得到的粗产物转移到小烧杯中，加入大量的冰乙醚进行沉淀。最后用布氏漏斗抽滤除去乙醚溶剂，将固体产物放入真空烘箱中进行真空干燥，干燥完后得到产物大分子引发剂peg-br。

上述化学反应过程如下化学反应式i所涵盖：

(2)合成嵌段聚合物peg-b-phema：

将大分子引发剂peg-br(430mg，0.2mmol)，2,2'-联吡啶(62.4mg，0.4mmol)和甲基丙烯酸羟乙酯(181.5μl，1.5mmol)加入到装有6ml甲醇/水混合溶剂(5/1，v/v)的圆底烧瓶(25ml)中。混合物在冰浴条件下搅拌15分钟后，液面下鼓吹氩气除去反应瓶中的氧气。随后，迅速将氯化亚铜(19.8mg，0.2mmol)加入到反应瓶中，通过三次“真空-通氩”循环充分除去反应瓶中残余的氧气。然后将圆底烧瓶转移到40℃的恒温油浴中反应12小时。最后将反应液敞放在空气中搅拌以终止聚合反应，再用截留分子量为1000da的透析袋透析至无色，将无色液体冻干后得到的产物就是嵌段聚合物peg-b-phema。

上述化学反应过程如下化学反应式ⅱ所涵盖：

(3)合成嵌段聚合物peg-b-paecoema：

先将n,n'-羰基二咪唑(991mg，6mmol)溶于20ml二氯甲烷，再在冰浴条件下冷却15分钟。然后将嵌段聚合物peg-b-phema(475mg)溶于5ml二氯甲烷，并且加入到上述溶液中室温反应18小时。将反应完的混合液放在冰浴条件下冷却15分钟，加入乙二胺(1200μl，18mmol)继续在室温下反应12小时。反应结束后，将最后的混合液用旋转蒸发器除去二氯甲烷溶剂，再加入少量甲醇溶液，然后用超纯水透析(截留分子量1000da)除去副产物，冻干后可得到嵌段聚合物peg-b-paecoema。

上述化学反应过程如下化学反应式ⅲ所涵盖：

(4)合成嵌段聚合物peg-b-paecoema/ca：

先将嵌段聚合物peg-b-paecoema(29.7mg)溶于1ml二甲基亚砜，等到充分溶解之后，再将其加入到6ml吡啶溶剂中。然后将柠康酸酐(344μl，3.75mmol)慢慢滴加到上述溶液中，在25℃下搅拌过夜。反应结束之后，使用截留分子量3500da的透析袋将最后的反应液在碳酸氢钠溶液和超纯水中透析除去杂质。冻干后得到嵌段聚合物peg-b-paecoema/ca。

上述化学反应过程如下化学反应式ⅳ所涵盖：

以上各个产物的特性如图1到图3所示，图1是制备的peg-br(a)，peg-b-phema(b)，peg-b-paecoema(c)和peg-b-paecoema/ca(d)的核磁氢谱图；图2是制备的peg-br，peg-b-phema，peg-b-paecoema和peg-b-paecoema/ca的分子量以及分子量分布；图3是制备的嵌段聚合物peg-b-paecoema/ca的柠康酰胺键在不同ph值下的断裂率。

实施例2

本实施例中，测定实施例1制备的嵌段聚合物peg-b-paecoema/ca的柠康酰胺键的ph敏感降解行为。柠康酰胺键的降解速率由荧光胺法测得。

将嵌段聚合物peg-b-paecoema/ca溶于超纯水配制成1mg/ml浓度的聚合物溶液。将上述的聚合物溶液和ph5.5的醋酸缓冲液(10mm)或者ph7.4的磷酸缓冲液(10mm)共混。混合液在37℃条件下培养，在预设的时间内取50μl混合液体溶于3mlph9.1的硼酸盐缓冲液(0.1m)，再加入50μl荧光胺的dmf溶液(0.5mg/ml)，室温培养10分钟。其荧光强度由荧光分光光度计(rf-6000,shimadzu)测得。

