突变的截短的vonWillebrand因子的制作方法

本申请与2016年1月7日递交的澳大利亚专利申请第2016900034号相关并要求其优先权，其完整内容通过引用并入本文。发明领域本发明涉及多肽，尤其是表现出对因子viii改进的结合亲和力的修饰的截短的vonwillebrand因子。本发明还涉及包含所述多肽和fviii的复合物、涉及编码本发明的多肽的多核苷酸以及产生所述多肽的方法。进一步地，本发明涉及本发明的多肽或复合物用于治疗凝血障碍的治疗性或预防性用途。发明背景存在由凝血因子缺陷导致的多种出血障碍。最常见的障碍是血友病a和b，分别由凝血因子viii和ix缺陷导致。另一种已知的出血障碍是vonwillebrand病。在血浆中，fviii主要以与vwf的非共价复合物存在，并在膜结合的活化的因子x生成复合物中作为活化的因子ix的辅因子起作用。已经进行了若干尝试以延长未活化的fviii的半衰期：通过减少其与细胞受体的相互作用(wo03/093313a2、wo02/060951a2)、通过共价地附接聚合物于fviii(wo94/15625、wo97/11957和us4970300)、通过包封fviii(wo99/55306)、通过引入新的金属结合位点(wo97/03193)、通过由肽键(wo97/40145和wo03/087355)或二硫键(wo02/103024a2)共价地附接a2结构域与a3结构域、或通共价地附接a1结构域与a2结构域(wo2006/108590)。增强fviii或vwf的功能性半衰期的另一方法是通过fviii的peg化(wo2007/126808、wo2006/053299、wo2004/075923)。也已经尝试vwf的peg化(wo2006/071801)以试图间接增强血浆中存在的fviii的半衰期。还已描述了fviii的融合蛋白(wo2004/101740、wo2008/077616和wo2009/156137)。在不同形式的vonwillebrand病(vwd)中丢失、功能上缺陷或仅以减少的量可得的vwf是在血浆中存在的多聚粘附糖蛋白，其具有多种生理功能。在原发性止血期间，vwf作为血小板表面上的特定受体与细胞外基质的组分诸如胶原之间的介体起作用。而且，vwf作为促凝血的fviii的载体和稳定蛋白起作用。vwf在内皮细胞和巨核细胞中作为2813个氨基酸的前体分子合成。野生型vwf的氨基酸序列和cdna序列在collins等1987,procnatl.acad.sci.usa84:4393-4397中公开。前体多肽前-原-vwf(pre-pro-vwf)由22-残基信号肽、741-残基原肽(pro-peptide)和血浆中发现的2050-残基多肽组成(fischer等,febslett.351:345-348,1994)。在内质网中裂解信号肽之后，在vwf的两个单体之间形成c-末端二硫键桥。在经由分泌途径的进一步转运期间，加入12个n-连接的和10个o-连接的糖类侧链。重要地，vwf二聚体经n-末端二硫键桥被多聚化，且741个氨基酸的原肽在晚期高尔基体中被酶pace/弗林蛋白酶裂解掉。原肽以及vwf的高分子量多聚体(vwf-hmwm)储存在内皮细胞的weibel-pallade小体中或在血小板的α-颗粒体中。在被分泌到血浆中后，蛋白酶adamts13在vwf的a1结构域内裂解vwf。血浆vwf由一系列多聚体组成，范围从500kda的单个二聚体至分子量超过10,000kda的由多于20个二聚体组成的多聚体。通常，vwf高分子量多聚体(vwf-hmwm)具有最强的止血活性，其可以在瑞斯托菌素辅因子活性(ristocetincofactoractivity)中测量(vwf:rco)。vwf:rco/vwf抗原的比率越高，高分子量多聚体的相对量越高。vwf缺陷是vonwillebrand病(vwd)的原因，其特征为或多或少明显的出血表型。vwd3型是最严重的形式，其中vwf完全丢失，vwd1型涉及vwf的量的损失且其表型可能是非常轻微的。vwd2型涉及vwf的量的缺陷且可能与vwd3型一样严重。vwd2型具有许多亚型，其中一些与高分子量多聚体的损失或减少相关。vonvwd2a型的特征为中等和大的多聚体的损失。vwd2b型的特征为最高分子量的多聚体的损失。vwd是人类中最常见的遗传性出血障碍，并可用包含血浆或重组来源的vwf的浓缩物的替代疗法治疗。vwf可从人类血浆制备，如例如在ep05503991中描述的。ep0784632描述了用于产生和分离重组vwf的方法。在血浆中，fviii以高亲和力结合vwf，这保护其免于过早分解代谢并因此除了其在原发性止血中的作用以外，在调节fviii的血浆水平中起重要作用，因此也是次级止血的调控中的重要因子。结合于vwf的未活化的fviii在血浆中的半衰期是约12至14小时。在其中无或几乎无vwf存在的vonwillebrand病3型中，fviii的半衰期是仅约6小时，导致此类患者中轻度至中度血友病a的症状(由于fviii的浓度减少)。vwf对fviii的稳定效应也已被用来帮助fviii在cho细胞中的重组表达(kaufman等1989,molcellbiol)。发明概述在本申请人的共同待决的国际专利申请第pct/au2015/050369号中，公开了vwf的结构域d’的多个修饰可以增加与因子viii的结合。该申请的公开内容通过交叉引用并入本文。本发明的发明人现在发现，vwf与因子viii的结合可以通过d’中的其他修饰，特别是通过d3结构域中的修饰来增加。因此，本发明涉及以下实施方案[1]至[93]：[1]一种多肽，所述多肽包含截短的vonwillebrand因子(vwf)，所述截短的vonwillebrand因子包含seqidno：3中示出的序列或其片段或与其90％相同的序列，其中与seqidno：3相比所述截短的vwf在选自由以下组成的组的至少一个位置处包含至少一个修饰：s1、s3、l18、v42、s43、k149、n248、s279、v320、t325、q395和k418；且其中所述截短的vwf结合因子viii(fviii)。[2]如项目1所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：3中示出的序列，其中与seqidno：3相比所述截短的vwf在选自由以下组成的组的至少一个位置处包含至少一个修饰：s1、s3、l18、v42、s43、k149、n248、s279、v320、t325、q395和k418；且其中所述截短的vwf结合因子viii(fviii)。[3]如项目1或项目2所述的多肽，其中所述截短的vwf以低于包含未修饰的seqidno：3的参考多肽的解离速率结合因子viii。[4]如项目3所述的多肽，其中所述修饰的多肽以比所述参考多肽低至少5倍的解离速率结合因子viii。[5]如项目3所述的多肽，其中所述修饰的多肽以比所述参考多肽低至少10倍的解离速率结合因子viii。[6]如项目3所述的多肽，其中所述修饰的多肽以比所述参考多肽低至少5倍的kd结合因子viii。[7]如项目6所述的多肽，其中所述修饰的多肽以比所述参考多肽低至少10倍的解离速率结合因子viii。[8]如项目1至7任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含至少两个修饰。[9]如项目1至8任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含至少三个修饰。[10]如项目1至9任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：5(s764p/s766w/v1083a)。[11]如项目1至9任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：6(s764g/s766y/v1083a)。[12]如项目1至9任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：7(s764e/s766y/v1083a)。[13]如项目1至9任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：8(n1011s/v1083a/k1181e)。[14]如项目1至8任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：17(s766y/v1083a)。[15]如项目1至7任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：9(v1083a)。[16]如项目1至7任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：10(s1042t)。[17]如项目1至8任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：11(v805a/q1158l)。[18]如项目1至8任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：12(k912e/t1088s)。[19]如项目1至7任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：13(l781p)。[20]如项目1至19任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf还包含seqidno：2的残基1243至1247。[21]如项目1至20任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf还包含seqidno：2的残基1243至1270。[22]如项目1至19任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf缺少seqidno：2的残基1243至1247。[23]如项目22所述的多肽，其中所述截短的vwf缺少seqidno：2的残基1243至2813。[24]如项目22或项目23所述的多肽，其中seqidno：3被修饰，使得在位置1处的残基选自由以下组成的组：g、p、v、e、y、a和l。[25]如项目22至24任一项所述的多肽，其中seqidno：3被修饰，使得在位置3处的残基选自由以下组成的组：y、i、m、v、f、h、r和w。[26]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：18(s764g/s766y)。[27]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：19(s764p/s766i)。[28]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：20(s764p/s766m)。[29]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：21(s764v/s766y)。[30]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：22(s764e/s766y)。[31]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：23(s764y/s766y)。[32]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：24(s764l/s766y)。[33]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：25(s764p/s766w)。[34]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：26(s766w/s806a)。[35]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：27(s766y/p769k)。[36]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：28(s766y/p769n)。[37]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：29(s766y/p769r)。[38]如项目22至24任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf包含seqidno：30(s764p/s766l)。[39]一种多肽，所述多肽结合因子viii，其中所述截短的vwf包含seqidno：3中示出的序列或其片段，其中所述序列包含在至少位置320处和位置1和/或3处的修饰，使得所述截短的vwf以比包含未修饰的seqidno：3的参考多肽低的解离速率结合因子viii。[40]如项目38所述的多肽，其中所述截短的vwf在seqidno：3的至少位置1、3和320处包含修饰。[41]如项目38或39所述的多肽，其中seqidno：3被修饰，使得在位置320处的残基是a。[42]如项目38至40任一项所述的多肽，其中seqidno：3被修饰，使得在位置3处的残基选自由以下组成的组：y、i、m、v、f、h、r和w。[43]如项目38至41任一项所述的多肽，其中seqidno：3被修饰，使得在位置1处的残基选自由以下组成的组：g、p、v、e、y、a和l。[44]如项目38至42任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf还包含seqidno：2的残基1243至1247。[45]如项目38至43任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf还包含seqidno：2的残基1243至1270。[46]如项目38至43任一项所述的多肽，其中所述截短的vwf缺少seqidno：2的残基1243至2813。[47]如项目1至46任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含半衰期延长部分。[48]如项目47所述的多肽，其中所述半衰期延长部分是融合至所述截短的vwf的异源氨基酸序列。[49]如项目48所述的多肽，其中所述异源氨基酸序列包含选自由以下组成的组的多肽或由选自由以下组成的组的多肽组成：免疫球蛋白恒定区及其部分例如fc片段、转铁蛋白及其片段、人绒毛膜促性腺素的c末端肽、被称为xten的具有大流体动力学体积的溶剂化的随机链、同氨基酸重复(homo-aminoacidrepeats,hap)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复(pas)、白蛋白、afamin、α-甲胎蛋白、维生素d结合蛋白、能够在生理条件下结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。[50]如项目47至49任一项所述的多肽，其中所述半衰期延长部分缀合至所述多肽。[51]如项目50所述的多肽，其中所述半衰期延长部分选自由以下组成的组：羟乙基淀粉(hes)、聚乙二醇(peg)、聚唾液酸(psa)、弹性蛋白样多肽、细菌肝素前体聚合物(heparosanpolymer)、透明质酸和白蛋白结合配体例如脂肪酸链，及其组合。[52]如项目49所述的多肽，其中所述异源氨基酸序列包含白蛋白。[53]如项目52所述的多肽，其中所述白蛋白的n-末端直接融合于或经由间隔物融合于所述修饰的多肽序列的c-末端。[54]如项目53所述的多肽，其中在所述多肽的天然c-末端的1至5个氨基酸被缺失。[55]如项目1至54任一项所述的多肽，其中所述多肽是包含n-聚糖的糖蛋白，且其中平均所述n-聚糖的至少75％、优选地至少85％、优选地至少90％、且更优选地至少95％包含至少一个唾液酸部分。[56]如项目55所述的多肽，其中平均所述n-聚糖的至少60％包含至少一个α-2,6-唾液酸部分。[57]如项目1至55任一项所述的多肽，其中所述多肽是二聚体。[58]一种复合物，所述复合物包含因子viii分子和项目1至57任一项所述的多肽。[59]如权利要求1至57任一项所述的多肽或项目58所述的复合物，用于在治疗或预防凝血障碍中使用。[60]根据项目59所述的用于使用的多肽或复合物，其中所述凝血障碍是vonwillebrand病(vwd)或血友病a。[61]一种药物组合物，所述药物组合物包含项目1至57任一项所述的多肽或项目58所述的复合物。[62]一种治疗凝血障碍的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用药学有效量的项目1至57任一项所述的多肽或项目58所述的复合物。[63]如项目62所述的方法，其中所述凝血障碍是vonwillebrand病(vwd)或血友病a。[64]如项目1至57任一项所述的修饰的多肽或项目58所述的复合物在制备用于治疗凝血障碍的药物中的用途。[65]如项目64所述的用途，其中所述凝血障碍是vonwillebrand病(vwd)或血友病a。[66]一种治疗凝血障碍的方法，所述治疗包括向具有内源性vwf的受试者施用如项目1至57任一项所述的多肽和因子viii(fviii)，其中待被施用的多肽与待被施用的fviii的摩尔比率大于50。[67]一种治疗凝血障碍的方法，所述治疗包括向具有内源性vwf的受试者施用如项目1至57任一项所述的多肽和因子viii(fviii)，其中所施用的多肽与内源性vwf的摩尔比率大于0.5。[68]如项目66或67所述的方法，其中所述受试者是人。[69]如项目66至68任一项所述的方法，其中所述多肽静脉内施用。[70]如项目66至69任一项所述的方法，其中与参考治疗相比，所述fviii的平均滞留时间(mrt)通过共同施用项目1至57任一项所述的多肽而延长，其中所述参考治疗与所述治疗相同，除了在所述参考治疗中，所述多肽和所述fviii以等摩尔量施用。[71]如权利要求66至70任一项所述的方法，其中与用单独的fviii的治疗相比，所述fviii的施用频率降低。[72]如项目66至71任一项所述的方法，其中如项目1至57任一项所述的多肽的血浆半衰期比内源性vwf的血浆半衰期长。[73]如项目73所述的方法，其中如项目1至57任一项所述的多肽的血浆半衰期比内源性vwf的血浆半衰期长至少25％。