用于对视网膜神经退行性疾病的局部眼治疗的二肽基肽酶-4抑制剂的制作方法

本发明涉及可能导致部分或完全失明的眼部疾病的医学方法领域。本发明提供了肽家族——二肽基肽酶-4(dpp-4)抑制剂在局部施用于眼部的用途。
背景技术：
：视网膜神经退行性疾病是指以进行性神经元丧失为特征的视网膜病症。糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性、青光眼和色素性视网膜炎被认为是神经退行性变起重要作用的视网膜疾病。可以从schmidt等(“neurodegenerativediseasesoftheretinaandpotentialfortheprotectionandrecovery”，currentneuropharmacology，2008，第6卷，第164-178页)得到对这些疾病、它们的关键部位以及可能的保护方式和导致恢复的方式的深入分析。糖尿病视网膜病变(dr)是糖尿病最常见的并发症，并且仍然是发达国家工作年龄人群失明的主要原因。诸如激光光凝、玻璃体内注射皮质类固醇或抗vegf剂等对dr的现有治疗被指引用于该疾病的极晚期，并且与显著的副作用相关。通常认为dr是视网膜的微循环疾病。然而，有一些数据表明视网膜神经退行性变(retinalneurodegeneration)是dr发病机制中的早期事件，其参与dr中发生的微循环异常，这可以从代表欧洲糖尿病视网膜病变早期治疗联合会(eurocondor)的simó等(“neurodegenerationisanearlyeventindiabeticretinopathy:therapeuticimplications”,br.j.ophthalmol.，2012，第96卷，第1285-1290页)推断。提及用于治疗dr的方法的其他参考文献公开于simór，hernándezc，“novelapproachesfortreatingdiabeticretinopathybasedonrecentpathogenicevidence”,progretineyeres，2015，第48卷，第160-180页；和simór,hernándezc，欧洲糖尿病视网膜病变早期治疗联合会(eurocondor)，“neurodegenerationinthediabeticeye:newinsightsandtherapeuticperspectives”,trendsendocrinolmetab，2014；第25(1)卷，第23-33页。在dr的情况下，神经退行性变(有效神经元的丧失)发生在疾病的早期阶段并且产生功能异常，例如辨色力和对比敏感度的丧失。即使糖尿病持续时间少于两年，即在眼科检查下可以检测到微血管病变之前，这些改变也可以通过糖尿病患者的电生理学研究来检测。此外，延迟多焦点erg(视网膜电图)隐性时间(mferg-it)预测早期微血管异常的发展。此外，视神经视网膜退行性变引发和/或活化几种代谢和信号传导通路，这些通路将参与微血管病变过程以及血液-视网膜屏障的破坏(dr的发病机理中的关键因素)。血液视网膜屏障(brb)破坏(或分解)可通过光学相干断层扫描(oct)评估。与这些病理相关的视网膜神经退行性疾病或神经退行性的早期阶段目前尚未得到治疗，尽管它们可预防晚期病变，例如导致视网膜水肿和视网膜新血管形成的微循环问题。因此，在早期阶段，特别是dr早期，不进行治疗并且进行标准患者随访。另一方面，当这些视网膜神经退行性疾病、特别是dr的早期阶段是治疗目标时，推荐诸如激光光凝术或玻璃体内注射的积极治疗是不可思议的。迄今为止，并不认为使用滴眼液是用于预防或阻止dr的药物施用的良好途径。这是因为通常认为它们不会到达眼后段(即玻璃体和视网膜)，如urttia等“challengesandobstaclesofocularpharmacokineticsanddrugdelivery”，adv.drug.deliv.rev.2006，第58卷，第1131-1135页中所宣称。尽管存在一些证据表明在角膜中施用的化合物可以到达视网膜，但它们代表了孤立的病例并且对应于低分子量的化合物，例如aiello等“targetingintraocularneovascularizationandedema–onedropatatime”,n.eng.jmed，2008，第359卷，第967-969页中所提及。aiello等表明在两种不同的测定中，吡咯烷衍生化合物(命名为tg100572，4-氯-3-(5-甲基-3-{[4-(2-吡咯烷-i-基乙氧基)苯基]氨基}-1,2,4-苯并三嗪-7-基)苯酚))具有作为参与新生血管生成和视网膜水肿的激酶的抑制剂的能力，一旦其以滴眼液的形式施用，能够到达视网膜中的靶标。然而，通过穿过角膜或巩膜到达视网膜是困难且不可预测的，主要是由于该组织的解剖学特性。局部药物施用可用于治疗许多前段疾病，但由于眼睛的独特解剖学、生理学和生物化学屏障，认为将治疗浓度的药物递送至眼后段是低效的。移动流体和溶质穿过细胞层有两种主要途径：跨细胞途径(消耗能量的主动离子转运)和细胞旁途径(主要基于梯度浓度和渗透的被动扩散)。角膜分为3个主要复合层：上皮、基质和内皮。角膜上皮是亲脂性的并且由5至7个细胞层厚的复层鳞状细胞组成。紧接在角膜上皮后面的是胶原鲍曼氏膜。在鲍曼氏膜的后面可见亲水的层状基质。由于它是亲水性的，基质是亲脂性分子的强屏障，但它缺乏紧密连接复合体。与基质相邻的是德斯密氏膜的单细胞层和由角膜最深层(内皮)分泌的细胞外基质。角膜内皮在厚度上是单立方形细胞层，并且是负责允许营养物从房水渗漏到角膜并且将水从无血管角膜输送到前房中的亲脂性区域。因此，所说明的角膜的亲脂-亲水-亲脂特性是任何药物渗透性的挑战的主要原因。此外，药物的亲脂性和亲水性(有时也存在于单一药物中)也带来了额外的挑战。因此，药物很容易透过其中一层，但却被其他层阻碍。在这方面，不仅化合物的分子量是限制要素，而且诸如在每种结构中的疏水性、亲脂性、溶解度等其他特征都是限制因素(参见malhotra等，“permeationthroughcornea”，indianjournalofexperimentalbiology，2001，第39卷，第11-24页)。所有这些参数使得即使是具有低分子量(<180da)的化合物也极难能通过角膜到达眼内部(玻璃体或视网膜)。因此，即使一种药物可以通过，这并不意味着具有相同分子量的另一种药物可以到达眼睛的内部。同样地，巩膜和结膜对药物到达视网膜的渗透性以是非常复杂的并且强烈依赖于药物的许多自然特征。