实施例3

本实施例中，提供ph敏感聚离子胶束的制备方法，其步骤如下：

将嵌段聚合物peg-b-paecoema/ca溶于超纯水，配制成浓度为2mg/ml的溶液。然后将聚合物溶液过220nm滤膜，除去可能存在的杂质。然后将稀释过后葡萄糖酸氯己定溶液(2mg/ml)使用微量注射泵将其慢慢滴加到上述的聚合物溶液中，搅拌均匀。所得的混合物在冰浴条件下继续搅拌2.5小时。选用截留分子量1000da透析袋，将聚离子胶束溶液在冰浴条件下透析，除去未吸附的抗菌药物。最后收集ph敏感聚离子胶束溶液。

图4是实施例3制备的ph敏感聚离子胶束的afm图；

实施例4

本实施例中，测定实施例3制备的聚离子胶束粒径的ph敏感变化。

实施例3制备的聚离子胶束粒径的ph敏感变化分别在ph7.4和ph5.5的缓冲液(10mm)中测得。将制备得到的聚离子胶束溶液分别缓慢滴加到ph7.4和ph5.5的缓冲液(10mm)中，混合液在37℃条件下培养。在预设的时间内，取50μl液体到动态光散射专用的测试皿中，并测得其粒径以及粒径分布。动态光散射的温度设置为37℃，分散角设置为90度。

结果如图5(a)是实施例3制备的ph敏感聚离子胶束的粒径分布在ph5.5条件下的变化趋势；图5(b)是实施例3制备的ph敏感聚离子胶束的粒径分布在ph7.4条件下的变化趋势。

实施例5

本实施例中，测定实施例3制备的聚离子胶束溶液的ph敏感释药行为。

抗菌药物氯己定的ph敏感释放曲线分别在ph7.4和ph5.5的缓冲液(10mm)中测得。将制备得到的聚离子胶束溶液(5ml，0.5mg/ml)转移到截留分子量1000da的透析袋中，并确保将其浸没在45ml不同ph值的缓冲液中进行药物释放试验(震荡速度100rpm，培养温度37℃)。在预设的时间内，取1ml透析袋外的药物释放液，并加入1ml相应ph值的新鲜缓冲液。释放液的氯己定药物浓度通过紫外分光光度计测得。

图6是实施例3制备的ph敏感聚离子胶束在不同ph值下的释药曲线。

实施例6

本实施例中，测定实施例3制备的聚离子胶束溶液在致龋菌生物膜处的抗菌性能。

为了评估聚离子胶束溶液的抗菌性能，将生长在羟基磷灰石片表面的变异链球菌生物膜用聚离子胶束溶液处理1小时，再用死活染法来检测生物膜的死菌活菌情况，其具体操作步骤如下。

首先，挑取streptococcusmutansua159单菌落置于装有4ml脑心浸液肉汤的培养基中，再将其放置在厌氧条件下37℃过夜培养。第二天时将培养好的菌液取出，进一步稀释至浓度为1.0×10⁶cfu/ml，待用。将直径为5mm、厚度2mm的羟磷灰石片于紫外灯下消毒后置入48孔板中。然后在孔板中加入新鲜的菌悬液，再在37℃下厌氧培养48小时。将生长在羟基磷灰石片表面的致龋菌生物膜用聚离子胶束溶液(1mg/ml)处理1小时。然后将处理过的羟基磷灰石片取出，用磷酸盐缓冲液冲洗去除未黏附细菌。避光条件下，在羟基磷灰石片表面滴入死活染荧光染料，放置15分钟，再用磷酸盐缓冲液冲洗去除多余染料，置干。将羟基磷灰石片放入48孔板中，避光保存。在共聚焦显微镜下观察变异链球菌生物膜荧光染色情况。

图7(a)是用超纯水处理致龋菌生物膜的死活染图片；图7(b)是用实施例3制备的ph敏感聚离子胶束处理致龋菌生物膜的死活染图片。