[74]一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)fviii和(ii)如项目1至57任一项所述的多肽，其中所述组合物中所述多肽与所述fviii的摩尔比率大于50。[75]一种药物试剂盒，所述药物试剂盒包含(i)fviii和(ii)项目1至57任一项中定义的多肽，用于在凝血障碍的治疗中同时、分别或依序使用，所述治疗包括向具有内源性vwf的受试者施用所述多肽和所述fviii，其中所施用的多肽与所述内源性vwf的摩尔比率大于0.5，和/或其中待被施用的多肽与待被施用的fviii的摩尔比率大于50。[76]如项目1至57任一项中定义的多肽用于改善fviii的血浆半衰期和/或用于降低fviii的施用频率的用途。[77]一种治疗凝血障碍的方法，所述方法包括向具有内源性vwf的患者施用有效量的项目1至57任一项中定义的多肽和fviii，其中所施用的多肽与所述内源性vwf的摩尔比率大于0.5，和/或其中待被施用的多肽与待被施用的fviii的摩尔比率大于50。[78]一种多核苷酸，所述多核苷酸编码项目1至57任一项的多肽。[79]一种质粒或载体，所述质粒或载体包含如项目78所述的多核苷酸。[80]如项目79所述的质粒或载体，所述质粒或载体是表达载体。[81]一种宿主细胞，所述宿主细胞包含项目78所述的多核苷酸或项目79或80所述的质粒。[82]一种产生包含截短的vwf的多肽的方法，所述方法包括：(i)在使得所述包含截短的vwf的多肽被表达的条件下，培养项目81所述的宿主细胞；和(ii)任选地从所述宿主细胞或从培养基回收所述包含截短的vwf的多肽。[83]一种延长因子viii的半衰期的方法，所述方法包括将所述因子viii与如项目1至57任一项所述的多肽混合。[84]一种产生项目1至57任一项中的多肽的方法，所述多肽包含具有增加的唾液酸化的n-聚糖，所述方法包括(i)提供包含编码项目1至57任一项中的多肽的核酸的细胞，和(ii)在低于36.0℃的温度培养所述细胞。[85]一种产生项目1-57任一项中的多肽的二聚体或用于增加所述多肽的二聚体化的方法，所述方法包括(i)提供包含编码项目1至57任一项中的多肽的氨基酸序列的核酸的细胞，和(ii)在低于36.0℃的温度培养所述细胞。[86]如项目84或85所述的方法，其中所述细胞还包含编码唾液酰基转移酶，优选地α-2,6-唾液酰基转移酶或α-2,3-唾液酰基转移酶的重组核酸。[87]项目84至86任一项所述的方法，其中在步骤(ii)前，在37.0℃±1.0℃的温度培养所述细胞，且步骤(ii)包括在34.0℃±2.0℃的温度培养所述细胞。[88]项目84至87任一项所述的方法，所述方法还包括(i)使在项目84至87任一项中获得的多肽经历离子交换色谱，藉此具有高唾液酸化的多肽与具有低唾液酸化的多肽分离；和收集从离子交换柱洗脱的具有高唾液酸化的级分；或(ii)使在项目84至87任一项中获得的多肽与唾液酰基转移酶和唾液酸供体在体外接触。[89]项目84至88任一项所述的方法，其中平均所获得的多肽的n-聚糖的至少75％包含至少一个唾液酸部分。[90]项目84至89任一项所述的方法，其中平均所获得的多肽的至少50％作为二聚体存在。[91]一种多肽，所述多肽通过项目84至90任一项的方法可获得。[92]项目91中的多肽，用于在凝血障碍的治疗中使用，所述治疗包括向受试者施用有效量的所述多肽和有效量的fviii，其中所述多肽静脉内或皮下施用，且所述fviii静脉内施用。[93]根据项目91所述的用于使用的多肽，其中与用单独的fviii的治疗相比，所述fviii的平均滞留时间(mrt)通过所述多肽的共同施用延长；和/或其中与用单独的fviii治疗相比所述fviii的施用频率降低。附图简述图1：来自在中性ph的筛选的样品传感图。圈出了具有最强亲和力和最慢解离速率的两个候选。图2：示出了csl627对两种突变体d'd3-hsa候选物在ph7的详细动力学的样品传感图。a)因子viii结合具有突变：v1083a、s764g、s766y的d'd3-hsa；b)因子viii结合具有突变：s764g、s766y的d'd3-hsa；c)因子viii结合具有突变：v1083a、s764p、s766w的d'd3-hsa；d)因子viii结合d'd3-hsas764p、s766w。图3：示出了因子viii对两种突变体d'd3-hsa候选物在ph5.5的详细动力学的样品传感图。a)因子viii结合具有突变：v1083a、s764g、s766y的d'd3-hsa；b)因子viii结合具有突变：s764g、s766y的d'd3-hsa。c)因子viii结合具有突变：v1083a、s764p、s766w的d'd3-hsa；d)因子viii结合d'd3-hsas764p、s766w。图4：a)csl627在中性ph结合具有突变：v1083a、s764e、s766y的d'd3-hsa二聚体；b)csl627在中性ph结合野生型d'd3-hsa二聚体。图5：a)csl627结合具有突变：v1083a、s764e、s766y的d'd3-hsa二聚体；b)csl627在ph5.5结合野生型d'd3-hsa二聚体。详细说明遍及本说明书，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、或变化“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为暗示包含陈述的要素或整数或要素或整数的组，但不排除任何其他要素或整数或要素或整数的组。在本说明书中对任何之前的出版物(或来源于其的信息)或对任何已知的物质的引用不是并且不应当被视为确认或承认或以任何形式暗示该之前的出版物(或来源于其的信息)或已知的物质形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。在本说明书中提及的所有出版物通过引用以其整体并入本文。必须注意到，除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书中所用的单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包含复数方面。因此，例如，提及“一种剂(anagent)”包括一种剂以及两种或更多种剂；提及“一个分子(amolecule)”包括单个分子以及两个或更多个分子；等等。截短的vwf如本文使用的术语“vonwillebrand因子”或“vwf”是指具有野生型vwf的生物活性，特别是结合因子viii的能力的任何多肽。编码野生型vwf的基因被转录成9kbmrna，该9kbmrna被翻译成具有310,000da的估计分子量的2813个氨基酸的前-原多肽。前-原多肽包含22个氨基酸的信号肽、741个氨基酸的原-多肽和成熟亚基。741个氨基酸的原多肽从n-末端裂解产生由2050个氨基酸组成的成熟vwf。vwf前-原多肽的氨基酸序列示于seqidno：2中。除非另外指明，否则本申请中vwf残基中的氨基酸编号是指seqidno：2，尽管vwf分子不必包含seqidno：2的所有残基。成熟vwf的氨基酸序列示于seqidno：2中。除非另外指明，否则如本文使用的术语“vwf”是指vwf的成熟形式。野生型vwf的原多肽包含以以下顺序排列的多个结构域：d1-d2-d'-d3-a1-a2-a3-d4-b1-b2-b3-c1-c2-ck。d1和d2结构域代表原肽，其被裂解掉以产生成熟vwf。d’-d3结构域包括负责结合因子viii的氨基酸。野生型vwf的至少一部分d'-d3结构域的氨基酸序列示于seqidno：3中。羧基末端90个残基构成“ck”结构域，其与蛋白的“半胱氨酸结(cysteineknot)”超家族同源。这些家族成员具有经由二硫键二聚化的趋势。优选地，野生型vwf包含如seqidno：2中所示的成熟vwf的氨基酸序列。还涵盖了vwf的添加、插入、n-末端、c-末端或内部缺失，只要vwf的生物活性、特别是结合fviii的能力被保留。如果具有缺失的vwf保留野生型vwf的生物活性的至少10％、优选地至少25％、更优选地至少50％、最优选地至少75％，在本发明的意义上，生物活性被保留。野生型vwf的生物活性可由技术人员利用以下方法确定：瑞斯托菌素辅因子活性(federiciab等.2004.haematologica89:77-85)、vwf对血小板糖蛋白复合物ib-v-ix的gpibα的结合(sucker等.2006.clinapplthrombhemost.12:305-310)、或胶原结合测定(kallas&talpsep.2001.annalsofhematology80:466-471)。当vwf的生物活性是结合fviii的能力时，这可以多种方式测量，然而，优选如本文实施例1中描述的测量。因子viii术语“凝血因子viii”、“因子viii”和“fviii”在本文可互换地使用。“凝血因子viii”包括野生型凝血fviii以及具有野生型凝血fviii的促凝血活性的野生型凝血fviii的衍生物。与野生型fviii的氨基酸序列相比，衍生物可具有缺失、插入和/或添加。术语fviii包括fviii的蛋白水解加工形式，例如活化前的形式，其包括重链和轻链。包括血浆衍生的和包括b结构域缺失的fviii的重组fviii。商用产品的实例包括术语“fviii”包括具有野生型因子viii的生物活性的至少25％、更优选地至少50％、最优选地至少75％的任何fviii变体或突变体。作为非限制性实例，fviii分子包括预防或减少apc裂解的fviii突变体(amano1998.thromb.haemost.79:557-563)、进一步稳定a2结构域的fviii突变体(wo97/40145)、具有增加的表达的fviii突变体(swaroop等.1997.jbc272:24121-24124)、具有降低的免疫原性的fviii突变体(lollar1999.thromb.haemost.82:505-508)、从差异表达的重链和轻链重构的fviii(oh等.1999.exp.mol.med.31:95-100)、具有与导致fviii样hspg(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)和/或lrp(低密度脂蛋白受体相关蛋白)的分解代谢的受体的降低的结合的fviii突变体(ananyeva等.2001.tcm,11:251-257)、二硫键稳定的fviii变体(gale等,2006.j.thromb.hemost.4.1315-1322)、具有改进的分泌性质的fviii突变体(miao等,2004.blood103:3412-3419)、具有增加的辅因子特异性活性的fviii突变体(wakabayashi等,2005.biochemistry44:10298-304)、具有增加的生物合成和分泌、降低的er伴侣蛋白相互作用、改进的er-高尔基体转运、增加的活化或对失活的抗性和改进的半衰期的fviii突变体(由pipe2004.sem.thromb.hemost.30:227-237综述)。另一个特别优选的实例是重组形式的fviii，如在zollner等2013,thrombosisresearch,132:280-287中描述的。所有这些fviii突变体和变体通过引用整体并入本文。优选地，fviii包括seqidno：14中所示的fviii的全长序列。还涵盖了fviii的添加、插入、取代、n-末端、c-末端或内部缺失，只要fviii的生物活性被保留。如果具有修饰的fviii保留野生型fviii的生物活性的至少10％、优选地至少25％、更优选地至少50％、最优选地至少75％，在本发明的意义上，生物活性被保留。fviii的生物活性可由技术人员如下文描述的确定。确定fviii的生物活性的合适的测试是例如一阶段式或二阶段式凝血测定(rizza等1982.coagulationassayoffviii:candfixainbloomed.thehemophilias.nychurchchilllivingston1992)或发色底物fviii:c测定(s.rosen,1984.scandjhaematol33:139-145,suppl.)。这些参考文献的内容通过引用并入本文。成熟野生型形式的人类凝血fviii的氨基酸序列示于seqidno：14中。对特定序列的氨基酸位置的提及是指fviii野生型蛋白中所述氨基酸的位置，且不排除所提及的序列中存在其他位置处的突变,例如缺失、插入和/或取代。例如，提及seqidno：14的“glu2004”中的突变不排除在修饰的同系物中在seqidno：14的位置1至2332的一个或更多个氨基酸丢失。以上定义中的“fviii”和/或“vwf”还包括天然等位基因变异，其可在一个个体与另一个之间存在并出现。以上定义中的“fviii”和/或“vwf”还包括fviii和/或vwf的变体。此类变体的一个或更多个氨基酸残基不同于野生型序列。此类差异的实例可包括保守氨基酸取代，即具有相似特征的氨基酸组内的取代，例如(1)小的氨基酸、(2)酸性氨基酸、(3)极性氨基酸、(4)碱性氨基酸、(5)疏水氨基酸、和(6)芳香族氨基酸。此类保守取代的实例在表1中示出。表1(1)丙氨酸甘氨酸(2)天冬氨酸谷氨酸(3)天冬酰胺谷氨酰胺丝氨酸苏氨酸(4)精氨酸组氨酸赖氨酸(5)异亮氨酸亮氨酸甲硫氨酸缬氨酸(6)苯丙氨酸酪氨酸色氨酸特征“截短的”意指多肽不包含成熟vwf的完整氨基酸序列(seqidno：2的氨基酸764-2813)。通常，截短的vwf不包含seqidno：2的全部氨基酸764-2813，仅包含其片段。截短的vwf还可以被称为vwf片段，或呈复数的多于一个vwf片段(vwffragments)。通常，截短的vwf能够结合因子viii。优选地，截短的vwf能够结合成熟形式的人类天然因子fviii。在另一个实施方案中，截短的vwf能够结合由氨基酸序列seqidno：15组成的单链因子viii。本发明的截短的vwf优选地包含以下或由以下组成：(a)与seqidno：2的氨基酸764至1242具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的vwf仍能够结合fviii。更优选地，截短的vwf由以下组成：(a)与seqidno：2的氨基酸764至1242具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的vwf仍能够结合fviii。最优选地，截短的vwf由以下组成：(a)seqidno：2的氨基酸764至1242，或(b)其片段，条件是截短的vwf仍能够结合fviii。如下文更详细描述的，多肽可以通过使用包含编码包含截短的vwf的多肽的核酸的细胞的方法制备。核酸通过本领域技术人员周知的技术被引入到合适的宿主细胞中。在优选的实施方案中，宿主细胞中的核酸编码(a)与seqidno：2的氨基酸1至1242具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的成熟vwm仍能够结合fviii。更优选地，核酸编码(a)与seqidno：2的氨基酸1至1242具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列，或(b)其片段，条件是截短的vwf仍能够结合fviii。最优选的，核酸编码(a)seqidno：2的氨基酸1至1242，或(b)其片段，条件是截短的vwf仍能够结合fviii。特别是，如果根据本发明的多肽是二聚体，则核酸将包含编码vwf的氨基酸1至763的序列(例如seqidno：2)，即使多肽中截短的vwf不包含vwf的氨基酸1至763(例如seqidno：2)。在其他实施方案中，截短的vwf包含以下氨基酸序列之一或由其组成，每个氨基酸序列各自指seqidno：2：776-805；766-805；764-805,776-810；766-810；764-810；776-815；766-815；764-815；776-820；766-820；764-820；776-825；766-825；764-825；776-830；766-830；764-830；776-835；766-835；764-835；776-840；766-840；764-840；776-845,766-845,764-845；776-850；766-850；764-850；776-855；766-855；764-855；776-860；766-860；764-860；776-864；766-864；764-864；776-865；766-865,764-865；776-870；766-870；764-870；776-875；766-875；764-875；776-880；766-880；764-880；776-885；766-885；764-885；776-890；766-890；764-890；776-895；766-895；764-895；776-900；766-900；764-900,776-905,766-905；764-905；776-910；766-910；764-910；776-915；766-915；764-915；776-920；766-920；764-920；776-925；766-925；764-925；776-930；766-930；764-930；776-935；766-935；764-935；776-940；766-940；764-940；776-945；766-945；764-945；776-950,766-950,764-950；776-955；766-955；764-955；776-960；766-960；764-960；776-965；766-965；764-965；776-970；766-970；764-970；776-975,766-975,764-975；776-980；766-980；764-980；776-985；766-985；764-985,776-990；766-990；764-990；776-995；766-995；764-995；776-1000；766-1000；764-1000；776-1005；766-1005；764-1005；776-1010,766-1010；764-1010；776-1015,766-1015；764-1015；776-1020；766-1020；764-1020；776-1025；766-1025；764-1025；776-1030；766-1030；764-1030；776-1035,766-1035；764-1035；776-1040,766-1040；764