特别是，涉及到这些困难时要提及prausnitz等“permeabilityofcornea,sclera,andconjunctiva:aliteratureanalysisfordrugdeliverytotheeye”,journalofpharmaceuticalsciences，1998,第87(12)卷，第1479-1488页的深入工作。由于所有这些原因，目前没有任何用于对任何视网膜疾病的眼科治疗(局部进入眼内)的市售组合物。dpp-4抑制剂是一类相对较新的口服糖尿病药物，也称为格列汀(gliptin)，其处方用于2型糖尿病患者。它们通过阻断dpp-4的作用而起效，dpp-4是破坏一组称为肠降血糖素(主要是胰高血糖素样肽-1，glp-1)的胃肠激素的酶。肠降血糖素在其被需要时(例如在进食后)有助于刺激胰岛素的产生，并且当其不被需要时(例如在消化期间)减少肝脏产生胰高血糖素。二肽基肽酶-4(dpp-4，或dpp-iv)也称为腺苷脱氨酶复合蛋白2或cd26(分化簇26)，是人的由dpp4基因编码的蛋白质。它是高度保守的肽酶，对在第二个nh2-末端位置处具有脯氨酸或丙氨酸的肽具有高选择性。该基因编码766个氨基酸的ii型跨膜蛋白，其通过位于n末端的单个疏水片段锚定于脂双层，并具有6个氨基酸的短细胞质尾部(参见demeesteri等，“cd26,letitcutorcutitdown”，immunoltoday，1999，第20卷，第367–375页)。cd26的细胞外部分含有糖基化结构域、富含半胱氨酸的结构域和催化结构域。dpp-4优先从在倒数第二位含有脯氨酸或丙氨酸(xaa-pro-或xaa-ala-)的蛋白质和寡肽切割n-末端二肽(参见abbott等，“cloning,expressionandchromosomallocalizationofanovelhumandipeptidylpeptidase(dpp)ivhomolog,dpp8”,eurjbiochem，2000；第267卷，第6140-50页)。dpp-4的底物包括多种神经肽(即p物质)、激素(即glp-1、glp-2、胰岛素生长因子-1、神经肽y、肽yy、生长激素释放激素、促红细胞生成素)和趋化因子(即ip-10、rantes、基质细胞衍生因子-1)(参见kim等，“thenonglycemicactionsofdipeptidylpeptidase-4inhibitors”，biomedresearchinternational，2014卷,文章id368703)。尽管有共同的作用机制，但不同dpp-4抑制剂(di)的药代动力学存在显著的异质性。因此，它们显示出半衰期、生物利用度、新陈代谢和排泄途径的差异。某些dpp-4抑制剂通过竞争性酶抑制(西格列汀和阿格列汀)起作用，而其他dpp-4抑制剂是底物-酶阻断剂(沙格列汀和维格列汀)(参见baetta等，“pharmacologyofdipeptidylpeptidase-4inhibitors:similaritiesanddifferences”,drugs，2011，第71卷，第1441–1467页)。糖尿病是一组以高血糖为特征的慢性疾病。为了预防糖尿病并发症，必须使用降血糖剂来降低高血糖症。任何抗糖尿病药物(例如dpp-4抑制剂)的施用可以改善或减轻dr症状，这是因为疾病的主要原因或起源(特别是血液中的高葡萄糖水平)最终得到改善。在这方面，显示出吉格列汀(dpp-4抑制剂)对糖尿病视网膜病变的积极作用的一篇文献是jung等，“gemigliptin,adipeptidylpeptidase-4inhibitor,inhibitsretinalpericyteinjuryindb/dbmiceandretinalneovascularizationinmice”,biochimicaetbiophysicaacta,molecularbasisofdisease，2015，第1852(12)卷，第2618-2629页。jung等公开了在糖尿病小鼠(db/db)中口服施用的吉格列汀可以改善这些小鼠中的视网膜周细胞凋亡和血管渗漏。然而，目前没有关于这些抑制剂对视网膜的直接的有益效果的数据。在这方面，应进一步注意dpp-4抑制剂不通过血脑屏障。鉴于血脑屏障和brb非常相似，也可以松泛地假设且极有可能的是其不会通过brb。在一定量的dpp-4抑制剂可以通过brb的极少案例中，需要高剂量以便以治疗浓度到达视网膜，因此这会增加全身副作用的可能性。在pct申请wo2014131815中，令人惊讶地发现，尽管它们具有高分子量，某些glp-1激动剂以及glp-1本身的视网膜局部眼部施用可以预防在糖尿病视网膜病变的早期阶段发生的神经退行性过程。在该文献中，发明人还提供了证据证明可以通过这些化合物的局部眼部施用(滴眼剂)来治疗和/或预防其中神经退行性变发挥重要作用的其他视网膜疾病。目前，需要治疗视网膜神经退行性疾病的替代疗法。在dr及其相关的视网膜微血管损伤或损害的特定情况下，需要对背景视网膜病变或非增殖性dr的替代治疗，以及用于保护视神经视网膜免受损伤(导致神经元丧失)。因此，当神经退行性变可能要开始时，需要针对疾病早期阶段的新的药理学治疗。dr和任何其他视网膜神经退行性变的早期治疗将有效减少需要积极治疗的晚期阶段的进展，例如激光光凝、玻璃体内注射皮质类固醇或抗vegf剂、或者外科手术。技术实现要素：本发明的发明人发现ddp-4存在于人视网膜中并在视网膜中高表达，即在患有糖尿病的患者的视网膜色素上皮(rpe)中。已经测试了dpp-4酶的抑制剂(通过竞争性酶抑制作用的如西格列汀，或作为底物-酶阻断剂的如沙格列汀)，并且出乎意料的是，尽管它们的分子量和结构的复杂性，它们在局部施用于眼睛时(在角膜或结膜穹窿或巩膜中，即眼部施用于眼表面)到达视网膜。这些抑制剂甚至能够保护和防止视网膜变性和血管渗漏。这些化合物充当视网膜(特别是视神经视网膜，其是视网膜的一部分，包括神经元但没有视网膜色素上皮)的神经保护剂。应该强调的是，根据本发明的抑制剂的局部施用不仅到达视网膜，而且还通过预防brb破坏和通过预防或治疗与dr相关的微血管损伤达到消除dr早期进展的有效浓度。这种损伤主要通过蛋白质视网膜血管渗漏来检测。因此，在第一方面，本发明涉及dpp-4抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其用于局部眼部治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病。