-1040；776-1045；766-1045；764-1045；776-1050；766-1050；764-1050；776-1055；766-1055；764-1055；776-1060；766-1060；764-1060；776-1065；766-1065,764-1065；776-1070；766-1070,764-1070；776-1075；766-1075；764-1075；776-1080；766-1080；764-1080；776-1085；766-1085；764-1085；776-1090；766-1090,764-1090；776-1095；766-1095,764-1095；776-1100；766-1100；764-1100；776-1105；766-1105；764-1105；776-1110；766-1110；764-1110；776-1115；766-1115；764-1115；776-1120；766-1120；764-1120；776-1125；766-1125；764-1125；776-1130；766-1130；764-1130；776-1135；766-1135；764-1135,776-1140；766-1140；764-1140；776-1145,766-1145；764-1145；776-1150；766-1150；764-1150；776-1155；766-1155；764-1155；776-1160；766-1160；764-1160,776-1165；766-1165；764-1165；776-1170,766-1170；764-1170；776-1175；766-1175；764-1175；776-1180；766-1180；764-1180；776-1185；766-1185；764-1185；776-1190；766-1190；764-1190；776-1195,766-1195；764-1195；776-1200；766-1200,764-1200；776-1205；766-1205；764-1205；776-1210；766-1210；764-1210；776-1215；766-1215；764-1215；776-1220,766-1220；764-1220；776-1225；766-1225,764-1225；776-1230；766-1230；764-1230；776-1235；766-1235；764-1235；776-1240；766-1240；764-1240；776-1242,766-1242；764-1242；764-1247；764-1464,764-1250；764-1041；764-828；764-865；764-1045；764-1035；764-1128；764-1198,764-1268；764-1270；764-1261；764-1264；764-1459；764-1463；764-1464；764-1683；764-1873；764-1482；764-1479；764-1672；和764-1874。在某些实施方案中，截短的vwf相对于成熟的野生型vwf具有内部缺失。例如，al、a2、a3、d4、c1、c2、c3、c4、c5、c6结构域或其组合可以被缺失，而d’结构域、d3结构域和ck结构域被保留。在另外的实施方案中，截短的vwf不包含血小板糖蛋白ibα(gpibα)、胶原和/或整联蛋白αiibβiii的结合位点(c1结构域内的rgds序列)。在其他实施方案中，截短的vwf不包含位于vwf的中央a2结构域处的adamts13的裂解位点(tyr1605-met1606)。在又另一个实施方案中，截短的vwf不包含gpibα的结合位点，和/或不包含胶原的结合位点，和/或不包含整联蛋白αiibβiii的结合位点，和/或它不包含位于vwf的中央a2结构域处的adamts13的裂解位点(tyr1605-met1606)。在其他实施方案中，截短的vwf包含以下或由以下组成：与前述段落中提及的氨基酸序列中的一个具有至少90％、或至少91％、或至少92％、或至少93％、或至少94％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列，条件是截短的vwf能够结合fviii。在本发明中，如果本发明的多肽的两个单体共价连接，则本发明的多肽被称为“二聚体”。优选地，两个单体亚基经由至少一个二硫桥，例如由一个、两个、三个或四个二硫桥共价连接。形成至少一个二硫桥的半胱氨酸残基优选地位于本发明的多肽的截短的vwf部分内。在一个实施方案中，这些半胱氨酸残基是cys-1099、cys-1142、cys-1222、cys-1225或cys-1227或其组合。如果本发明的多肽是二聚体，截短的vwf优选地包含两个多肽或由其组成，所述两个多肽各自具有与seqidno：2的氨基酸764至1099、氨基酸764至1142、氨基酸764至1222、氨基酸764至1225、氨基酸764至1227、氨基酸764至1242、氨基酸764至1247、或氨基酸764至1270具有至少90％序列同一性并且能够结合fviii的氨基酸序列。在优选的实施方案中，截短的vwf包含以下或由以下组成：与seqidno：2的氨基酸764至1099、氨基酸764至1142、氨基酸764至1222、氨基酸764至1225、或氨基酸764至1227具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性并能够结合fviii的氨基酸序列。最优选地，截短的vwf包含以下或由以下组成：seqidno：2的氨基酸764至1099、氨基酸764至1142、氨基酸764至1222、氨基酸764至1225、氨基酸764至1227、氨基酸764至1242、氨基酸764至1247、或氨基酸764至1270。截短的vwf可以是wo2013/106787、wo2014/198699、wo2011/060242、wo2014/011819、wo2013/083858、wo2015/185758或wo2013/093760中公开的vwf片段中的任一个，其公开内容通过引用并入本文。半衰期延长部分除了截短的vwf，本发明的多肽还可以包含半衰期延长部分。半衰期延长部分可以是融合至截短的vwf的异源氨基酸序列。可选地，半衰期延长部分可以通过不同于肽键的共价键化学缀合至包含截短的vwf的多肽。在本发明的某些实施方案中，本发明的多肽的半衰期通过化学修饰，例如附接半衰期延长部分诸如聚乙二醇(peg化)、糖基化peg、羟乙基淀粉(hes化)、聚唾液酸、弹性蛋白样多肽、细菌肝素前体聚合物或透明质酸延长。在另一个实施方案中，本发明的多肽经由化学接头缀合至hlep诸如白蛋白。此缀合技术的原理已经以示例性方式由conjuchemllc描述(参见例如美国专利第7,256,253号)。半衰期增强多肽(hlep)优选地，半衰期延长部分是半衰期延长多肽(hlep)，更优选地，hlep选自白蛋白或其片段、免疫球蛋白恒定区及其部分例如fc片段、具有大流体动力学体积的溶剂化的随机链(例如xten(schellenberger等2009；naturebiotechnol.27:1186-1190)、同氨基酸重复(hap)或脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复(pas)、afamin、α-甲胎蛋白、维生素d结合蛋白、转铁蛋白或其变体、人绒毛膜促性腺素-β亚基的羧基末端肽(ctp)、在生理条件下能够结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽或脂质。如本文使用的“半衰期增强多肽”优选地选自由以下组成的组：白蛋白、白蛋白家族的成员、免疫球蛋白g的恒定区及其片段、在生理条件下能够结合白蛋白、结合白蛋白家族的成员以及结合免疫球蛋白恒定区的部分的区域和多肽。其可以是本文描述的全长半衰期增强蛋白(例如白蛋白、白蛋白家族的成员或免疫球蛋白g的恒定区段)或能够稳定或延长凝血因子的治疗活性或生物活性的其一种或更多种片段。此类片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或可以包括来自hlep序列的至少约15、至少约20、至少约25、至少约30、至少约50、至少约100、或更多个连续氨基酸，或者可以包括各自hlep的特定结构域的部分或全部，只要hlep片段提供与不具有hlep的各自的多肽相比至少25％的功能半衰期延长。本发明的多肽的hlep部分可以是野生型hlep的变体。术语“变体”包括插入、缺失和取代(保守或非保守的)，其中此类变化实质上不改变截短的vwf的fviii结合活性。特别地，本发明的提议的vwfhlep融合构建体可以包括hlep的天然存在的多态性变体和hlep的片段。help可以来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物例如人、猴、牛(cow)、绵羊或猪。非哺乳动物hlep包括但不限于母鸡(hen)和鲑鱼。在一个实施方案中，多肽具有以下结构：tvwf-li-h,[式1]其中tvwf是截短的vwf，l1是化学键或接头序列，且h是hlep。l1可以是化学键或由一个或更多个氨基酸例如1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)个氨基酸组成的接头序列，且所述氨基酸可彼此相同(equal)或不同。通常，接头序列在野生型vwf的相应位置不存在。存在于l1中的合适的氨基酸的实例包括gly和ser。接头应该是非免疫原性的并且可以为不可裂解的或可裂解的接头。不可裂解的接头可以包括交替的甘氨酸和丝氨酸残基，如在wo2007/090584中示例的。在本发明的另一实施方案中，截短的vwf部分与白蛋白部分之间的肽接头由用作人类蛋白中的天然结构域间接头的肽序列组成。优选地，此类肽序列在其天然环境中位于接近蛋白表面且对免疫系统可接近，使得人们可假定针对这一序列的天然耐受。实例在wo2007/090584中给出。可裂解的接头序列在例如wo2013/120939a1中描述。优选的hlep序列在以下描述。本发明同样涵盖与各自hlep的准确“n-末端氨基酸”或准确“c-末端氨基酸”的融合体、或与包括hlep的一个或更多个氨基酸的n-末端缺失的各自hlep的“n-末端部分”或“c-末端部分”的融合体。多肽可以包含多于一个hlep序列，例如两个或三个hlep序列。这些多个hlep序列可以与vwf的c-末端部分串联地(例如作为连续的重复段)融合。作为hlep的白蛋白术语“人血清白蛋白”(hsa)和“人白蛋白”(ha)和“白蛋白”(alb)在本申请中可互换地使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更宽泛，并且涵盖人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。如本文使用的，“白蛋白”总体地指白蛋白多肽或氨基酸序列或具有白蛋白的一种或更多种功能活性(例如生物活性)的白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段，尤其是如本文seqidno：16中所示的成熟形式的人白蛋白，或来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子或其片段的类似物或变体。特别地，本发明的提议的多肽可以包括人白蛋白的天然存在的和非天然存在的多态性变体和人白蛋白的片段。一般来说，白蛋白片段或变体将至少10个、优选地至少40个、最优选地多于70个氨基酸长。本发明的优选实施方案包括用作具有对fcrn受体增强的结合的本发明的多肽的hlep的白蛋白变体。与具有野生型白蛋白的截短的vwf融合体相比，此类白蛋白变体可以导致截短的vwf白蛋白变体融合蛋白的更长的血浆半衰期。变体包括wo2014072481、wo2012150319、wo2013135896、wo2011124718、wo2011051489和wo2012059486中描述的那些，其公开内容通过交叉引用并入。本发明的多肽的白蛋白部分可以包括ha的至少一个子结构域或结构域或其保守修饰。作为hlep的免疫球蛋白本领域中已知免疫球蛋白g(igg)恒定区(fc)延长治疗性蛋白的半衰期(dumontja等2006.biodrugs20:151-160)。重链的igg恒定区由3个结构域(ch1-ch3)和铰链区组成。免疫球蛋白序列可以来源于任何哺乳动物，或分别来自亚类igg1、igg2、igg3或igg4。无抗原结合结构域的igg和igg片段也可被用作hlep。治疗性多肽部分优选地经由抗体的铰链区或肽接头(其甚至可以是可裂解的)连接于igg或igg片段。数种专利和专利申请描述治疗性蛋白与免疫球蛋白恒定区的融合以增强治疗性蛋白的体内半衰期。us2004/0087778和wo2005/001025描述fc结构域或免疫球蛋白恒定区的至少部分与生物活性肽的融合蛋白，其增加该肽的半衰期，否则该肽将在体内快速被消除。描述了fc-ifn-β融合蛋白，其实现了增强的生物活性、延长的循环半衰期和更大的溶解度(wo2006/000448)。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内效力的fc-epo蛋白(wo2005/063808)以及与g-csf(wo2003/076567)、胰高血糖素-样肽-1(wo2005/000892)、凝固因子(clottingfactor)(wo2004/101740)和白介素-10(美国专利第6,403,077号)的fc融合物，它们都具有半衰期增强特性。可以根据本发明使用的各种hlep在wo2013/120939a1中详细地描述，其公开内容通过交叉引用并入本文。接头序列根据本发明，治疗性多肽部分可通过肽接头偶联到hlep部分。接头应该是非免疫原性的并可以是不可裂解的或可裂解的接头。不可裂解的接头可包括交替的甘氨酸和丝氨酸残基，如在wo2007/090584中示例的。在本发明的另一个实施方案中，vwf部分与白蛋白部分之间的肽接头由用作人蛋白中的天然结构域间接头的肽序列组成。优选地，此类肽序列在其天然环境中位于接近蛋白表面且对免疫系统可接近，使得人们可假定针对这一序列的天然耐受。实例在wo2007/090584中给出。可裂解的接头应足够柔性以允许被蛋白酶裂解。在优选的实施方案中，如果融合蛋白是修饰的fviii，接头的裂解与融合蛋白内的fviii的活化同等快地进行。优选地，可裂解的接头包括源自以下的序列(a)待施用的治疗性多肽本身，如果其包含在治疗性多肽的活化期间被蛋白水解裂解的蛋白水解裂解位点，(b)被蛋白酶裂解的底物多肽，所述蛋白酶通过治疗性多肽的参与被活化或形成，或(c)参与凝血或纤维蛋白溶解的多肽。在更优选的实施方案中，接头区域包括vwf的序列，其应导致表达的融合蛋白的新抗原(neoantigenic)性质的风险降低。优选地，接头肽可由凝血系统的蛋白酶例如fiia、fixa、fxa、fxia、fxiia和fviia裂解。治疗性多肽、可裂解的接头和hlep的示例性组合包括wo2007/090584(例如在表2和图4中)和wo2007/144173(例如在表3a和3b)中所列的构建体，但不限于这些。在另一个实施方案中，相比于野生型vwf的功能半衰期或与野生型vwf或与如以上定义的参考多肽复合的fviii的功能半衰期，本发明的多肽或与本发明的多肽复合的fviii的功能半衰期延长。该延长可以是多于15％，例如至少20％或至少50％。再次地，此类功能半衰期值可在血液样品中体外测量，所述血液样品在施用修饰的vwf或fviii与修饰的vwf的复合物后在不同时间间隔从所述哺乳动物获取。在另一个实施方案中，相比于野生型vwf或与野生型vwf或与如以上定义的参考多肽复合的fviii，本发明的多肽或与本发明的多肽复合的fviii表现出改进的体内回收。体内回收可以在体内确定，例如在正常动物中或在血友病a的动物模型如fviii敲除小鼠中，其中人们将预期与对应的野生型vwf或以上定义的参考多肽相比，在静脉内施用后短时间(5至10min.)在循环中通过抗原或活性测定发现fviii的百分比增加。与和野生型vwf复合的或与如以上定义的参考多肽复合的fviii相比，体内回收优选地增加至少10％，更优选地至少20％，和甚至更优选地至少40％。比率如下文更详细地描述的，本发明的多肽可以是单体、二聚体、或其混合物。根据本发明的任何摩尔比率指本发明的多肽的单体亚基的摩尔浓度的比率，无论实际上以单体还是二聚体存在。比率相对于共同施用的fviii的摩尔浓度或相对于内源性vwf亚基的摩尔浓度形成。本申请中，本发明的多肽相对于fviii的任何比率指待被施用的本发明的多肽的量(以摩尔计)除以待被施用的fviii的量(以摩尔计)，除非另外指明。内源性vwf是天然存在于待被给予本发明的多肽和共施用的fviii的动物或人类的血浆中的vwf。它通常由一系列大约2个至40个vwf单体亚基的不同寡聚体组成。除非另外指明，在本申请中，本发明的多肽相对于内源性vwf的任何比率指紧接着施用本发明的多肽后，本发明的多肽的摩尔血浆浓度/所治疗受试者的kg体重除以内源性vwf的摩尔血浆浓度/所治疗的受试者的kg体重。紧接着施用本发明的多肽后，本发明的多肽的摩尔血浆浓度/所治疗受试者的kg体重是假设施用后直接施用的本发明的多肽在40ml/kg的血浆体积中稀释而计算的。为了本发明的目的，假定本发明的多肽在静脉内施用时紧接着施用后的量与施用的量相同。当本发明的多肽可以以任何水平施用时，通过以本发明的多肽与内源性vwf的摩尔比率大于0.5的水平施用可以实现优势。待被治疗的受试者的血浆中的内源性vwf的浓度可以通过elisa或活性测定确定，例如如实施例中描述的。通常，测量的浓度将以u/ml给出。该值可以如下文中描述的转化成摩尔浓度。正常人血浆(nhp)以1u/ml或定义的100％的浓度包含vwf。这对应于大约10μg/ml的蛋白浓度(haberichters.l.和montgomeryr.r.,structureandfunctionofvonwillebrandfactor；in:hemostasisandthrombosis,eds.marder,aird,bennett,schuiman和white,lippincottwilliams&wilkins2013,pp197-207)。基于nhp中的该vwf浓度和包括18-19％糖基化的大约267.500da的成熟vwf单体的分子量，可以计算nhp中约37×10-9mol/l的vwf单体单位的摩尔血浆浓度。为了计算正常大鼠或兔血浆中大鼠或兔vwf亚基的摩尔浓度，分别使用与人vwf相当的单体亚基的分子量(267,500da)以及假定的相当的比活性(100u/mg)和大鼠或兔血浆中的测量的内源性vwf活性(也参见实施例)。人类群体中vwf的浓度从nhp中约60％至约200％的vwf浓度变化。在本发明的某些实施方案中，内源性vwf的浓度定义为nhp中的浓度。在其他实施方案中，内源性vwf的浓度在待被治疗的受试者中确定，并且多肽的剂量基于该个体值。施用的本发明的多肽与内源性vwf的摩尔比率优选地为至少2、或至少3、或至少4、或至少5、或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10，更优选地至少15、或至少20、或至少25、或至少30，最优选地至少40、或至少50、或至少75。待被施用的本发明的多肽与内源性vwf的摩尔比率的范围可以从0.5至1,000、或从1至500、或从2至400、或从3至300、或从4至250、或从5至200、或从6至150、或从7至140、或从8至130、或从9至120、或从10至110。优选地，施用的本发明的多肽与内源性vwf的摩尔比率的范围从3至100、或从4至90、或从5至80、或从6至75、或从10至60。待被施用的本发明的多肽与待被施用的fviii的摩尔比率优选地为至少2、或至少5、或至少10、或至少20、或至少30、或至少40、或至少50，更优选地该比率大于50、或至少75、至少100、或大于100、或至少200，最优选地至少300、或至少400、或至少500。待被施用的本发明的多肽与待被施用的fviii的摩尔比率的范围可以从2至10,000、或从5至5,000、或从10至4,000、或从20至3,000、或从30至2,000、或从40至1,000。优选地，待被施用的本发明的多肽与待被施用的fviii的摩尔比率的范围从60至2,500、或从110至2,000、或从150至1,500、或从200至1,000。表1总结了根据本发明的治疗的各种实施方案。在给定实施方案中，必须分别满足第2栏和第3栏的要求。表1表1中示出的实施方案1至72可以与本文描述的本发明的任何其他实施方案和方面组合。根据本发明的治疗的进一步的细节在下文进一步描述。本发明的多肽的n-聚糖和唾液酸化本发明的多肽优选包含n-聚糖，且平均所述n-聚糖的至少75％、优选至少85％、更优选至少90％包含至少一个唾液酸部分。在优选的实施方案中，平均所述n-聚糖的至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％包含至少一个唾液酸部分。发明人发现包含高度唾液酸化的vwf片段的多肽不仅本身具有延长的半衰期，而且还能够延长共同施用的fviii的半衰期。换句话说，施用本发明的多肽导致延长的半衰期和/或共同施用的fviii的降低的清除率。本发明的多肽优选包含n-聚糖，并且糖蛋白的n-聚糖的唾液酰基基团的至少50％是α-2,6-连接的唾液酰基团。通常，末端唾液酰基基团可以经由α-2,3-连接或经由α-2,6-连接附接至半乳糖基团。通常，本发明多肽的n-聚糖包含比α-2,3-连接的唾液酰基基团更多的α-2,6-连接的唾液酰基基团。优选地，n-聚糖的唾液酰基团的至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％是α-2,6-连接的唾液酰基基团。这些实施方案可以通过例如在哺乳动物细胞中共表达人α-2,6-唾液酰基转移酶来获得。在一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖的至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％包含至少一个唾液酸基团。在另一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖的至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％包含至少一个唾液酸基基团。在另一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖中小于15％、小于12％、小于10％、或小于8％、或小于6％、或小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％或甚至小于1％是无唾液酸-n-聚糖，即它们是缺少唾液酸基团的n-聚糖。在另一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖中小于15％、小于12％、小于10％、或小于8％、或小于6％、或小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％或甚至小于1％是无唾液酸-n-聚糖，即它们不具有唾液酸基团。以上描述的实施方案可以彼此组合。上文提及的n-聚糖的任何百分比或唾液酸化程度的任何指示应理解为平均百分比或程度，即它们指的是分子群体而非单个分子。显然，糖蛋白群体内的单个糖蛋白分子的糖基化或唾液酸化将显示出一些异质性。二聚体进一步发现本发明的多肽可以具有高比例的二聚体。因此，本发明的多肽优选作为二聚体存在。在一个实施方案中，至少50％、或至少60％、或至少70％的多肽作为二聚体存在。在另一个实施方案中，本发明多肽的二聚体:单体的比率为至少1.5、优选地至少2、更优选地至少2.5或至少3。最优选地，本发明的所有多肽以二聚体存在。二聚体的使用是有利的，因为与单体相比，二聚体对因子viii具有改善的亲和力。在一个实施方案中，本发明多肽对因子viii的亲和力大于人天然vwf对相同因子viii分子的亲和力。因子viii亲和力可以指人天然因子viii，或指特征为seqidno：15的因子viii分子。已经发现具有高比例的二聚体的本发明多肽的制备物对因子viii具有增加的亲和力。对因子viii的这种增加的亲和力确实导致根据本发明多肽增强因子viii的稳定性。作为对增加的二聚体比例的替代或与增加的二聚体比例组合，在因子viii结合结构域内具有确实增加对因子viii的亲和力的突变的根据本发明的多肽也是本发明的优选实施方案。合适的突变在例如wo2013/120939a1中公开。多肽的制备编码本发明多肽的核酸可根据本领域已知的方法制备。基于vwf(seqidno：3)的cdna序列，可以设计并生成编码上文提及的本发明的截短的vwf构建体或多肽的重组dna。即使由宿主细胞分泌的多肽不包含vwf的氨基酸1至763，优选的是编码多肽的细胞内前体的核酸(例如dna)包含编码与seqidno：2的氨基酸23至763或优选与氨基酸1至763具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。最优选地，编码多肽的细胞内前体的核酸(例如dna)包含编码seqidno：2的氨基酸23至763或seqidno：2的氨基酸1至763的核苷酸序列。其中dna含有以正确方向插入到表达质粒中的完整开放阅读框的构建体可用于蛋白表达。典型的表达载体含有启动子，其指导对应于携带质粒的细胞中插入的核酸的大量mrna的合成。它们还可以包括允许它们在宿主生物体内自主复制的复制起点序列，以及增加翻译合成的mrna的效率的序列。通过使用例如病毒的调控元件(例如来自epsteinbarr病毒基因组的orip序列)，可以将稳定的长期载体维持为自由复制的实体。也可以产生将载体整合到基因组dna中的细胞系，并且以这种方式连续产生基因产物。通常，待被提供的细胞通过将编码本发明的多肽的核酸引入哺乳动物宿主细胞而获得。易于细胞培养和表达糖蛋白的任何宿主细胞可以根据本发明使用。在某些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括balb/c小鼠骨髓瘤系(nso/1,ecaccno:85110503)；人成视网膜细胞(per.c6(crucell,leiden,thenetherlands))；由sv40转化的猴肾cvl系(cos-7,atcccrl1651)；人胚胎肾系(293或用于在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞,graham等,j.genvirol.,36:59,1977)；乳仓鼠肾细胞(bhk,atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-dhfr(cho,urlaub和chasin,proc.natl.acad.sci.usa,77:4216,1980)；小鼠sertoli细胞(tm4,mather,biol.reprod.,23:243251,1980)；猴肾细胞(cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(vero-76,atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(hela,atccccl2)；犬肾细胞(mdck,atccccl34)；布法罗大鼠肝细胞(brl3a,atcccrl1442)；人肺细胞(w138,atccccl75)；人肝细胞(hepg2,hb8065)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562,atccccl51)；tri细胞(mather等,annalsny.acad.sci.,383:44-68,1982)；mrc5细胞；ps4细胞；人羊水细胞(cap)；和人肝癌系(hepg2)。优选地，细胞系是啮齿动物细胞系，特别是仓鼠细胞系诸如cho或bhk。适于将足以实现感兴趣的糖蛋白的表达的核酸引入哺乳动物宿主细胞中的方法是本领域已知的。参见例如gething等,nature,293:620-625,1981；mantel等,nature,281:40-46,1979；levinson等.ep117,060；和ep117,058。对于哺乳动物细胞，将遗传物质引入哺乳动物细胞的一般方法包括graham和vandererb的磷酸钙沉淀法(virology,52:456-457,1978)或hawley-nelsonor的脂质转染胺法tm(gibcobrl)(focus15:73,1993)。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面已经由axel在美国专利第4,399,216号中描述。对于将遗传物质引入哺乳动物细胞的各种技术，参见keown等,methodsinenzymology,1989、keown等,methodsinenzymology,185:527-537,1990和mansour等,nature,336:348-352,1988。细胞在允许表达多肽的条件下培养。多肽可以使用本领域技术人员已知的方法回收和纯化。终末半衰期、mrt和清除率本发明的另一方面是如上文所定义的多肽用于增加终末半衰期或平均滞留时间(mrt)或降低因子viii的清除率的用途。为了评估药代动力学数据，应用线性药代动力学模型(化合物经由中央室消除)。因此，除非另外指明，本文使用的任何药代动力学参数均基于线性药代动力学模型(化合物经由中央室消除)。在特定时间t的“半衰期”t1/2(t)是将在时间t存在的血浆浓度c(t)减半所花费的时间，即c[t+t1/2(t)]＝c(t)/2。“终末半衰期”是当t趋于无穷时t1/2(t)的极限。相对于单独施用fviii，如果共同施用有效量的本发明的多肽，施用的fviii的终末半衰期延长至少25％、优选至少50％、更优选至少75％、更优选至少100％、最优选至少150％。本发明的另一方面是如上文所定义的多肽用于延长因子viii的终末半衰期的用途。如本文所用的术语“mrt”意指药物分子(例如本发明的多肽或fviii)驻留在体内的平均时间。在具有恒定清除率的线性药代动力学系统中，mrt可以计算为第一时间曲线下面积(aumc)除以血浆浓度-时间曲线下面积(auc)。第一时间曲线是时间乘以该时间的血浆浓度。相对于单独施用fviii，如果共同施用有效量的本发明的多肽，施用的fviii的mrt延长至少25％、优选至少50％、更优选至少75％、更优选至少100％、最优选至少150％。本发明的另一方面是如上文所定义的多肽用于延长因子viii的终末半衰期或平均滞留时间(mrt)或降低因子viii的清除率的用途。如本文所用的术语“清除率”是指血浆清除药物的速率。具体而言，它是当前的药物消除速率除以其当前的血浆浓度。在单次静脉内施用后的线性药代动力学系统中，如果清除率恒定，则清除率可以计算为剂量与血浆浓度-时间曲线下面积(auc)的比率。清除率越低，血浆清除药物所需的时间越长。相对于单独施用fviii，如果共同施用有效量的本发明的多肽，施用的fviii的清除率降低至少10％、优选至少25％、更优选至少50％、更优选至少60％、最优选至少70％。本发明还涉及延长mrt或半衰期的方法，或涉及降低体内因子viii的清除率的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如上文所定义的多肽。本发明的另一方面是治疗凝血障碍的方法，所述方法包括向有相应需要的患者施用有效量的如上文所定义的多肽。另一方面是如上文所定义的多肽用于在血友病a的治疗中降低fviii的施用频率的用途。静脉内或皮下施用fviii的频率可以降低至每周两次。可选择地，静脉内或皮下施用fviii的频率可以降低至每周一次，或甚至更低例如降低至到每10天一次或每14天一次。fviii可以每周两次、每5天一次、每周一次、每10天一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次、或者在任何两个前述值之间的任何范围内施用，例如从每四天至每月、从每十天至每两周、或每周两次至三次等。另一方面是如上文所定义的多肽用于在血友病a的治疗中降低待被施用的fviii的剂量的用途。凝血障碍的治疗本发明的多肽可用于治疗包括血友病a的凝血障碍。术语“血友病a”是指功能性凝血fviii的缺陷，通常是遗传的。疾病的治疗涵盖治疗已经被诊断为具有任何临床阶段或表现的任何形式的疾病的患者；延迟疾病的症状或指征的发作或进展或加重或恶化；和/或预防和/或降低疾病的严重程度。向其施用本发明的多肽的“受试者”或“患者”优选是人。在某些方面，人是儿科患者。在其他方面，人是成人患者。本文描述了包含本发明的多肽和任选的fviii的组合物。该组合物通常作为包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的一部分提供。该组合物可以是任何合适的形式(取决于将其施用至患者的期望的方法)。术语“因子viii”和“fviii”在本文中可互换使用并且涵盖血浆衍生的fviii和重组fviii。重组fviii涵盖但不限于全长fviii以及双链b结构域缺失或截短的变体以及单链b结构域缺失或截短的变体，例如wo2004/067566中描述的那些和具有在b结构域之外的突变但具有fviii的生物学活性的其他fviii变体。本发明的多肽可通过多种途径例如口服、透皮、皮下、经鼻、静脉内、腹膜内、肌肉内、局部(topically)或局部(locally)施用至患者。在任何给定情况下，最合适的施用途径取决于具体的多肽、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况。通常，本发明的多肽将通过静脉内施用。优选地，多肽和fviii经静脉内或皮下施用。在第一个实施方案中，多肽和fviii都经静脉内施用。在第二个实施方案中，多肽和fviii都经皮下施用。在另一个实施方案中，fviii经静脉内施用，并且多肽经不同的途径施用。在另外的实施方案中，多肽经皮下施用，并且fviii经不同途径施用。例如，多肽可以经皮下施用，且fviii可以经静脉内施用。在另外的实施方案中，fviii经皮下施用，并且多肽经不同的途径施用。在另外的实施方案中，多肽经静脉内施用，并且fviii经不同的途径施用。例如，多肽可以经静脉内施用，且fviii可以经皮下施用。本发明的多肽的剂量总数和用多肽治疗的时长的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。待被施用的本发明的多肽的剂量取决于待被施用的fviii的浓度、待被治疗的患者中内源性vwf的浓度或两者。考虑到本发明的多肽的分子量，本领域技术人员可以基于本申请的发明人限定的比率确定有效剂量。fviii的一般剂量的范围可以从约20u/kg体重至约100u/kg体重。根据本发明，用本发明的多肽治疗的患者也用凝血因子viii治疗。本发明的多肽和因子viii可以同时或以连续方式施用，这两种施用模式都包括在术语“组合疗法”和“共同施用”中。本发明的多肽和因子viii可以作为混合物即在相同的组合物中施用，或者分别地即作为单独的组合物施用。所使用的组合物中因子viii的浓度通常在10-10,000iu/ml的范围内。在不同的实施方案中，本发明的组合物中fviii的浓度在10-8,000iu/ml、或10-5,000iu/ml、或20-3,000iu/ml或50-1,500iu/ml的范围内、或3,000iu/ml、或2,500iu/ml、或2,000iu/ml、或1,500iu/ml、或1,200iu/ml、或1,000iu/ml、或800iu/ml、或750iu/ml、或600iu/ml、或500iu/ml、或400iu/ml、或300iu/ml、或250iu/ml、或200iu/ml、或150iu/ml、或125iu/ml、或100iu/ml或62.5iu/ml、或50iu/ml，条件是满足关于如本文定义的本发明的vwf多肽的比率的要求。“国际单位”或“iu”是fviii的凝血活性(效力)的测量单位，如使用针对以“iu”标定的国际标准制剂进行校准的标准品通过fviii活性测定诸如一阶段式凝血测定或显色底物fviii活性测定测量的。一阶段式凝血测定是本领域已知的，例如nlee，martinl等，aneffectofpredilutiononpotencyassaysoffviiiconcentrates,thrombosisresearch(pergamonpressltd.)30,511519(1983))。一阶段式测定的原理：测试作为活化的部分促凝血酶原激酶时间(aptt)测定的修改版本执行：用磷脂和表面活化剂孵育血浆导致内在凝固系统的因子的活化。钙离子的添加触发凝血级联。