由于这些抑制剂在局部施用于眼(即，眼部药物施用)时可以到达视网膜的令人惊讶和出乎预料的事实，局部眼部治疗和/或预防是如此施用于眼表面(即角膜、巩膜或结膜穹窿)的治疗和/或预防。这适用于本发明中公开的任何实施方式和实施方式的组合。考虑到现有技术，出乎意料的是，具有疏水性(亲脂性)和亲水性部分的高分子量分子和化学复合物一旦在角膜表面、巩膜或结膜中局部施用就能到达视网膜。如上文所披露，对于施用于角膜、巩膜或结膜穹窿并其后能够到达视网膜的化合物，必须克服几种具有不同亲脂性和亲水性的屏障。因此，本发明提出了对本领域的以下实际贡献：证明dpp-iv抑制剂(常用的抗糖尿病药物)也可以局部施用于眼上以促进预防糖尿病中某些更致残的伴生疾病；视网膜神经退行性疾病，尤其包括糖尿病视网膜病变。因此，通过提供dpp-4抑制剂也解决了眼科学领域中长期以来的需要，所述dpp-4抑制剂通过局部眼部施用或作为局部组合物的成分(因此为局部眼用组合物)可以到达视网膜并在其中发挥神经保护效果。此外，这些抑制剂的局部施用将其作用限制于眼并使相关的全身副作用最小化。本发明的这一方面还可以明确表达为二肽基肽酶-4抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备药物中的用途，所述药物用于因所述抑制剂的神经保护效果而对视网膜神经退行性疾病进行局部眼部治疗和/或预防，特别是对视网膜神经退行性疾病及其相关的视网膜微血管损害或损伤的早期阶段(特别是dr的早期阶段)的视网膜损伤进行局部眼部治疗和/或预防。本发明还涉及局部眼部治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病的方法，特别是针对视网膜神经退行性疾病早期的神经保护，特别是dr及其相关的视网膜微血管损害或损伤的早期阶段，所述方法包括在有需要的受试者(包括人)中施用(意指在眼中局部施用)二肽基肽酶-4抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及局部药学或兽医学上可接受的赋形剂和/或载体。此外，本发明的发明人证明，通过抑制视网膜dpp-4从而通过位于视网膜中的该酶直接起作用，可以将视网膜神经退行性疾病、特别是视网膜神经退行性疾病及其相关的视网膜微血管损害或损伤的早期阶段不是作为降低血糖水平的次生效果而是出于对视网膜酶的直接作用来进行治疗。因此，本发明还涉及dpp-4抑制剂或其药学或兽医学上可接受的盐，其用于治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病；特别是用于局部眼部治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病及其相关的视网膜微血管损害或损伤的早期阶段的视网膜损伤。本发明的另一方面是用于局部眼部治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病的药学或兽医局部眼用组合物，其包含有效量的二肽基肽酶-4抑制剂或者其药学或兽医学上可接受的盐或溶剂化物及其混合物以及局部药学或兽医学上可接受的赋形剂和/或载体。最后一个方面是药学或兽医学局部组合物，其包含治疗有效量的dpp-4抑制剂或者其药学或兽医学上可接受的盐以及局部药学或兽医学上可接受的赋形剂和/或载体，其中所述组合物在20℃的动态粘度为5.0×10-4pa.s～300pa.s，ph值为4.5～9.0，并且其中相对于组合物的终体积的二肽基肽酶-4抑制剂的浓度为5mg/ml～200mg/ml。附图说明图1是显示肠、肝脏和人视网膜(rpe和视神经视网膜)中dpp-4浓度(ng/ml)的条形图。白条：非糖尿病供体。黑条：糖尿病供体。*p<0.05。图2是视网膜层中tunel阳性细胞百分比的图。在全部视网膜层(外核层；onl，内核层；inl和神经节细胞层；gcl)中，用空载剂(d-sham)处理的db/db小鼠与其他组(d-saxa和对照)相比，用于显示细胞凋亡的末端转移dutp缺口端标记(tunel)阳性细胞的百分比显著更高(p<0.001)。n＝10只小鼠/组(每个视网膜最少10个切片)。saxa：沙格列汀。图3是研究组中谷氨酸视网膜浓度(μmol/g蛋白质)的条形图。与其他组相比，*p<0.05。saxa：沙格列汀。图4是以任意单位(a.u.)定量glast免疫荧光的条形图。n＝10只小鼠/组。结果是平均值±sd。用载体(d-sham)和其他组(d-沙格列汀和对照(db/+))处理的db/db之间的*p<0.05。图5描绘在代表性非糖尿病小鼠(c(db/+))、用空载剂(d-sham)处理的db/db小鼠、用沙格列汀(d-沙格列汀)处理的db/db小鼠中，响应于3200坎德拉(cd)s/m2(图a)和12800坎德拉(cd)s/m2(图b)的刺激强度的视网膜电图(erg)轨迹。a表示振幅，以微伏(μv)为单位测量；t表示以毫秒(ms)为单位的时间。图6(a)显示用激光扫描共聚焦显微镜可视化的血清白蛋白结合的伊文思蓝的血管渗漏。伊文思蓝-白蛋白复合物渗漏的数量和程度经可视化并在d-sham中用箭头指示。在下方图6(b)中，用fluoviewfv1000激光扫描显微镜对数字图像的白蛋白免疫荧光的定量以任意单位(a.u.)显示。结果是平均值±sd。用空载剂(d-sham)和其他组：d-沙格列汀和c(db/+)处理的db/db之间的*p<0.05。图7(与实施例3相关)显示在全部视网膜层中，用空载剂(d-sham)处理的db/db小鼠与其他组(d-西格列汀和对照(db/+))相比的tunel阳性细胞的百分比(*p<0.01)。onl：外核层；inl：内核层；gcl：神经节细胞层。n＝10只小鼠/组(每个视网膜最少10个切片)。图8是研究组中谷氨酸视网膜浓度(μmol/g蛋白质)的条形图。与其他组相比，*p<0.05。sita：西格列汀。图9(a)显示用激光扫描共聚焦显微镜可视化的血清白蛋白结合伊文思蓝的血管渗漏。伊文思蓝白蛋白复合物渗漏的数量和程度经可视化并在d-sham中用箭头指示。在下图中，如图9(b)所示，用fluoviewfv1000激光扫描显微镜对数字图像的白蛋白免疫荧光的定量以任意单位(a.u.)显示。结果是平均值±sd。用空载剂(d-sham)和其他组d-西格列汀和c(db/+)处理的db/db之间的*p<0.05。具体实施方式为了便于理解，包括了以下定义。在本发明的意义上，术语“神经保护”是指可以使用于构成视神经视网膜的神经元仍然得以保持并且处于对应于健康受试动物(包括人类)的生理状态的任何种类的治疗或预防方法。“视神经视网膜(neuroretina)”是视网膜的包括神经元而没有视网膜色素上皮细胞的部分。视神经视网膜负责视觉循环。表述“糖尿病视网膜病变早期阶段的神经保护”涉及在dr的晚期阶段确立之前进行的任何治疗或预防方法。对于“糖尿病视网膜病变的早期阶段”，应理解为由于存在糖尿病而在眼中可检测到功能异常(即辨色力、对比敏感度和视网膜电图异常)但尚未完全建立dr的微血管变化模式(即无法观察到非增殖性dr的典型病变)的时期。对于“与糖尿病视网膜病变相关的视网膜微血管损害或损伤”，应理解为包括视网膜微血管异常，如全身性和局灶性小动脉狭窄，以及反映由于糖尿病视网膜病变(在疾病的早期或晚期阶段)引起的累积性血管损伤的动静脉缺口。这种视网膜微血管损害或损伤主要通过视网膜血管渗漏的存在来检测，从而允许从视网膜血管内的血液到不同的视网膜层检测蛋白质(例如白蛋白外渗)。本文所用的表述“治疗有效量”是指当施用时，化合物的量足以预防或一定程度地缓解所处理的疾病的一种或多种症状。根据本发明施用的化合物的具体剂量当然将由围绕病例的特定情况确定，包括施用的化合物、施用途径、所治疗的具体病症和类似的考虑事项。如本文所用的术语“药学上或兽医学上可接受”涉及在合理的医学和兽医学判断的范围内适合用于与受试者(例如，人或任何其他动物)组织接触而没有明显的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型，其与合理的利益/风险比相称。在与药物组合物的其他成分相容的意义上，每种载剂、赋形剂等也必须是“可接受的”。它还必须适合用于与人和动物的组织或器官接触而没有过多的毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。合适的载剂、赋形剂等可以在标准药学文献中找到，并且举例而言包括防腐剂、凝集剂、保湿剂、润滑剂和抗氧化剂。如上所述，本发明的发明人提出了一种治疗视网膜神经退行性疾病(神经退行性发挥重要作用的视网膜疾病)的新治疗方法，除了非侵袭性外，在治疗这些疾病的早期阶段是有用的，并且特别是在通过视网膜血管渗漏检测到的dr和相关dr视网膜微血管损伤的早期阶段的治疗中。在本发明第一方面的具体实施方式中，dpp-4抑制剂用于抑制视网膜二肽基肽酶-4。换言之，由于对视网膜中dpp-4酶的直接抑制，发生了眼内的局部治疗。在另一个具体的实施方式中，dpp-4抑制剂选自下组：西格列汀、沙格列汀、维格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、替格列汀、阿格列汀、曲格列汀、吉格列汀、奥格列汀、它们药学上可接受的盐或溶剂化物，以及其混合物。在本发明第一方面的具体实施方式中，如上所述使用的dpp-4抑制剂是dpp-4竞争性酶抑制剂，并且其选自下组：西格列汀、利格列汀、阿格列汀、它们药学上可接受的盐或溶剂化物及其混合物。在本发明第一方面的另一具体实施方式中，用于局部眼部治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病的dpp-4抑制剂是dpp-4底物-酶阻断剂，并且其选自下组：沙格列汀、维格列汀、阿拉格列汀的化合物，它们药学上可接受的盐或溶剂化物及其混合物。在更具体的实施方式中，dpp-4抑制剂是沙格列汀(saxagliptin)。在另一个更具体的实施方式中，dpp-4抑制剂是西格列汀(sitagliptin)。在此列出所有这些特定化合物的化学式。根据其结构式，dpp-4抑制剂可以按相似的官能团或分子的相似部分进行分组：其他可用的dpp-4抑制剂是度格列汀(及其酒石酸盐)和羽扇豆醇。在具体实施方式中，本发明的用于局部眼部治疗和/或预防的dpp-4抑制剂用于治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病，所述疾病选自dr、年龄相关性黄斑变性、青光眼和色素性视网膜炎。在优选实施方式中，dpp-4抑制剂用于治疗和/或预防糖尿病视网膜病变并与dr视网膜微血管损伤有关。这意味着可以通过局部眼部施用dpp-4抑制剂来治疗dr中发生的视网膜微血管损害或损伤，其通常通过视网膜层中蛋白质的视网膜血管渗漏来检测。此外，在另一个优选的实施方式中，dpp-4抑制剂用于局部眼部治疗和/或预防dr的早期阶段。特别是，在dr尚未得以建立的这些早期阶段，局部施用的本发明的抑制剂作为视神经视网膜的神经保护剂，从而发挥神经保护作用，如下文实施例中所示。神经元得以维持而免受损伤和功能丧失，并且它们保持在健康生理状态。同样的推理也适用于其他视网膜神经退行性疾病。实际上，肽由于其神经保护特性而可得以使用。接下来给出糖尿病视网膜病变发展的简述。由高血糖引起的代谢途径和高血糖本身导致dr，但在眼科检查可以诊断出dr之前需要至少五年的时间。可以看到的第一个阶段是背景视网膜病变或非增殖性糖尿病视网膜病变(npdr)(由微动脉瘤、微出血和硬性渗出物构成)。在这个阶段，没有特定的治疗，而是对糖尿病受试者标准随访。从这个阶段开始，疾病的自然发展史可以遵循不互斥的两个方向。其中一个方向是临床上发展出显著的糖尿病性黄斑水肿(dmo)，其中最重要的致病因素是血液视网膜屏障(brb)的破坏。该途径在2型糖尿病患者中更常见。另一个方向是增殖性糖尿病视网膜病变(pdr)，这在1型糖尿病中更常见。在后一种情境中，毛细血管闭塞起着关键作用，其在血管生成因子和抗血管生成因子之间产生不平衡，这最终刺激新血管形成(pdr的标志)。然而，即使在眼科检查中检测到npdr之前，也确实存在视网膜神经退行性变和血管渗漏。当确立dmo和pdr时，进行积极的治疗。这些治疗包括光凝(pgc)、玻璃体内注射皮质类固醇和/或抗血管内皮生长因子试剂(ivtr)和玻璃体切除术(vtr)。采用本发明的用于局部眼部治疗和/或预防dr的ddp-4抑制剂，如果受试者在疾病的早期阶段(可以检测到功能异常(即辨色力、对比敏感度和视网膜电图异常)和血管渗漏时)接受有助于视网膜神经保护的化合物，可以避免一部分这种积极治疗。因此，如果保护视网膜免受慢性血糖水平的影响，可以最大限度地减少主要并发症，甚至其不会出现，而使糖尿病患者生活质量真正改善。上面公开的dpp-4抑制剂对眼睛的局部施用表现出真正的优点，避免了进一步的积极治疗。通过几次眼科检查检测到的视网膜神经退行性变的保护代表了良好的在血管异常发展之前治疗dr的方法。在dr的早期阶段存在神经退行性变(其可以通过辨色力和对比敏感度两者的损失、胶质细胞活化和神经细胞凋亡来检测)。