确定形成可测量的纤维蛋白凝块的时间。该测定在因子viii缺陷的血浆的存在下进行。缺陷的血浆的凝血能力通过在待测样品中包含的凝血因子viii而恢复。凝血时间的缩短与存在于样品中的因子viii的量成正比。凝血因子viii的活性通过直接与具有以国际单位计已知活性得因子viii的标准制剂进行比较来量化。另一种标准测定是显色底物测定。显色底物测定可以商购，诸如coamaticfviii测试试剂盒(chromogenix-instrumentationlaboratoryspav.lemonza338-20128milano,italy)。显色测定的原理：在钙和磷脂的存在下，因子x被因子ixa活化为因子xa。该反应由因子viiia作为辅因子刺激。fviiia由来自待测样品中fviii的反应混合物中的低量凝血酶形成。当使用ca2+、磷脂和因子ixa的最佳浓度和过量的因子x时，因子x的活化与因子viii的效力成正比。活化的因子x从发色底物s-2765释放生色团pna。因此，在405nm处测量的pna的释放与所形成的fxa的量成正比，因此也与样品的因子viii活性成比例。药物组合物通过将具有所需纯度的多肽与本领域中通常使用的任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(所有这些在此称为“载体”)(即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型洗涤剂、抗氧化剂和其他各种添加剂)混合可以制备适用于本文所述方法的用于作为冻干制剂或水溶液储存的本发明的多肽的治疗性制剂。参见remington'spharmaceuticalsciences,第16版(osol,ed.1980)。此类添加剂在使用的剂量和浓度必须是对接受者是无毒的。缓冲剂帮助维持ph在接近生理条件的范围内。它们可以以从约2mm至约50mm的范围的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸二者以及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲剂(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲剂(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲剂(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲剂(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲剂(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲剂(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲剂(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲剂(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲基铵盐诸如tris。可以添加防腐剂以阻碍微生物生长，并且可以以从0.2％-1％(w/v)范围的量被添加。合适的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵和苯扎碘铵)、六甲氯铵和对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。等渗剂(isotonicifier)，有时也被称为“稳定剂”，可以被添加以确保液体组合物的等渗性并且包括多元糖醇，优选地三元或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。稳定剂是指广泛类别的赋形剂，其功能范围可以从膨胀剂(bulkingagent)到溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附到容器壁的添加剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(上文列举的)；氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、l-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinositol)、半乳糖醇、甘油等，包括环醇如肌醇(inositol)；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-一硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如10个或更少残基的肽)；蛋白诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮单糖诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖诸如棉子糖；和多糖诸如右旋糖酐。稳定剂可以以每重量份活性蛋白的从0.1至10,000重量的范围存在。可以加入非离子型表面活性剂或去垢剂(也称为“润湿剂”)以帮助溶解治疗剂以及保护治疗性蛋白免于搅动诱导的聚集，这也允许制剂暴露于剪切表面应力而不引起蛋白的变性。合适的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊洛沙姆(184、188等)、pluronic多元醇、聚氧乙烯山梨聚糖单醚(-20、-80等)。非离子型表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml的范围或以约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。另外的各种赋形剂包括膨胀剂(例如淀粉)、螯合剂(例如edta)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素e)和共溶剂。除了本发明的多肽之外，本文的制剂还可以含有第二治疗剂。合适的第二治疗剂的实例在下文提供。根据许多临床因素，包括疾病的类型、疾病的严重程度以及患者对本发明的多肽的敏感性，给药时间表可以从每月一次到每天变化。在具体实施方案中，本发明的多肽可以每周两次、每5天一次、每周一次、每10天一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次或每月一次、或者在任何两个前述值之间的任何范围内施用，例如从每四周至每月、从每十天至每两周、或每周两次至三次等。待被施用的本发明多肽的剂量将根据特定多肽、受试者、疾病的性质和严重程度、受试者的身体状况、治疗方案(例如是否使用第二治疗剂)和选择的施用途径而变化；本领域技术人员可以容易地确定适当的剂量。本领域技术人员将认识到，本发明多肽的单个剂量的最佳量和间隔将由所治疗状况的性质和程度、施用的形式、途径和部位、以及所治疗的特定受试者的年龄和状况决定，并且医师将最终确定待使用的适当剂量。该剂量可以适当地经常重复。如果出现副作用，剂量的量和/或频率可以按照正常的临床实践改变或减少。根据本发明的一个方面，本发明的多肽对fviii的结合亲和力比参考多肽高，所述参考多肽除了seqidno：3中的修饰以外，具有相同的氨基酸序列。vwf分子对因子viii分子的结合亲和力可由本领域中使用的结合测定确定。例如，可将vwf分子固定在固体支持物上，施加递增浓度的因子viii，孵育某一时间段，并在洗涤后用发色测定确定结合的viii。然后可通过scatchard分析或另一合适的方法确定亲和力常数或解离常数。确定人类因子viii对vonwillebrand因子的结合亲和力的方法在vlot等(1995),blood,volume85,number1,3150-3157中描述。本文对亲和力的任何提及，包括解离常数，优选地是指本发明的修饰的vwf或本发明的多肽对fviii的结合。fviii的单链的氨基酸序列示于seqidno：15中。由于vwf与fviii的相互作用通常具有高的结合速率(on-rate)，解离常数的变化很大地依赖于解离速率(off-rate)的变化。因此，增加vwf与fviii的缔合的主要焦点包括降低fviii与vwf之间的解离速率。优选地，与野生型vwf与fviii的解离速率相比，修饰的vwf与fviii的解离速率低至少二倍、更优选地低至少5倍、优选地低至少10倍和更优选地低至少20倍。由vwf和fviii组成的复合物的解离常数优选地是0.2nmol/l或更少，更优选地0.175nmol/l或更少，更优选地0.15nmol/l或更少，更优选地0.125nmol/l或更少，更优选地0.1nmol/l或更少，更优选地0.05nmol/l或更少，最优选地0.01nmol/l或更少。本发明多肽与seqidno：15的因子viii的复合物的解离常数kd通常比参考多肽(例如seqidno：4的多肽)与seqidno：15的因子viii的复合物的解离常数kd小的90％。本发明的多肽与seqidno：14的因子viii的复合物的解离常数kd优选地小于参考多肽(例如seqidno：3的多肽)与seqidno：15的因子viii的复合物的解离常数kd的75％、更优选地小于50％、更优选地小于25％、更优选地小于10％、更优选地小于5％。参考多肽是这样的多肽：除了vwf的d'-d3结构域内的突变以外，其氨基酸序列与本发明的多肽的相同。即，参考多肽优选地具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，条件是，参考多肽中的d'-d3结构域由如seqidno：3中所示的氨基酸序列组成。换言之，本发明的多肽与参考多肽之间仅有的序列差异在于d'-d3结构域的氨基酸序列。优选地，参考多肽在与本发明的多肽相同的条件下制备。多核苷酸本发明还涉及编码如本申请中描述的修饰的vwf或包含所述修饰的vwf的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”一般是指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的rna或dna或修饰的rna或dna。多核苷酸可以是单链或双链dna、单链或双链rna。如本文使用的术语“多核苷酸”还包括包含一个或更多个修饰的碱基和/或不常见碱基诸如肌苷的dna或rna。应理解的是，可对dna和rna进行用于本领域技术人员已知的许多有用目的的多种修饰。如本文采用的术语“多核苷酸”包含多核苷酸的此类化学、酶促或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(包括例如简单细胞和复杂细胞)特有的dna和rna的化学形式。本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，给定的多肽可由不同的多核苷酸编码。这些“变体”被本发明涵盖。优选地，本发明的多核苷酸是分离的多核苷酸。术语“分离的”多核苷酸是指大致上不含其他核酸序列(诸如但不限于其他染色体和染色体外dna和rna)的多核苷酸。分离的多核苷酸可从宿主细胞纯化。本领域技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语还包括重组的多核苷酸和化学合成的多核苷酸。本发明还涉及一组多核苷酸，其一起编码本发明的修饰的vwf、或包含修饰的vwf的本发明的多肽。组中的第一多核苷酸可以编码修饰的vwf的n-末端部分，且第二多核苷酸可以编码修饰的vwf的c-末端部分。本发明的又另一方面是包含根据本发明的多核苷酸的质粒或载体。优选地，该质粒或载体是表达载体。在特定实施方案中，该载体是用于人类基因疗法中的转移载体。本发明还涉及一组质粒或载体，其包含以上组的多核苷酸。第一质粒或载体可以含有所述第一多核苷酸，且第二质粒或载体可以含有所述第二多核苷酸。可选地，将两种编码序列克隆到一个表达载体中，利用两种单独的启动子序列或一种启动子和内部核糖体进入位点(ires)元件，所述内部核糖体进入位点(ires)元件可用于例如指导表达弗林蛋白酶以增强成熟vwf的生成。本发明的又另一方面是包含本发明的多核苷酸、质粒或载体、或如本文描述的一组多核苷酸或一组质粒或载体的宿主细胞。本发明的宿主细胞可被用在产生修饰的vwf或包含所述修饰的vwf的多肽的方法中，所述方法是本发明的一部分。该方法包括：(a)在使得期望的修饰的蛋白被表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和(b)任选地从该宿主细胞或从培养基回收期望的修饰的蛋白。优选地，纯化本发明的修饰的vwf或包含该修饰的vwf的多肽至≥80％纯度、更优选地≥95％纯度，且特别优选的是药学纯的状态，其对于污染性大分子尤其是其他蛋白和核酸是大于99.9％纯的，且不含传染剂和致热剂。优选地，本发明的分离的或纯化的修饰的vwf或本发明的多肽大致上不含其他、无关的多肽。本发明的各种产物可用作药物。因此，本发明涉及包含修饰的vwf或如本文描述的包含所述修饰的vwf的多肽、本发明的多核苷酸、或本发明的质粒或载体的药物组合物。本发明还涉及治疗患有凝血障碍诸如血友病a或b或vwd的个体的方法。该方法包括向所述个体施用有效量的：(i)fviii和修饰的vwf或包含修饰的vwf的多肽或(ii)fviii与修饰的vwf的复合物或(iii)fviii与如本文所述地包含修饰的vwf的多肽的复合物。在另一个实施方案中，该方法包括向所述个体施用有效量的本发明的多核苷酸或本发明的质粒或载体。可选地，该方法可包括向所述个体施用有效量的本文描述的发明的宿主细胞。修饰的多肽的表达重组的突变体蛋白以高水平在合适的宿主细胞中的产生要求将上述的修饰的多核苷酸，特别是cdna与合适的调节元件一起组装为重组表达载体中的有效的转录单元，该重组表达载体可根据本领域技术人员已知的方法在各种表达系统中繁殖。有效的转录调节元件可来源于以动物细胞作为其天然宿主的病毒或来源于动物细胞的染色体dna。优选地，可使用来源于猿猴病毒40、腺病毒、bk多瘤病毒、人类巨细胞病毒、或rous肉瘤病毒的长末端重复的启动子-增强子组合、或包括动物细胞中强组成型转录基因如β-肌动蛋白或grp78的启动子-增强子组合。为了实现从cdna转录的mrna的稳定高水平，转录单元应在其3’-近端部分包含编码转录终止-多腺苷酸化序列的dna区域。优选地，该序列来源于猿猴病毒40早期转录区域、兔β-珠蛋白基因、或人类组织纤溶酶原激活物基因。然后将cdna整合到合适的宿主细胞系的基因组中用于修饰的fviii和/或vwf蛋白的表达。优选地，该细胞系应是脊椎动物来源的动物细胞系，以确保正确折叠、二硫键形成、天冬酰胺-连接的糖基化和其他翻译后修饰以及分泌进入培养基。其他翻译后修饰的实例是酪氨酸o-硫酸化和新生多肽链的蛋白水解加工。可以使用的细胞系的实例是猴cos-细胞、小鼠l-细胞、小鼠c127-细胞、仓鼠bhk-21细胞、人胚胎肾293细胞和仓鼠cho-细胞。编码相应的cdna的重组表达载体可以数种不同方式被引入到动物细胞系中。例如，重组表达载体可从基于不同动物病毒的载体产生。这些的实例是基于杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、和优选地牛乳头状瘤病毒的载体。编码相应的dna的转录单元也可与另一重组基因一起被引入动物细胞，所述另一重组基因可在这些细胞中作为显性选择标志起作用，以帮助分离在其基因组中已整合了重组dna的特定细胞克隆。这一类型的显性选择标志基因的实例是赋予对庆大霉素(g418)抗性的tn5氨基糖苷磷酸转移酶、赋予对潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶和赋予对嘌呤霉素抗性的嘌呤霉素乙酰转移酶。编码此类选择标志的重组表达载体可与编码期望蛋白的cdna的重组表达载体驻留在同一载体上，或其可被在单独载体上编码，该单独载体被同时引入和整合到宿主细胞基因组，经常导致不同转录单元之间的紧密物理连接。可与期望蛋白的cdna一起使用的其他类型的选择标志基因是基于编码二氢叶酸还原酶(dhfr)的各种转录单元。将这一类型的基因引入缺乏内源dhfr活性的细胞(优先地cho-细胞(dukx-b11、dg-44))，其将使得这些能够生长在缺少核苷的培养基中。此类培养基的一个实例是无次黄嘌呤、胸苷和甘氨酸的ham’sf12。这些dhfr-基因可与fviiicdna转录单元一起引入到以上类型的cho-细胞中，它们被连接在同一载体上或在不同的载体上，从而创建产生重组蛋白的dhfr-阳性细胞系。如果将以上细胞系在细胞毒性dhfr-抑制剂氨甲喋呤的存在下生长，将出现对氨甲喋呤抗性的新细胞系。由于扩增量的连接的dhfr和期望蛋白的转录单元，这些细胞系可以增加的比率产生重组蛋白。当在递增浓度的氨甲喋呤(1-10000nm)中繁殖这些细胞系时，可获得以非常高的速率产生期望蛋白的新细胞系。产生期望蛋白的以上细胞系可以以悬浮培养物或在各种固体支持物上大规模生长。这些支持物的实例是基于葡聚糖或胶原基质的微载体、或呈中空纤维或各种陶瓷材料形式的固体支持物。当在细胞悬浮培养物中或在微载体上生长时，以上细胞系的培养可作为浴式培养或作为灌注培养进行，并经长时间的持续产生条件培养基。因此，根据本发明，以上细胞系充分适合于用于产生期望的重组突变体蛋白工业方法的开发。纯化和配制在以上类型的分泌细胞的培养基中累积的重组修饰的vwf蛋白，可由多种生化和色谱方法浓缩和纯化，所述方法包括利用期望蛋白与细胞培养基中的其他物质之间在尺寸、电荷、疏水性、溶解度、比亲和性等方面的差异的方法。此类纯化的一个实例是将重组突变体蛋白吸附到被固定于固体支持物上的单克隆抗体，所述抗体是针对例如hlep、优选地人类白蛋白，或针对各自的凝血因子。在将修饰的vwf吸附到支持物、洗涤和解吸后，蛋白可基于以上性质由多种色谱技术进一步纯化。根据例如步骤的能力和选择性、支持物的稳定性或其他方面，选择纯化步骤的顺序。优选的纯化步骤包括但不限于离子交换色谱步骤、免疫亲和色谱步骤、亲和色谱步骤、疏水相互作用色谱步骤、染料色谱步骤、羟基磷灰石色谱步骤、多峰色谱步骤、和尺寸排阻色谱步骤。为了使病毒污染的理论风险最小化，可在方法中包括提供有效灭活或消除病毒的另外的步骤。此类步骤例如是以液态或固态的热处理、用溶剂和/或去垢剂处理、以可见光谱或uv光谱放射、γ-放射或纳米过滤。