本发明的用于局部施用(对眼的局部施用)的dpp-4抑制剂在这些早期阶段中是有用的，在所述早期阶段不指示治疗而仅推荐随访直至确立了dr的更晚期阶段(临床上显著的糖尿病性黄斑水肿和/或增殖性糖尿病视网膜病变)。dr早期阶段治疗具有避免进一步并发症(即微动脉瘤、微出血、硬性渗出物、毛细血管闭塞和新血管形成)的真正优点。在另一个实施方式中，根据本发明使用的dpp-4抑制剂是药学或兽医学局部眼用组合物的成分(组分)，所述组合物包含至少一种如上定义的dpp-4抑制剂和任何药学或兽医学上局部可接受的载体和/或赋形剂。如上所述，本发明的另一个目的是用于局部眼部治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病的药学或兽医学上的局部组合物，其包含有效量的二肽基肽酶-4抑制剂，或其药学上或兽医学上可接受的盐或溶剂化物及其混合物，以及局部药学或兽医学上可接受的赋形剂和/或载体。在本发明第二方面的具体实施方式中，药学或兽医学上的局部眼用组合物用于局部眼部治疗和/或预防视网膜神经退行性疾病，其包含至少一种选自下组的dpp-4抑制剂：西格列汀、沙格列汀、维格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、替格列汀、阿格列汀、曲格列汀、吉格列汀、奥格列汀。特定的载体和/或赋形剂涉及水、盐水缓冲液、以及油包水或水包油型的混合物。具体的赋形剂选自防腐剂、凝集剂、保湿剂、润肤剂和抗氧化剂。在本发明第二方面的具体实施方式中，如上所述使用的药学或兽医学局部眼用组合物还包含选自下组的化合物：哺乳动物glp-1、特别是人glp-1(uniprot：p01275)，利拉鲁肽、艾塞那肽、利西拉肽、他们的盐及它们的混合物。glp-1(胰高血糖素样肽-1)是内源性促胰岛素肽，其响应于食物而从胃肠道的l细胞分泌(“肠降血糖素响应”)。glp-1通过其受体(glp-1r)发挥作用，对葡萄糖依赖性胰岛素分泌、胰岛素基因表达、胰岛β细胞新生、胃肠动力、能量稳态和食物摄入具有显著影响。glp-1受体(glp-1r)是具有七个跨膜部的异源三聚体g蛋白偶联受体(gpcr)的肽激素结合类b1(分泌素样受体)家族的成员。glp-1r具有广泛的分布，它们存在于胰腺、脂肪组织、肌肉、心脏、胃肠道和肝脏中。此外，glp-1r遍布整个中枢神经系统(即下丘脑、纹状体、脑干、黑质和脑室下区)，并且有证据表明glp-1对glp-1r的刺激对中枢和外周神经系统均产生神经保护作用。人glp-1是源自前胰高血糖素原的37个氨基酸残基的肽，其在回肠末端、胰腺和大脑的l细胞中i.a.合成。人前胰高血糖素原以uniprot数据库登录号p01275识别(2007年2月6日；第3版)。对前胰高血糖素原的加工而产生glp-1(7-36)酰胺、glp-1(7-37)和glp-2主要发生在l细胞中。使用简单的系统来描述该肽的片段和类似物。因此，例如，gly8-glp-1(7-37)表示在形式上通过缺失第1至6号氨基酸残基并用gly取代第8位的天然存在的氨基酸残基(ala)而由glp-1衍生的glp-1片段(类似物)。类似地，lys34(nε-十四烷酰基)-glp-1(7-37)表示其中第34位的lys残基的ε-氨基被十四烷酰化的glp-1(7-37)。glp-1的具体类似物包括利拉鲁肽(也称为arg34lys26(nε–(γ-谷氨酰(nα–十六烷酰基)))-glp-1(7-37))并且cas号为204656-20-2(seqidno:1)。利西拉肽是另一个glp-1类似物(即，glp-1激动剂)，其氨基酸序列为hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgappskkkkkxaa1，其中，xaa1是其中-cooh末端被-nh2基团修饰(酰胺化)的赖氨酸残基(在本说明书中也公开为seqidno:2)。cas号是827033-10-3。艾塞那肽是cas号为141732-76-5的化合物。它是具有氨基酸序列hgegtftsdlskqmeeeavrlfiewlknggpssgapppxaa1的肽，其中，xaa1是其中末端-cooh被-nh2基团修饰(酰胺化)的丝氨酸残基(在本说明书中也公开为seqidno:3)。优选的药学或兽医学局部眼用组合物选自下组：溶液(例如滴眼剂)、乳膏、洗剂、软膏、乳剂、气溶胶和非气溶胶喷雾、凝胶、软膏和悬浮液。如上所述，药学或兽医学局部眼用组合物应理解为适用于角膜、巩膜或结膜穹窿的局部眼用组合物。这些药学或兽医学局部眼用组合物还涉及固体或半固体基质或载体，特别是用于递送包含在基质中的dpp-4抑制剂的生物侵蚀性和/或生物降解性的聚合物基质。此外，本发明的组合物可以含有其他成分，例如香料、着色剂和现有技术中已知的用于局部眼用制剂的其他组分。可以根据现有技术中公知的方法制备本发明的局部眼用组合物。本领域技术人员可根据所制备的制剂类型容易地确定合适的赋形剂和/或载体(以及任何ph缓冲剂)及其量。具体保湿剂(也称为保湿溶剂)的实例选自下组：聚乙二醇(peg，通式为h(och2ch2)noh；其中，n是聚合物中氧亚乙基基团的平均值)、丙二醇、甘油及其混合物。在本发明的背景下，保湿剂是具有溶剂和保湿剂性质的化合物。不同分子量的peg广泛用于药物组合物(局部、肠胃外、眼部、口服和直肠组合物)中。在根据本发明使用的局部眼用组合物中使用的合适的peg的分子量为300g/mol～35000g/mol，更具体为600g/mol～20000g/mol，更具体为1000g/mol～8000g/mol，更具体为3000g/mol～6000g/mol，并且优选约4000g/mol。在根据本发明使用的组合物的具体实施方式中，相对于组合物的总体积，保湿剂的重量/体积含量为1％～49％。更具体为5％～40％，更具体为10％～30％，更具体为15％～25％。用作ph缓冲液的赋形剂是允许ph为4.5～9.0，更具体为4.5～8.5，更具体为6.0～8.2，并且优选为7.0～8.1，更优选为7.5～8.0的那些缓冲液。ph缓冲液的实例包括柠檬酸盐(柠檬酸/柠檬酸盐缓冲剂)、磷酸盐(磷酸盐/磷酸盐缓冲剂)、硼酸盐(硼酸/硼酸盐缓冲剂)及其混合物，所有盐都是药学上可接受的盐。ph缓冲液可另外包含氨基酸(特别是精氨酸、赖氨酸)和选自甲基葡糖胺和氨丁三醇的胺衍生化合物，及其混合物。更适合于亲脂性组合物的赋形剂和/或载体(其意指在15℃～35℃与水不混溶的组合物)包括合成或半合成亲脂性赋形剂，其包含可可脂、植物氢化油和固体半合成甘油酯。在具体实施方式中的本发明的局部眼用(眼科)组合物中的其他组分包括张力活性剂(tensoactive)、溶剂(有机和无机溶剂；即，水)、粘度剂、防腐剂、凝集剂、润滑剂和抗氧化剂、等张和/或等渗剂、粘膜粘附聚合物、增强活性成分吸收的试剂(即：dpp-4抑制剂)。在张力活性剂中，具体使用的是甘油酯、聚山梨醇酯、十二烷基硫酸钠、磷脂(如磷脂酰胆碱或磷脂酰甘油)、聚氧乙烯脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯(可选地，经聚氧乙烯取代)，及它们的混合物。在有机溶剂中，具体用于组合物的是蓖麻油、peg、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、甘油、具有c6-c10碳原子的脂肪酸的甘油三酯，以及它们的混合物。粘度剂具体是聚乙烯醇、衍生自纤维素的化合物(如甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素)、卡波姆、peg及它们的混合物。防腐剂具体是硼酸、苯扎氯铵、苯甲酸、c1-c4烷基链的对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯甲醇，以及它们的混合物。等张和/或等渗剂具体是氯化钠、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、氨基酸及它们的混合物。增强活性成分吸收的试剂包括皂苷、脂肪酸、吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、哌维酸及它们的混合物。粘膜粘附聚合物(常用作凝胶化剂)具体是透明质酸、聚半乳糖醛酸、聚丙烯酸、硫酸软骨素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶、甲基纤维素、chantan胶、羧甲基纤维素钠、壳聚糖、卡波姆、结冷胶、果胶、藻酸盐、卡拉胶及它们的混合物。乳液和微乳液基质具体是甘油的脂肪酸酯、聚氧乙烯醇、蓖麻油、具有c6-c10碳原子脂肪酸的甘油三酯及它们的混合物。乳膏和软膏基质具体是凡士林、石蜡、peg、硅氧烷和混合物在优选实施方式中，可选地结合上文或下文的任何实施方式，本发明的局部眼用组合物是滴眼剂形式的溶液，也称为滴眼液。以滴眼剂形式施用肽暗含易于被有需要的受试者使用且不会令人不适的巨大优点。在可选地结合上文或下文的任何实施方式的具体实施方式中，根据本发明使用的组合物是持续释放组合物。换言之，将组合物配制成持续释放递送系统，允许以预定速率递送活性成分(即：dpp-4抑制剂)，以便在特定时间段内保持恒定的药物浓度，同时具有最小的副作用。用于持续释放递送的具体制剂包含包封dpp-4抑制剂的纳米颗粒和微粒、脂质体和类脂质体(niosome)，它们全部包含选自下组的化合物：聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚苯乙烯、壳聚糖、白蛋白、凝集素、明胶、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯、聚己内酯、聚丙烯酰胺、葡聚糖、琼脂糖、脱水山梨糖醇、胆固醇及它们的混合物。用于持续释放递送的其他具体制剂包含与构成水凝胶的dpp-4抑制剂缀合的聚合物。在第二方面的可选地与上文或下文的任何实施方式结合的另一个具体实施方式中，所有这些药学或兽医学局部眼用组合物用于局部眼部治疗和/或预防选自下组的视网膜神经退行性疾病：糖尿病视网膜病变(dr)、年龄相关性黄斑变性、青光眼和色素性视网膜炎。特别是，它们用于预防和/或治疗糖尿病视网膜病变及其相关的微血管损害或损伤。更特别是，它们用于糖尿病视网膜病的早期阶段的局部眼部治疗。如所指出，本发明的另一方面是药学或兽医学局部组合物，其包含治疗有效量的dpp-4抑制剂或其药学或兽医学上可接受的盐，以及局部药学或兽医学上可接受的赋形剂和/或载体，其中组合物的动态粘度为5.0×10-4pa.s～300pa.s，ph为4.5～9.0，并且其中相对于组合物的终体积，二肽基肽酶-4抑制剂的浓度为5mg/ml～200mg/ml。更特别是，药学或兽医学局部组合物包含治疗有效量的dpp-4抑制剂，或其药学或兽医学上可接受的盐，以及局部药学或兽医学上可接受的赋形剂和/或载体，其中所述组合物在20℃的动态粘度为5.0×10-4pa.s～300pa.s，ph为4.5～9.0，并且其中相对于组合物的终体积，二肽基肽酶-4抑制剂的浓度为20mg/ml～200mg/ml。实际上，本发明的药学或兽医学局部眼用组合物是液体组合物或半固体组合物，其具有乳膏或软膏的稠度。当在本说明书中指出组合物具有在一定范围内的特定粘度时，其涉及动态粘度。因此，本发明的药学或兽医学上局部组合物在室温(即20±0.1℃)和正常大气压下的动态粘度为5.0×10-4pa.s～300pa.s。在此第三方面的具体实施方式中，药学或兽医学局部组合物的动态粘度8.9×10-4pa.s～100pa.s。根据欧洲药典(第8版，2.2.8“粘度”)，动态粘度或粘度系数η是每单位表面的切向力，称为剪切应力t并以帕斯卡表示，是平行于滑动平面移动所必需的，一层1平方米的液体，相对于距离(x)为1米的平行层，速率(v)为1米/秒。比率dv/dx是速度梯度，给出以秒的倒数(s-1)表示的剪切速率d，因此η＝t/d。动态粘度的单位是帕斯卡秒(pa.s)。之前提到的所有赋形剂和/或载体和缓冲剂适用于该另一方面。特别是，这些具有特定粘度的局部组合物是溶液(例如滴眼剂)、乳膏、洗剂(例如眼用洗剂)、软膏剂、乳剂、气溶胶和非气溶胶喷雾剂、凝胶、软膏和悬浮液的形式。所有这些都可以应用到眼表面(角膜、结膜、巩膜)，并允许dpp-4抑制剂释放到达视网膜。具体的组合物是滴眼剂、眼用洗剂、半固体眼用制剂(即软膏、乳膏或凝胶)。某些眼部溶液末端洗液可以在施用时由滴眼剂粉末和用于眼部洗液的粉末制备，所述粉末以干燥无菌形式提供以便溶解或悬浮在合适的液体载剂中。更具体地，如前所述，dpp-4抑制剂选自下组：西格列汀、沙格列汀、维格列汀、利格列汀、阿拉格列汀、替格列汀、阿格列汀、曲格列汀、吉格列汀、奥格列汀和它们的混合物，以及局部药学或兽医学上可接受的赋形剂和/或载体。在本发明的药学或兽医学局部眼用组合物的另一个具体的实施方式中，ph为5.5～7.5，更具体为7.0。在本发明的药学或兽医学局部眼用组合物的另一个具体的实施方式中，相对于组合物的终体积，dpp-4抑制剂的浓度为50mg/ml～150mg/ml。更具体的是，浓度为50mg/ml～150mg/ml。