本发明的修饰的多核苷酸(例如dna)还可被整合到转移载体中，用于在人类基因疗法中使用。本文描述的各种实施方案可彼此组合。本发明将在以下其实施例中更详细地进一步描述。本发明的具体实施方案的这一描述将结合附图进行。如本发明描述的修饰的vwf可被配制成用于治疗用途的药物制品。可将纯化的蛋白溶解在常规的生理相容的含水缓冲溶液中，任选地可向其加入药物赋形剂以提供药物制品。此类药物载体和赋形剂以及合适的药物制剂是本领域公知的(参见例如“pharmaceuticalformulationdevelopmentofpeptidesandproteins”,frokjaer等,taylor&francis(2000)或"handbookofpharmaceuticalexcipients",第3版,kibbe等,pharmaceuticalpress(2000))。标准药物配制技术是本领域技术人员周知的(参见例如2005physicians'deskthomsonhealthcare:montvale,nj,2004、remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第20版,gennaro等编辑.lippincottwilliams&wilkins:philadelphia,pa,2000)。特别地，包含本发明的多肽变体的药物组合物可配制为冻干或稳定的液体形式。多肽变体可由本领域已知的多种程序冻干。冻干的制剂在使用前通过加入一种或更多种药学上可接受的稀释剂诸如无菌的注射用水或无菌的生理盐水溶液来重构。组合物的制剂通过任何药学上合适的施用方式递送至个体。各种递送系统是已知的并可用于通过任何方便的途径施用组合物。优先地，本发明的组合物系统地施用。对于系统使用，将本发明的蛋白配制成根据常规方法肠胃外(例如静脉内、皮下、肌内、腹膜内、脑内、肺内、鼻内或经皮)或肠内(例如口、阴道或直肠)递送。最优先的施用途径是静脉内和皮下施用。制剂可通过输注或通过弹丸注射连续施用。一些制剂包含缓释系统。本发明的蛋白以治疗有效剂量施用至患者，治疗有效剂量是指这样的剂量：足以产生期望的效应、阻止或减轻被治疗的状况或适应症的严重度或扩散，而不达到产生不可忍受的不利副作用的剂量。准确剂量依赖于许多因素如例如适应症、制剂和施用方式，并必须在临床前和临床试验中对每种各自的适应症确定。本发明的药物组合物可单独或与其他治疗剂联合施用。这些剂可被掺入作为同一药物的一部分。此类剂的一个实例是修饰的vwf和fviii的组合。“n-连接的聚糖”是共价连接到多肽的天冬酰胺残基的寡糖。在这种n-连接的聚糖上的末端半乳糖可以通过附接α-2,3-连接的唾液酸或α-2,6-连接的唾液酸修饰。术语“唾液酸”是指通常作为动物寡糖的末端单糖发现的神经氨酸的n-或o-取代衍生物(对于综述，参见varkis(1992)glycobiologyvol.2no.1pp.25-40)。最常见的唾液酸是n-乙酰神经氨酸。“增加的唾液酸化”是指糖蛋白的平均至少85％的n-聚糖包含至少一个唾液酸部分。作为非限制性实例，“增加至少85％的唾液酸化”如本发明的实施例6中确定，即通过从给定的感兴趣的糖蛋白酶促裂解所有n-聚糖并随后确定裂解的不含唾液酸的n-聚糖(“无唾液酸n-聚糖”)和全部裂解的n-聚糖的总量。然后，“至少85％的唾液酸化”对应于全部裂解的n-聚糖的总量的15％或更少的无唾液酸n-聚糖。在第一步中，本发明的方法包括提供包含编码包含截短的vonwillebrand因子(vwf)的多肽的核酸的细胞的步骤。如下文更详细描述的，本发明的方法包括提供包含编码包含截短的vwf的多肽的核酸的细胞。核酸通过其本身是已知的技术引入到合适的宿主细胞中。培养细胞在一个实施方案中，本发明包括在低于36.0℃的温度培养细胞。该方法包括在允许多肽表达的条件下培养细胞。用于培养宿主细胞系的基础培养基的选择对于本发明而言不是关键的，并且可以是适于培养哺乳动物细胞的本领域已知的任一种或其组合。培养基诸如dulbecco氏改良的eagle培养基、ham'sf-12培养基、eagle's最小必需培养基和rpmi-1640培养基等是商购可得的。生长因子诸如重组胰岛素的添加是任选的。在一个实施方案中，培养基是“无蛋白的”，意指其完全不含任何蛋白或至少不含非重组产生的任何蛋白。人血清白蛋白可以用作用于生产多肽的无血清培养基补充物。优选地，培养基包含蛋白酶抑制剂，诸如丝氨酸蛋白酶抑制剂，其适用于组织培养并且是合成或植物来源的。通常，本发明可以使用适合表达多肽的任何细胞培养方法。例如，细胞可以在分批补料或间歇补料培养中生长，其中培养在充分表达多肽后终止，之后收获表达的多肽。可选地，细胞可以在连续培养(例如灌流培养)中生长，其中培养不终止并且新的营养物和其他组分周期性地或连续地加入到培养中，在此期间周期性地或连续地收获表达的多肽。如果方法包括如下文所述的温度偏移，则后一个实施方案是优选的。培养可以是任何常规类型的培养，例如分批培养、间歇补料培养或连续培养，但优选连续培养。合适的连续培养包括灌流培养。细胞可以在从业者选择的任何方便的体积中生长。例如，细胞可以在体积从几毫升到几升的范围的小规模反应容器中生长。可选地，细胞可以在体积从大约至少1升至10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10,000、12,000升或更多的范围、或之间的任何体积的大规模商用生物反应器中生长。培养通常在生物反应器中进行，所述生物反应器通常为1(一)至10000(一万)升容量的不锈钢、玻璃或塑料容器中进行，例如5、10、50、100、1000、2500、5000或8000升。容器通常是刚性的，但可以使用柔性塑料袋，特别是对于较小的体积。这些通常是“单次使用”类型。哺乳动物细胞诸如cho和bhk细胞通常作为悬浮培养物培养。也就是说，细胞悬浮在培养基中，而不是粘附在固体支持物上。可选地，细胞可以固定在载体上，特别是微载体上。多孔载体诸如或可能特别合适。为获得高唾液酸化作用，细胞(例如cho细胞)优选在降低的温度培养，例如，在低于36.0℃的温度。“降低的温度”是指低于用于各自细胞系生长的最佳温度或正常温度的温度。对于大多数哺乳动物细胞，正常温度是37℃。因此，根据本发明优选的是，细胞(例如cho细胞)在30.0至36.0℃、30.5至35.5℃、31.0至35.0℃、31.5至34.5℃、32.0至34.0℃、或32.5至33.5℃的降低的温度培养。优选地，细胞在30.0℃±1.0℃、31.0℃±1.0℃、32.0℃±1.0℃、33.0℃±1.0℃、34.0℃±1.0℃、或35.0℃±1.0℃的降低的温度培养。降低的温度保持足以增加待表达的多肽的唾液酸化的时间段。优选地，降低的温度保持至少1小时、至少6小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、或至少144小时。在其他实施方案中，降低的温度保持1小时至8周、6小时至6周、12小时至5周、18小时至4周、24小时至3周、48小时至14天、72小时至10小时天、或3至7天。为了实现这一点，在培养过程期间培养物可以被置于一次或更多次温度变化。当改变培养的温度时，温度变化可能是相对渐进的。例如，可能用几小时或几天来完成温度变化。可选地，温度变化可以相对突然。在培养过程期间，温度可以稳定地升高或降低。可选地，温度可以在培养过程期间的不同时间以离散的量升高或降低。随后的温度或温度范围可以低于或高于初始或先前的温度或温度范围。本领域普通技术人员将会理解，在此实施方案中包含多次离散的温度变化。例如，温度可以变化一次(向较高或较低温度或温度范围)，细胞保持在该温度或温度范围持续一段时间，之后温度可以再次变化到新的温度或温度范围，其可以高于或低于之前温度或温度范围的温度或温度范围。每次离散的变化后培养的温度可以是恒定的或可以保持在一定的温度范围内。通常，细胞(例如cho细胞)最初将在37.0℃±1.0℃的“正常”温度培养直至达到目标细胞密度。最初的培养期之后是温度变化到降低的温度。在降低的温度培养一段时间后，温度可能会或可能不会向正常温度变化。优选地，细胞(例如，cho细胞)最初将在37.0℃±1.0℃培养几天，随后在31.0℃-35.0℃的降低的温度生产。基于本公开内容，本领域普通技术人员将能够根据各自细胞系的特定需求和从业者的特定生产要求来选择细胞生长的温度。在某些实施方案中，一旦表达的多肽达到足够高的滴度，分批生物反应器和间歇补料生物反应器就终止。另外或可选地，一旦细胞达到足够高的密度，分批生物反应器和间歇补料生物反应器可以终止，如通过从业者的需要所确定的。例如，一旦细胞达到最大存活细胞密度的1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99％，则培养可以终止。另外或可选地，分批生物反应器和间歇补料生物反应器可以在代谢废弃产物诸如乳酸盐和铵的过量积累之前终止。在某些情况下，在随后的生产阶段期间对细胞培养物补充可能已经被细胞消耗或代谢的营养物或其他培养基组分可能是有益的。作为非限制性实例，对细胞培养物补充激素和/或其他生长因子、无机离子(诸如例如钠、氯、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以非常低的终浓度存在的无机化合物)、氨基酸、脂质或葡萄糖或其他能量来源可能是有益的。这些补充组分可以一次全部添加到细胞培养物中，或者它们可以以一系列添加物提供给细胞培养物，或者它们可以在灌流培养期间与新鲜培养基一起提供。作为分批生物反应器和间歇补料生物反应器的代替，当表达本发明的多肽的细胞在连续灌流生物反应器中培养时，也可以实施本发明。本领域普通技术人员将能够调整特定细胞培养条件以优化细胞培养的某些特征，包括但不限于生长速率、细胞存活力、细胞培养物的最终细胞密度、有害的代谢副产物诸如乳酸盐和铵的最终浓度、表达的多肽的滴度、寡糖侧链的程度和组成、或这些或被实践者认为是重要的其他条件的任何组合。表达的多肽的分离一般而言，通常希望分离和/或纯化根据本发明表达的多肽。在某些实施方案中，表达的多肽分泌到培养基中，并因此通过例如离心或过滤可以去除细胞和其他固体，作为纯化过程的第一步。表达的多肽可通过标准方法分离和纯化，所述标准方法包括但不限于色谱法(例如离子交换色谱、亲和色谱、尺寸排阻色谱和羟基磷灰石色谱)、凝胶过滤、离心或差异溶解度、乙醇沉淀和或通过用于蛋白纯化的任何其他可用技术(参见例如scopes,proteinpurificationprinciplesandpractice第二版,springer-verlag,newyork,1987；higgins,s.j.和hames,b.d.(编辑),proteinexpression:apracticalapproach,oxfordunivpress,1999；和deutscher,m.p.,simon,m.i.,abelson,j.n.(编辑),guidetoproteinpurification:methodsinenzymology(methodsinenzymologyseries,vol.182),academicpress,1997，其每一个通过引用并入本文)。对于免疫亲和色谱，具体而言，可以通过将多肽与包含针对该多肽产生的抗体并固定到固定支持物上的亲和柱来分离多肽。可选地，亲和标签诸如流感衣壳序列、聚组氨酸或谷胱甘肽-s-转移酶可以通过标准重组技术附接至多肽，以允许通过适当的亲和柱进行容易的纯化。蛋白酶抑制剂如苯基甲基磺酰氟(pmsf)、亮肽素、胃蛋白酶抑制剂或抑肽酶可以在任何或所有阶段加入，以减少或消除纯化过程期间多肽的降解。当细胞必须裂解以分离和纯化表达的多肽时，蛋白酶抑制剂是特别有利的。另外或可选地，可以在任何或所有阶段加入糖苷酶抑制剂以减少或消除共价附接的寡糖链的酶修饰。根据本发明表达的多肽比在传统细胞培养条件下生长时具有更大量的唾液酸化。因此，可以在纯化步骤中利用的本发明的一个实际益处是根据某些本发明的方法生长的多肽上的另外的和/或改变的唾液酸残基可赋予其不同的生物化学性质，从业者可以使用该不同的生物化学性质以比根据更传统方法生长的多肽可能更容易地更纯地化该多肽。例如，利用唾液酸残基的负电荷，多肽可以通过阴离子交换色谱纯化或极大地富集。由此可以实现具有高唾液酸化的多肽的进一步富集。在另外的实施方案中，通过在体外使通过本发明的方法获得的多肽与唾液酰基转移酶接触，可以进一步提高多肽的唾液酸化。唾液酰基转移酶通常是哺乳动物唾液酰基转移酶，优选地它是人唾液酰基转移酶。唾液酰基转移酶可以是α-2,3-唾液酰基转移酶和/或α-2,6-唾液酰基转移酶。优选地，唾液酰基转移酶是人α-2,3-唾液酰基转移酶(genbanknp_775479-st3gal1)和/或人α-2,6-唾液酰基转移酶。最优选地，唾液酰基转移酶是由genbanknp_003023-st6gal1鉴定的人α-2,6-唾液酰基转移酶。还存在于体外反应中的是唾液酰基基团供体或唾液酸供体。合适的供体包括例如胞苷-5'-单磷酸-n-乙酰神经氨酸(cmp-nana)，roche目录号05974003103。适用于体外唾液酸化的试剂盒可从roche获得(目录号07012250103)。本领域普通技术人员将会理解，确切的纯化技术将根据待纯化的多肽的特性、表达多肽的细胞的特性和/或细胞在其中生长的培养基的组成变化。如上所提到的，本发明在第二方面涉及产生包含具有增加的唾液酸化的n-聚糖的多肽的方法，所述方法包括(i)提供细胞，所述细胞包含编码包含截短的vonwillebrand因子(vwf)的多肽的核酸和编码α-2,3-唾液酰基转移酶和/或α-2,6-唾液酰基转移酶，优选α-2,6-唾液酰基转移酶的重组核酸，，和(ii)在允许多肽表达的条件下培养细胞。α-2,3-唾液酰基转移酶优选是人α-2,3-唾液酰基转移酶。编码人α-2,3-唾液酰基转移酶的cdna序列在seqidno：12中示出，并且基于此，本领域技术人员可以设计含有α-2,3-唾液酰基转移酶的编码序列的合适的表达载体。α-2,6-唾液酰基转移酶优选是人α-2,6-唾液酰基转移酶。编码人α-2,6-唾液酰基转移酶的cdna序列在seqidno：31中示出，并且基于此，本领域技术人员可以设计含有α-2,6-唾液酰基转移酶的编码序列的合适的表达载体。转染的细胞可以根据已知的培养方法在允许多肽表达的条件下培养。多肽可以使用建立的纯化技术回收和/或分离。本发明的多肽本发明还涉及通过本文描述的方法可获得的多肽。另一方面，本发明涉及包含截短的vonwillebrand因子(vwf)的多肽，其中所述截短的vwf能够结合因子viii(fviii)，并且其中所述多肽包含n-聚糖，并且平均所述n-聚糖的至少85％，更优选至少90％包含至少一个唾液酸部分。在优选的实施方案中，平均所述n-聚糖的至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％包含至少一个唾液酸部分。发明人证实了包含高度唾液酸化vwf片段的多肽不仅本身具有延长的半衰期，而且还能够延长共同施用的fviii的半衰期。换句话说，本发明的多肽的施用导致共同施用的fviii的延长的半衰期和/或降低的清除率。第五方面，本发明涉及包含截短的vonwillebrand因子(vwf)的多肽，其中所述截短的vwf能够结合因子viii(fviii)，并且其中所述多肽包含n-聚糖，其中多肽的n-聚糖的唾液酰基基团的至少50％是α-2,6-连接的唾液酰基基团。通常，末端唾液酰基基团可以经由α-2,3-连键或经由α-2,6-连键与半乳糖基团附接。通常，本发明多肽的n-聚糖包含比α-2,3-连接的唾液酰基基团更多的α-2,6-连接的唾液酰基基团。优选地，n-聚糖的唾液酰基基团的至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％是α-2,6-连接的唾液酰基基团。这些实施方案可以通过例如在哺乳动物细胞中共表达人α-2,6-唾液酰基转移酶来获得。在一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖的至少85％、至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％包含至少一个唾液酸基团。在另一个实施方案中，本发明的多肽中截短的vwf的n-聚糖的至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％包含至少一个唾液酸基团。在另一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖的小于15％、小于12％、小于10％、或小于8％、或小于6％、或小于5％、或小于4％、或小于3％、或小于2％或甚至小于1％是无唾液酸-n-聚糖，即它们是缺少唾液酸基团的n-聚糖。在另一个实施方案中，本发明的多肽中截短的vwf的n-聚糖的小于15％、小于12％、小于10％、或小于8％、或小于6％、或小于5％、或小于4％、或小于3％、或少于2％或甚至少于1％是无唾液酸-n-聚糖，即它们不具有唾液酸基团。在另一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖的少于25％、少于20％、少于15％、或少于10％是单唾液酸-n-聚糖，即它们是具有一个唾液酸基团的n-聚糖。在另一个实施方案中，本发明的多肽中截短的vwf的n-聚糖的少于25％、少于20％、少于15％、或少于10％是单唾液酸-n-聚糖，即它们是具有一个唾液酸基团的n-聚糖。作为非限制性实例，单唾液酰基化n-聚糖的量可以如实施例6中详述的那样确定。在又另一个实施方案中，本发明多肽的n-聚糖的至少20％或至少25％是二唾液酸-n-聚糖，即它们是具有2个唾液酸基团的n-聚糖。在又另一个实施方案中，本发明的多肽中截短的vwf的n-聚糖的至少20％或至少25％是二唾液酸-n-聚糖。在又另一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖的至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％是三唾液酸-n-聚糖，即它们是具有3个唾液酸基团的n-聚糖。在又另一个实施方案中，本发明的多肽中截短的vwf的n-聚糖的至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％是三唾液酸-n-聚糖。在又另一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖的至少5％或至少10％是四唾液酸-n-聚糖，即它们是具有4个唾液酸基团的n-聚糖。