更具体的是，如果抑制剂是沙格列汀，相对于组合物的终体积，其浓度为80mg/ml～120mg/ml。更具体的是，相对于组合物的终体积，浓度为80mg/ml～100mg/ml。特别是，相对于组合物的终体积，其为100mg/ml。更具体的是，如果抑制剂是西格列汀，相对于组合物的终体积，其浓度为50mg/ml～120mg/ml。更具体的是，相对于组合物的终体积，浓度为50mg/ml～80mg/ml。特别是，相对于组合物的终体积，其为50mg/ml。在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和该词语的变体并不旨在排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，“包括”一词涵盖了“由......组成”的情况。通过阅读说明书或者可以通过实践本发明来学习，本发明的其他目的、优点和特征对于本领域技术人员而言将变得显而易见。通过举例说明的方式提供以下实施例和附图，并且它们不旨在限制本发明。此外，本发明涵盖本文所述的特定和优选实施方式的所有可能组合。实施例实施例1.dpp-4浓度在人糖尿病视网膜中升高在来自糖尿病和非糖尿病供体的人视网膜中测定dpp-4的表达。视网膜来自发明人中心(bancdesangiteixitshospitaluniversitarivalld’hebron)的组织银行。该研究包括与年龄和性别匹配的总共8个糖尿病供体和8个非糖尿病供体。采集一个眼杯以分离视神经视网膜与视网膜色素上皮细胞(rpe)，并立即用液氮冷冻两种组织并储存在-80℃。来自该眼杯的组织用于基因表达和蛋白质测量的研究。再采集另一眼杯，并将rpe和视神经视网膜浸泡在石蜡中并用于进行免疫组化研究。从死亡到眼球摘除的时间为3.7±1.5小时。眼杯捐赠和处理这种生物材料的程序受到发明人中心的组织银行的捐赠协议的严格监管，并得到了伦理委员会的批准。-rna提取和定量rt-pcr：使用试剂(invitrogen，madrid，西班牙)提取总rna。然后，用dna酶(qiagen，madrid，西班牙)处理rna样品以除去基因组污染物，并在rneasyminelute柱(qiagen，madrid，西班牙)上纯化。在nanodrop分光光度计上测量rna量，并在agilent2100生物分析仪上测定完整性。使用高容量试剂盒(appliedbiosystems，madrid，西班牙)用随机六聚体引物进行逆转录。使用dpp-4的引物进行实时pcr。-dpp-4蛋白测量：通过定量夹心酶免疫测定法(r&dsystems，minneapolis，mn)在视网膜提取物(rpe和视神经视网膜)中评估dpp-4浓度，检测下限为0.016ng/ml。-免疫组化将人供体的视网膜切片(8名非糖尿病和8名糖尿病供体)在二甲苯中脱石蜡并在分级乙醇中再水合。为了消除自发荧光，将载玻片在高锰酸钾中洗涤。然后，将切片在pbs中的2％bsa0.05％tween中温育1小时以阻断非特异性。将第一抗体在4℃在相同的阻断缓冲液(1:500；abcam，cambridge，uk)中温育过夜。然后，洗涤切片并在室温与alexa488(molecularprobes，eugene，or)一起温育1小时。用一滴含有dapi的封固剂对载玻片覆盖，以观察细胞核(vectorlaboratories，burlingame，ca)。使用488nm和405nm激光线使用共聚焦激光扫描显微镜(fv1000，olympus，hamburg，德国)以40x获取图像，并且以1024×1024像素的分辨率保存每个图像。-结果：dpp-4在人视网膜中表达。与非糖尿病供体相比，在来自糖尿病供体的rpe中检测到dpp-4mrna的更高表达(5.69±1.77比对照1.4±1.38，p<0.05)。在视神经视网膜中，没有观察到两组之间的显著差异。与非糖尿病供体相比，来自糖尿病供体的rpe中dpp-4浓度显著更高(p<0.05)。有这些数据在图1中描绘，其中ddp-4(ng/ml)的水平在肠(参照)、肝脏(参照)、rpe和视神经视网膜中显示。白色条形：非糖尿病供体。黑色条形：糖尿病供体。在视神经视网膜中，没有观察到两组之间的显著差异。免疫组化分析显示dpp-4沿整个视网膜弥漫分布。实施例2.以滴眼剂施用沙格列汀预防糖尿病引起的视网膜神经退行性变在db/db小鼠模型中测试含有沙格列汀的滴眼剂的神经保护作用。据报道，db/db小鼠再现了人糖尿病眼中发生的神经退行性过程的特征。因此，它是用于测试神经保护药物的合适模型(根据bogdanov等，“thedb/dbmouse:ausefulmodelforthestudyofdiabeticretinalneurodegeneration”,plosone，2014，第9(5)卷:e97302)。从harlanlaboratories,inc.购买总共20只10周龄的雄性db/db(bks.cg-+leprdb/+leprdb/olahsd)小鼠。此外，10只年龄匹配的非糖尿病(db/+)小鼠用作对照组。使用注射器将沙格列汀或空载剂滴眼剂直接施用于每只眼睛的上角膜表面。每只眼睛施用一滴(5μl)沙格列汀(1μm)或每只眼睛施用空载剂(5μl0.9％氯化钠)，每天两次，持续14天。在第15天，在尸检前约1小时向动物的眼睛滴注一滴沙格列汀或空载剂。该研究得到vhir动物护理和使用委员会(valld'hebronresearchinstitute)的批准。所有实验均遵循欧共体(86/609/cee)和arvo(视觉和眼科研究协会)的原则进行。使用ganzfelderg平台(phoenixresearchlaboratories，pleasanton，ca)依照iscev(国际视觉临床电生理学会)推荐测量全视野视网膜电图(erg)记录(根据marmor等，“standardforclinicalelectroretinography.”，internationalsocietyforclinicalelectrophysiologyofvision(2004),docophthalmol，2004；第108卷，第107-114页)。-神经退行性变测量：(a)胶质细胞活化的测量使用针对gfap(胶质原纤维酸性蛋白)的特异性抗体通过激光扫描共聚焦显微镜评估胶质细胞活化。将切片在酸性甲醇(-20℃)中固定2分钟，然后用pbs洗涤三次，每次5分钟。将切片用tbs-tritonx-1000.025％透化，并在封闭剂(pbs中的1％bsa和10％山羊血清)中在室温温育2小时。