在又另一个实施方案中，本发明多肽中截短的vwf的n-聚糖的至少10％或至少15％是四唾液酸-n-聚糖。在另一个实施方案中，本发明的多肽的n-聚糖的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％包含两个或更多个唾液酸基团。在另一个实施方案中，本发明的多肽中截短的vwf的n-聚糖的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％包含两个或更多个唾液酸基团。上述实施方案可以彼此组合。上文提到的n-聚糖的任何百分比或唾液酸化程度的任何指示应被理解为平均百分比或程度，即它们指的是分子群而不是单个分子。很明显，多肽群体内单个多肽分子的糖基化或唾液酸化将显示出一些异质性。本发明的另一个方面是药物试剂盒，所述药物试剂盒包含(i)上文定义的多肽和(ii)因子viii。优选地，多肽和fviii包含在分开的组合物中。本发明的另一方面是药物试剂盒，所述药物试剂盒包含(i)上文定义的多肽和(ii)因子viii，用于在凝血障碍的治疗中同时、分开或依序使用。在本文提及的序列的概述在表3中列出。表3seqidno：描述1编码seqidno：2的dna的核苷酸序列2人vwf前-原多肽的氨基酸序列3人vwf的d'-d3结构域的氨基酸序列4成熟人vwf的氨基酸序列5包括突变s764p/s766w/v1083a的截短的vwf6包括突变s764g/s766y/v1083a的截短的vwf7包括突变s764e/s766y/v1083a的截短的vwf8包括突变n1011s/v1083a/k1181e的截短的vwf9包括突变v1083a的截短的vwf10包括突变s1042t的截短的vwf11包括突变v805a/q1158l的截短的vwf12包括突变k912e/t1088s的截短的vwf13包括突变l781p的截短的vwf14人因子viii的氨基酸序列15成熟单链因子viii的氨基酸序列16人血清白蛋白的氨基酸序列17包括突变s766y/v1083a的截短的vwf18包括突变s764g/s766y的截短的vwf19包括突变s764p/s766i的截短的vwf20包括突变s764p/s766m的截短的vwf21包括突变s764v/s766y的截短的vwf22包括突变s764e/s766y的截短的vwf23包括突变s764y/s766y的截短的vwf24包括突变s764l/s766y的截短的vwf25包括突变s764p/s766w的截短的vwf26包括突变s766w/s806a的截短的vwf27包括突变s766y/p769k的截短的vwf28包括突变s766y/p769n的截短的vwf29包括突变s766y/p769r的截短的vwf30包括突变s764p/s766l的截短的vwf31编码人α-2,6-唾液酰基转移酶的cdna实施例实施例1具有改进的fviii结合的vwf突变体背景如上文和共同待决的国际专利申请第pct/au2015/050369号中讨论的，循环fviii的大部分与vwf复合。在人类中，在不存在和存在vwf的条件下，fviii分别以约2小时和16小时的t1/2从血液清除。尽管vwf给予fviii半衰期的延长，其还对t1/2设置了由其自身的半衰期规定的上限。us8,575,104公开了vwf-白蛋白融合蛋白。在啮齿动物模型中，该融合蛋白具有比野生型vwf长五倍的半衰期。该融合蛋白与fviii之间的稳定复合物可赋予fviii另外的半衰期益处。尽管fviii/vwf相互作用的平衡结合常数高，但是结合动力学是快速的且与vwf-白蛋白融合蛋白复合的任何fviii将在输注后快速地与内源性vwf交换。因此，如果fviii与vwf-白蛋白融合物的解离速率大致上等同于fviii与天然vwf的解离速率，则vwf-白蛋白融合物的使用将不提供fviii的半衰期方面的任何实质增加。因此，为了利用vwf-白蛋白融合物的较长半衰期来延长fviii的半衰期，降低fviii与vwf-白蛋白融合物的解离速率是必要的。从利用在2n型vonwillebrand病的患者(其中vwf的水平正常但vwf与fviii缔合的能力严重降低)中进行测量的建模研究，已经估计，需要解离速率的至少五倍降低以提供fviii半衰期的临床相关改进。fviiivwf-白蛋白融合物解离速率的降低与fviii半衰期的延长之间的假定关系在表4中列出。表4为了试图降低fviiivwf-白蛋白融合物解离速率，进行了实验以评估突变的vwf-白蛋白融合蛋白是否可以提供显著减慢的fviii解离速率，从而提供经由与vwf-白蛋白融合蛋白的稳定缔合而延长fviii的半衰期的可行选项。在围绕vwf的氨基酸位置764、765、766、768、769、773、806和809构建了一系列突变体，意图是减慢结合的fviii的解离速率。在这些实验中，使用了重组形式的fviii。此fviii在zollner等2013,thrombosisresearch,132:280-287中描述。最初，测量上文提及的残基中的一个突变成所有遗传编码的氨基酸(不包括半胱氨酸)的vwf构建体的fviii结合。鉴定改进的结合物之后，产生包括突变的组合的变体的另外的组。此外，由于由白蛋白融合物提供的半衰期延长依赖于fcrn介导的再循环，还在ph5.5测试了许多突变体。各种突变的结果在表5至20中示出。方法编码人vonwillebrand因子的d’和d3结构域(vwf；氨基酸(aa)764-1270(seqidno：2)；基于genbank登录号np_000543)的合成的、密码子优化的cdna从geneartag(regensberg,germany)获得。其在5'末端被修饰以编码其自身的信号肽(aa1-22)且在3'末端被修饰以编码c-末端8xhis-标签。将该构建体(hu-vwf[764-1270]-8his)定向地克隆到在起始甲硫氨酸的上游具有kozak共有序列(gccacc)且在开放阅读框的3'末端具有双终止密码子(tga)的pcdna3.1哺乳动物表达载体(invitrogen,usa)中，并通过自动测序确认质粒序列。然后将这一表达质粒用作模板，利用标准pcr技术制造在ser764、leu765、ser766或lys773处的单残基、双残基或三残基改变，并将构建体克隆到pcdna3.1并如以上文所述地测序。还合成并从geneart获得了编码具有c-末端flag标签(dykddddk)的hu-vwf的d1和d2结构域(aa1-762)的第二密码子优化的cdna；如上文将其克隆到pcdna3.1中并测序。对于瞬时哺乳动物表达，将freestyletm293悬浮细胞(invitrogen]在5mlfreestyle表达培养基(invitrogen)中生长至1.1x106细胞/ml。将7μl293fectin(invitrogen)转染试剂与167μlopti-memi培养基(invitrogen)预孵育5分钟，随后添加至2.5μg编码野生型/突变体hu-vwf[764-1270]-8his的质粒dna加2.5μg编码hu-vwf[1-762]-flag的质粒dna，并将混合物孵育持续另外20分钟。将dna-293fectin复合物添加至细胞，将其在37℃，8％co2，250rpm的振荡培养箱中培养6天。培养上清液通过在2000rpm离心5分钟收获并储存在4℃用于分析。通过在37℃使用biacore4000生物传感器通过表面等离子体共振研究结合动力学。在预固定有抗his抗体(14,000ru)的cm-5传感器芯片上从细胞培养基捕获每种突变体至40-150ru的密度。在初始筛选研究中，将fviii以1nm注入到被捕获的突变体上持续5分钟，并监测解离持续5分钟。然后，相对于野生型显示kd降低的突变体用以1、0.5和0.25nm注入持续5分钟的fviii来再次检查，并监测解离持续30分钟。所有传感图通过减去来自参考点(仅包含固定的抗his抗体)和来自空白注入的信号来进行双重参考。通过将双重参考的传感图拟合于1:1动力学模型来确定结合动力学。结果丝氨酸764向脯氨酸的诱变生成了具有解离速率降低约3.5倍和亲和力增加4.4倍的vwf变体。在位置765处的突变不产生相对于野生型vwf的任何更好的结合物。在位置766处的许多突变生成具有改进的解离速率特征和比野生型vwf更高的亲和力的变体vwf分子(his、arg、val、tyr、trp、thr、phe、ile、gln、gly&asn)。考虑到位置764处的脯氨酸对解离速率赋予显著改进，且在位置766处的许多突变积极地影响结合，生成了由s764p和在位置766处除了半胱氨酸以外的所有其他遗传编码的氨基酸组成的一系列突变体。产生了包含s764p和在位置765处除了半胱氨酸以外的所有其他遗传编码的氨基酸的类似突变。许多这些双重突变体具有相对于野生型vwf显著减缓的解离速率和更高的亲和力。特别是，s764p与s766i组合生成了解离速率降低约22倍和亲和力增加30倍的vwf变体。实施例2具有点突变的人血清白蛋白vwf融合物和fviii结合随后的实验使用融合至人血清白蛋白的vwf进行。编码人vonwillebrand因子的d'和d3结构域(vwf；氨基酸(aa)764-1242；基于genbank登录号np_000543)的合成的、密码子优化的cdna从geneartag(regensberg,germany)获得。其在5'末端被修饰以编码其自身的信号肽(aa1-22)且在3'末端被修饰以编码经由甘氨酸丝氨酸接头的人血清白蛋白(hsa)，并如实施例1中描述的克隆。使用如实施例1中描述的相同方法来生成各种vwf突变并将所得构建体瞬时转染到freestyletm293悬浮细胞中。使用captureselecttm人白蛋白亲和树脂从收获物纯化vwf-hsa蛋白，并通过制备型尺寸排阻色谱进一步纯化vwf-hsa二聚体。对包括对照在内的前面的候选物设置在ph7的详细的动力学分析。使用标准nhs/edc偶联化学将小鼠抗-hsa抗体固定在cm5芯片上。通常，固定化水平在10,000至12,000ru之间。将每批vwf-hsa(单体和二聚体)以范围从0.1-1μg/ml的不同浓度捕获在每个流通池中的单个点上，持续2分钟。捕获水平的范围从40-150ru。其中固定了抗-vwf但无捕获的vwf-hsa的相邻点被用作参考。在fviii结合分析之前每周期进行捕获。根据相互作用的亲和力和分析的ph，fviii随机地且一式两份地以不同浓度注入所有流通池中的所有点。对fviii的缔合和解离监测持续最适合发生相互作用的不同时间框。解离阶段后，通过30秒钟注入25mm甘氨酸ph2.6来再生表面。期间的运行缓冲液为10mmhepes、150mmnacl、10mm柠檬酸na、2.5mmcacl2、0.1％bsa、ph7.3和ph5，而流速为30μl/min。每种相互作用在37℃测量4次(n＝4)。从vwf-hsa捕获点的那些响应减去结合到参考点的响应。然后从所有其他样品的那些响应减去来自空白注入的响应以产生双重参考的传感图。将双重参考的传感图拟合至包括用于质量传递限制(masstransportlimitation)的项的1:1动力学模型。全局地拟合缔合和解离速率并局部地拟合rmax。获得的结果在表21和表22中列出。表5表6n/d：弱结合、不良拟合、快解离速率表7n/d：弱结合、不良拟合、快解离速率表8突变体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)wt-k773t1.42e+076.97e-044.92e-11wt-k773a5.81e+068.83e-041.52e-10wt-k773l1.88e+071.10e-035.86e-11wt-k773r1.45e+071.23e-038.46e-11wt-k773q8.60e+061.45e-031.68e-10wt-k773m1.57e+072.35e-031.50e-10wt-k773s1.35e+073.23e-032.40e-10wt-k773p9.58e+063.33e-033.48e-10wt-k773i7.66e+074.09e-035.35e-11wt-k773v5.39e+075.23e-039.70e-11wt-k773h1.19e+091.57e-011.32e-10wt-k773n3.61e+098.36e-012.32e-10wt-k773wn/dwt-k773en/dwt-k773dn/dwt-k773gn/dwt-k773fn/dwt-k773yn/dwt7.33e+061.15e-031.57e-10n/d：存在结合，但未能确定准确的动力学参数表9n/d：弱结合、不良拟合、快解离速率表10n/d：弱结合、不良拟合、快解离速率表11突变体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)s764p-k773r6.39e+067.42e-051.16e-11s764p-k773t4.68e+067.50e-051.60e-11s764p-k773q4.44e+061.28e-042.88e-11s764p-k773v1.55e+071.57e-041.01e-11s764p-k773i1.79e+071.69e-049.43e-12s764p-k773m1.58e+071.70e-041.08e-11s764p-k773a6.37e+061.89e-042.97e-11s764p-k773s2.16e+073.06e-041.42e-11s764p-k773n5.50e+063.47e-046.31e-11s764p-k773p2.26e+075.01e-042.22e-11s764p-k773l4.60e+055.72e-041.24e-09s764p-k773h1.65e+076.36e-043.86e-11s764p-k773g1.75e+077.62e-044.36e-11s764p-k773f1.02e+071.23e-031.21e-10s764p-k773y1.63e+071.36e-038.35e-11s764p-k773d1.77e+072.40e-031.36e-10s764p-k773w1.25e+073.21e-032.57e-10s764p-k773e6.73e+075.15e-037.65e-11wt7.33e+061.15e-031.57e-10表12突变体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)s766y-k773t1.20e+072.69e-042.24e-11s766y-k773l1.79e+073.45e-041.92e-11s766y-k773r1.40e+074.69e-043.35e-11s766y-k773i8.02e+065.69e-047.10e-11s766y-k773m1.97e+076.59e-043.35e-11s766y-k773v1.74e+078.61e-044.94e-11s766y-k773q2.39e+079.39e-043.93e-11s766y-k773a1.88e+071.22e-036.51e-11s766y-k773s1.75e+071.38e-037.85e-11s766y-k773g6.02e+071.97e-033.27e-11s766y-k773p2.16e+072.43e-031.12e-10s766y-k773f2.05e+073.24e-031.58e-10s766y-k773w2.93e+073.93e-031.34e-10s766y-k773y2.24e+074.04e-031.80e-10s766y-k773e1.84e+074.81e-032.61e-10s766y-k773n5.15e+075.07e-039.84e-11s766y-k773h5.47e+076.20e-031.14e-10s766y-k773d1.25e+084.27e-023.43e-10wt7.33e+061.15e-031.57e-10表13突变体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)s764g/s766y1.37e+072.69e-051.96e-12s764v/s766y2.99e+076.41e-052.15e-12s764a/s766y2.98e+077.21e-052.42e-12s764e/s766y1.97e+077.64e-053.87e-12s764p-s766y1.08e+077.71e-057.16e-12s764y/s766y3.19e+077.88e-052.47e-12s764l/s766y3.52e+077.99e-052.27e-12s764n/s766y1.28e+078.88e-056.92e-12s764r/s766y3.23e+079.20e-052.85e-12s764f/s766y7.68e+069.36e-051.22e-11s764i/s766y1.03e+079.52e-059.23e-12s764w/s766y8.88e+069.67e-051.09e-11s764m/s766y7.15e+061.03e-041.44e-11s764q/s766y1.19e+071.09e-049.18e-12s764d/s766y3.78e+071.18e-043.12e-12s764t/s766y2.58e+071.36e-045.27e-12s764h/s766y4.56e+072.92e-046.39e-12s764k/s766y1.89e+078.22e-044.35e-11wt7.33e+061.15e-031.57e-10表14突变体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)s764p-l765h-s766i1.56e+066.60e-054.24e-11s764p-l765v-s766i5.62e+071.16e-042.07e-12s764p-l765m-s766i5.69e+071.37e-042.41e-12s764p-l765w-s766i1.11e+061.46e-041.32e-10s764p-l765q-s766i1.15e+062.86e-042.48e-10s764p-l765k-s766i6.88e+071.50e-032.18e-11s764p-l765y-s766i5.17e+071.90e-033.67e-11s764p-l765t-s766i1.15e+083.31e-032.87e-11s764p-l765i-s766i6.34e+061.03e-021.62e-09s764p-l765g-s766i5.04e+071.22e-022.41e-10s764p-l765r-s766i7.96e+071.73e-022.18e-10s764p-l765e-s766i1.03e+065.50e-025.36e-08s764p-l765f-s766in/ds764p-l765n-s766in/ds764p-l765d-s7661n/ds764p-l765p-s766in/ds764p-l765s-s766in/ds764p-l765a-s766in/dn/d：存在结合，但未能确定准确的动力学参数表15突变体ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)dups764/s764p/s766i6.23e+061.59e-032.55e-10dups764/s764p/s766i1.25e+072.50e-031.99e-10ds764-dl765-s766ids764-dl765-s766yn/ddels764-s766y6.20e+062.07e-043.34e-11dels764-s766w6.60e+063.15e-044.78e-11dels764-s766l6.21e+065.85e-049.42e-11dels764-s766m7.25e+067.26e-041.00e-10dels764-s766i7.09e+068.27e-041.17e-10dels764-s766s7.30e+068.46e-041.16e-10n/d：存在结合，但未能确定准确的动力学参数表16n/d：存在结合，但未能确定准确的动力学参数表17表18n/d：存在结合，但未能确定准确地动力学参数表19表20表21表22实施例3在pct/au2015/050369中描述的工作的延伸中，研究了另外的突变和突变的组合，重点在于d3结构域中的修饰。在这些实验中使用了重组形式的fviii。该fviii在zollner等2013,thrombosisresearch,132:280-287中描述。方法编码vwf(763-1242)-hsa且包含表23中列出的单突变、双突变或三突变的质粒构建体被用于使用实施例2中所述的方法生成纯化的vwf-hsa二聚体蛋白。对包括对照在内的前面的候选物设置在ph7的详细的动力学分析。利用标准nhs/edc偶联化学将小鼠抗-hsa抗体固定在cm5芯片上。通常，固定化水平为约14,000ru。将vwf-hsa的每个二聚体突变体以范围从0.1-1μg/ml的不同浓度捕获在每个流通池中的单个点上持续2分钟。捕获水平的范围从100-200ru。其中固定了抗-hsa，但无捕获的vwf-hsa的相邻点被用作参考。在fviii结合分析之前每周期进行捕获。在初始试验中，因子viii以5、1和1.25nm随机且一式两份地注射到全部点和使用的全部流动池。该分析的结果在表23中列出。表23：ph7的筛选：因子viii对各种突变体d'd3-hsa二聚体蛋白的亲和力和动力学速率，从最强亲和力至最弱亲和力排序。wt＝野生型实施例4详细的动力学分析进行随后的实验，其中对包括对照在内的前两名候选物设置在ph7的详细的动力学分析。将因子viii以1nm、0.5nm、0.25nm、0.125nm和0.06nm注射。以类似的方式，对包括对照在内的前两名候选物设置在ph5.5的详细动力学分析，其中因子viii以最适合相互作用的不同浓度注射。在全部实验中，缓冲液空白也注射在全部捕获蛋白中。在“筛选”实验期间，分别监测因子viii的缔合和解离持续3分钟。在中性ph的“详细的动力学分析”实验期间，监测csl627的缔合持续5分钟且监测解离持续20分钟和60分钟。在ph5.5，对因子viii的缔合和解离监测持续最适合相互作用的不同时间框。解离阶段后，通过45秒钟注入25mm甘氨酸ph2.6来再生表面。期间的运行缓冲液为10mmhepes、150mmnacl、10mm柠檬酸na、2.5mmcacl2、0.1％bsa,ph7.3和ph5.5，而流速为30μl/min。在37℃测量每种相互作用至少2次(n＝2)。从vwf-hsa捕获点的那些响应减去结合到参考点的响应。然后从所有其他样品的那些响应减去来自空白注入的响应，以产生双重参考的传感图。将双重参考的传感图拟合至包括用于质量传递限制的项的1:1动力学模型。全局地拟合缔合和解离速率并局部地拟合rmax。结果在表24和表25中列出并在图1-3中示出。表24：ph7的详细动力学：因子viii对突变体d'd3-hsa二聚体的亲和力和动力学速率。wt＝野生型表25：ph5.5的详细动力学：因子viii对突变体d'd3-hsa二聚体的亲和力和动力学速率实施例5进一步的动力学分析简要的方法：随后使用相同的实验方法生成另外的突变组合并进行详细的动力学分析。使用标准nhs/edc偶联化学将小鼠抗-hsa抗体固定在cms芯片上。通常，固定化水平为约14,000ru。将d’d3-hsa的每个二聚体突变体以范围从0.2-0.7μg/ml的不同浓度捕获在每个流通池中的单个点上持续2分钟。捕获水平的范围从50ru-250ru。其中固定了抗-hsa，但无捕获的d’d3-hsa的相邻点被用作参考。在进行fviii(csl627)结合分析之前每周期进行捕获。csl627随机并一式两份地注射在全部流动池中的全部点。在中性ph，将csl627以1nm、0.5nm、0.25nm、0.125nm和0.06nm注射。在1nm浓度，监测缔合持续5分钟，而监测解离持续20分钟以及1小时。还注入缓冲液空白。在ph5.5，csl627以多种浓度并在最适于相互作用发生的时间框注射。解离阶段后，通过45秒钟注入25mm甘氨酸ph2.6来再生表面。期间的运行缓冲液为10mmhepes、150mmnacl、10mm柠檬酸na、2.5mmcac12、0.1％bsa,ph7.3和ph5.5，而流速为30μl/min。在37℃测量每种相互作用4次(n＝4)。从vwf-hsa捕获点的那些响应减去对参考点结合的响应。然后从所有其他样品的那些响应减去来自空白注入的响应以产生双重参考的传感图。将双重参考的传感图拟合至包括用于质量传递限制的项的1:1动力学模型。全局地拟合缔合和解离速率并局部地拟合rmax。结果如表26和表27以及图4和图5所示。表26：ph7的详细的动力学：csl627(因子viii)结合突变体d’d3-hsa二聚体的亲和力和动力学速率。表28：ph5.5的详细的动力学：csl627结合突变体d’d3-hsa二聚体的亲和力和动力学速率。实施例6pk分析和对fviii半衰期的影响方法使用标准实验方法生成表达huvwfd’d3-fps764e；s766y变体的稳定的cho衍生的细胞系。材料在10l生物反应器中从稳定的细胞系产生，并且如上文所述地纯化vwfd’d3-fps764e；s766y二聚体。为了评估野生型和vwfd’d3-fps764e；s766y变体对fviii水平的相对影响，向cd大鼠(3只动物/组)给予重组fviii(200iu/kg的csl627)和在表9中示出的剂量的vwf-fp蛋白的组合。血浆样品在iv施用后0、3、8、24、48、56和72小时采集，并使用asserachromfviii:agelisa确定fviii水平。随后，使用此数据来确定表29中给出的fviii半衰期和平均滞留时间。表29：pk分析：共同施用重组fviii和d’d3-hsa二聚体后fviii半衰期和平均滞留时间结论：从具有突变的d'd3-hsa的初始筛选：s764p、s766w、v1083a(称为pwa突变体)和s764g、s766y、v1083a(称为gya突变体)表现出对因子viii具有最强的亲和力和最低的解离速率。在中性ph，对csl627(因子viii)具有最改善的亲和力和解离速率的vwfd'd3-hsa突变体二聚体是s764g/s766y/v1083a(gya)、s764e/s766y/v1083a(eya)和s766y/v1083a(ya)，具有5pmkd和10-51/s解离速率。与野生型二聚体相比，这是大约20倍的亲和力改善和40倍的解离速率改善。在酸性ph，对csl627具有最改善的亲和力和解离速率的vwfd'd3-hsa突变体二聚体是具有500pmkd和10-31/s解离速率的eya。基于此，与野生型二聚体相比，eya的亲和力和解离速率的改善分别为约100倍和至少10倍。在中性和酸性ph，eya二聚体对csl627表现出与s764p/s766i相似的动力学速率和亲和力。序列表<110>瑞士杰特有限公司<120>突变的截短的vonwillebrand因子<130>35260923<150>2016900034<151>2016-01-07<160>31<170>patentinversion3.5<210>1<211>8442<212>dna<213>智人（homosapiens）<400>1atgattcctgccagatttgccggggtgctgcttgctctggccctcattttgccagggacc60ctttgtgcagaaggaactcgcggcaggtcatccacggcccgatgcagccttttcggaagt120gacttcgtcaacacctttgatgggagcatgtacagctttgcgggatactgcagttacctc180ctggcagggggctgccagaaacgctccttctcgattattggggacttccagaatggcaag240agagtgagcctctccgtgtatcttggggaattttttgacatccatttgtttgtcaatggt300accgtgacacagggggaccaaagagtctccatgccctatgcctccaaagggctgtatcta360gaaactgaggctgggtactacaagctgtccggtgaggcctatggctttgtggccaggatc420gatggcagcggcaactttcaagtcctgctgtcagacagatacttcaacaagacctgcggg480ctgtgtggcaactttaacatctttgctgaagatgactttatgacccaagaagggaccttg540acctcggacccttatgactttgccaactcatgggctctgagcagtggagaacagtggtgt600gaacgggcatctcctcccagcagctcatgcaacatctcctctggggaaatgcagaagggc660ctgtgggagcagtgccagcttctgaagagcacctcggtgtttgcccgctgccaccctctg720gtggaccccgagccttttgtggccctgtgtgagaagactttgtgtgagtgtgctgggggg780ctggagtgcgcctgccctgccctcctggagtacgcccggacctgtgcccaggagggaatg840gtgctgtacggctggaccgaccacagcgcgtgcagcccagtgtgccctgctggtatggag900tataggcagtgtgtgtccccttgcgccaggacctgccagagcctgcacatcaatgaaatg960tgtcaggagcgatgcgtggatggctgcagctgccctgagggacagctcctggatgaaggc1020ctctgcgtggagagcaccgagtgtccctgcgtgcattccggaaagcgctaccctcccggc1080acctccctctctcgagactgcaacacctgcatttgccgaaacagccagtggatctgcagc1140aatgaagaatgtccaggggagtgccttgtcacaggtcaatcacacttcaagagctttgac1200aacagatacttcaccttcagtgggatctgccagtacctgctggcccgggattgccaggac1260cactccttctccattgtcattgagactgtccagtgtgctgatgaccgcgacgctgtgtgc1320acccgctccgtcaccgtccggctgcctggcctgcacaacagccttgtgaaactgaagcat1380ggggcaggagttgccatggatggccaggacgtccagctccccctcctgaaaggtgacctc1440cgcatccagcatacagtgacggcctccgtgcgcctcagctacggggaggacctgcagatg1500gactgggatggccgcgggaggctgctggtgaagctgtcccccgtctatgccgggaagacc1560tgcggcctgtgtgggaattacaatggcaaccagggcgacgacttccttaccccctctggg1620ctggcggagccccgggtggaggacttcgggaacgcctggaagctgcacggggactgccag1680gacctgcagaagcagcacagcgatccctgcgccctcaacccgcgcatgaccaggttctcc1740gaggaggcgtgcgcggtcctgacgtcccccacattcgaggcctgccatcgtgccgtcagc1800ccgctgccctacctgcggaactgccgctacgacgtgtgctcctgctcggacggccgcgag1860tgcctgtgcggcgccctggccagctatgccgcggcctgcgcggggagaggcgtgcgcgtc1920gcgtggcgcgagccaggccgctgtgagctgaactgcccgaaaggccaggtgtacctgcag1980tgcgggaccccctgcaacctgacctgccgctctctctcttacccggatgaggaatgcaat2040gaggcctgcctggagggctgcttctgccccccagggctctacatggatgagaggggggac2100tgcgtgcccaaggcccagtgcccctgttactatgacggtgagatcttccagccagaagac2160atcttctcagaccatcacaccatgtgctactgtgaggatggcttcatgcactgtaccatg2220agtggagtccccggaagcttgctgcctgacgctgtcctcagcagtcccctgtctcatcgc2280agcaaaaggagcctatcctgtcggccccccatggtcaagctggtgtgtcccgctgacaac2340ctgcgggctgaagggctcgagtgtaccaaaacgtgccagaactatgacctggagtgcatg2400agcatgggctgtgtctctggctgcctctgccccccgggcatggtccggcatgagaacaga2460tgtgtggccctggaaaggtgtccctgcttccatcagggcaaggagtatgcccctggagaa2520acagtgaagattggctgcaacacttgtgtctgtcgggaccggaagtggaactgcacagac2580catgtgtgtgatgccacgtgctccacgatcggcatggcccactacctcaccttcgacggg2640ctcaaatacctgttccccggggagtgccagtacgttctggtgcaggattactgcggcagt2700aaccctgggacctttcggatcctagtggggaataagggatgcagccacccctcagtgaaa2760tgcaagaaacgggtcaccatcctggtggagggaggagagattgagctgtttgacggggag2820gtgaatgtgaagaggcccatgaaggatgagactcactttgaggtggtggagtctggccgg2880tacatcattctgctgctgggcaaagccctctccgtggtctgggaccgccacctgagcatc2940tccgtggtcctgaagcagacataccaggagaaagtgtgtggcctgtgtgggaattttgat3000ggcatccagaacaatgacctcaccagcagcaacctccaagtggaggaagaccctgtggac3060tttgggaactcctggaaagtgagctcgcagtgtgctgacaccagaaaagtgcctctggac3120tcatcccctgccacctgccataacaacatcatgaagcagacgatggtggattcctcctgt3180agaatccttaccagtgacgtcttccaggactgcaacaagctggtggaccccgagccatat3240ctggatgtctgcatttacgacacctgctcctgtgagtccattggggactgcgcctgcttc3300tgcgacaccattgctgcctatgcccacgtgtgtgcccagcatggcaaggtggtgacctgg3360aggacggccacattgtgcccccagagctgcgaggagaggaatctccgggagaacgggtat3420gagtgtgagtggcgctataacagctgtgcacctgcctgtcaagtcacgtgtcagcaccct3480gagccactggcctgccctgtgcagtgtgtggagggctgccatgcccactgccctccaggg3540aaaatcctggatgagcttttgcagacctgcgttgaccctgaagactgtccagtgtgtgag3600gtggctggccggcgttttgcctcaggaaagaaagtcaccttgaatcccagtgaccctgag3660cactgccagatttgccactgtgatgttgtcaacctcacctgtgaagcctgccaggagccg3720ggaggcctggtggtgcctcccacagatgccccggtgagccccaccactctgtatgtggag3780gacatctcggaaccgccgttgcacgatttctactgcagcaggctactggacctggtcttc3840ct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