然后将切片与兔抗-gfap(abcamltd，cambridge，英国)(在封闭溶液中制备的1:500稀释液)在4℃在潮湿气氛中温育过夜。在pbs中洗涤三次每次5分钟后，将切片与二抗alexa488山羊抗兔(invitrogen)(在封闭溶液中制备的1:200稀释液)一起温育。将切片在pbs中洗涤三次，用hoestch复染并用mountingmediumfluorescence(prolong，invitrogen)固定并用盖玻片固定。使用相同的亮度和对比度设置，使用fluoviewfv1000激光扫描共聚焦显微镜olympus记录来自样品的比较数字图像。为了评估神经胶质活化的程度，使用基于先前描述的gfap染色程度的评分系统(anderson等，“glialandendothelialblood-retinalbarrierresponsestoamyloid-betaintheneuralretinaoftherat”,clinophthalmol，2008，第2卷，第801-816页)。该评分系统如下：müller细胞终足区域/仅gcl(得分1)；müller细胞终足区域/gcl加上一些近端进程(得分2)；müller细胞终足加上很多进程，但没有扩展到onl(得分3)；müller细胞终足加上onl中的某些进程(得分4)；müller细胞终足加上从gcl到onl外边缘的许多暗过程(得分5)。(b)细胞凋亡评估的免疫组化分析使用deadendfluorometrictunelsystem试剂盒(promega，madison，wi，美国)进行tunel(末端转移酶dutp缺口末端标记)染色。通过在新鲜制备的含有0.1％tritonx-100的0.1％柠檬酸钠中在冰上孵育2分钟来透化视网膜的冷冻切片。第二抗体是alexa488山羊抗兔(invitrogen，sandiegoca，美国)。为了通过激光扫描共聚焦显微镜评估，激发波长为488nm，并且使用515-565nm(绿色)范围内的检测。(c)谷氨酸定量通过反相超高效液相色谱(uplc)(acquity-uplc，waters)作为氨基喹啉衍生物(accq-tagchemistry，masstrakaaamethodandinstruments，waters，milford，ma)进行谷氨酸的定量。(d)glast的免疫组化使用特异性抗体通过荧光显微镜评估主要谷氨酸转运体glast(谷氨酸-天冬氨酸转运体)。使用特异性抗体[兔抗-glast(eaat1)(1:100，abcamab416，cambridge，英国)通过荧光显微术评估glast。谷氨酸在细胞外空间中的积累和谷氨酸受体的过度活化(“兴奋毒性”)在视网膜神经退行性中起重要作用。谷氨酸转运体对于将细胞外谷氨酸浓度保持在神经毒性水平以下是必需的。谷氨酸/天冬氨酸转运体(glast)是最主要的谷氨酸转运体，负责哺乳动物视网膜中至少50％的谷氨酸摄取。结果在用沙格列汀滴眼剂治疗的db/db小鼠中，治疗结束时的血糖浓度和体重与用空载剂治疗的db/db小鼠相似。(a)在用沙格列汀治疗的糖尿病小鼠中预防了视网膜神经退行性变：胶质细胞活化在非糖尿病小鼠中，gfap表达局限于视网膜神经节细胞层(gcl)，因此gfap评分≤2。用空载剂(d-sham)处理的糖尿病小鼠表现出显著高于年龄匹配的非糖尿病小鼠(c(db/+))的gfap表达。因此，100％的糖尿病小鼠的gfap评分≥3。施用沙格列汀(滴眼剂)两周(d-沙格列汀)导致反应性神经胶质增生显著减少，并且在所有情况下用沙格列汀治疗的小鼠的gfap评分<3。使用fluoviewfv1000激光扫描显微镜从数字图像(未显示)推导出所有这些数据，显示了来自用空载剂(d-sham)处理的db/db小鼠、用沙格列汀(d-沙格列汀)处理的db/db小鼠和非糖尿病小鼠(c(db/+))的代表性样品之间的胶质纤维酸性蛋白(gfap)免疫荧光(绿色)。细胞核用hoechst(蓝色)标记，外核层(onl)、内核层(inl)和神经节细胞层(gcl)清晰可见。为了便于理解，下表1显示了阳性gfap标记的百分比(％)：表1该表1显示了基于gfap染色程度的胶质细胞活化的定量。评分系统如下：müller细胞终足区域/仅gcl(得分1)；müller细胞终足区域/gcl加上一些近端进程(得分2)；müller细胞终足加上很多进程，但没有扩展到onl(得分3)；müller细胞终足加上onl中的某些进程(得分4)；müller细胞终足加上从gcl到onl外边缘的许多暗过程(得分5)。n＝10只小鼠/组(5个视网膜切片/小鼠)。视网膜凋亡在所有视网膜层中，用空载剂处理的糖尿病小鼠的凋亡率显著高于非糖尿病小鼠。施用沙格列汀(滴眼剂)两周导致显著预防了所有视网膜层中的细胞凋亡，如图2所示，d-sham小鼠(糖尿病和未治疗的，每只眼睛施用空载剂)、d-saxa(糖尿病和接受沙格列汀滴剂的)和对照(非糖尿病)的tunel阳性细胞的百分比(％)的条形图。(b)沙格列汀施用预防糖尿病引起的谷氨酸增加糖尿病视网膜中的谷氨酸水平(μmol/g蛋白质)高于非糖尿病视网膜中的谷氨酸水平(μmol/g蛋白质)。在用沙格列汀治疗的糖尿病小鼠中，与用空载剂治疗的糖尿病小鼠相比，谷氨酸浓度显著降低(p<0.05)并且与对照小鼠相似(p＝n.s)。对于对照、d-sham小鼠和s-saxa小鼠，数据显示在图3中，具有与之前相同的含义。为解释这一发现，观察到与非糖尿病小鼠(对照db/+)相比，用空载剂(d-sham)处理的糖尿病小鼠的视网膜中谷氨酸/天冬氨酸转运体(glast)(müller细胞表达的主要谷氨酸转运体)显著降低，如使用fluoviewfv1000激光扫描显微镜在数字图像(未显示)中所示，显示用空载剂(d-sham)处理的db/db小鼠、用沙格列汀(d-沙格列汀)处理的db/db小鼠和非糖尿病小鼠(对照(db/+))的代表性样品之间的谷氨酸天冬氨酸转运体(glast)免疫荧光(红色)。细胞核用hoechst(蓝色)标记。在用沙格列汀(d-沙格列汀)治疗的糖尿病小鼠中，预防了由糖尿病诱导的glast的下调，因此也显示红色染色并且类似于对照图像。所有这些数据在图4中示出，其显示了以任意单位(a.u.)定量的glast免疫荧光。n＝10只小鼠/组。结果是平均值±sd。用空载剂(d-sham)和其他组(d-沙格列汀和对照(db/+)处理的db/db之间的*p<0.05。(c)局部施用沙格列汀防止血液-视网膜屏障(brb)的破坏为了评估沙格列汀对早期微血管损伤的影响，检查了白蛋白渗漏。与对照动物(cdb/+)相比，在用空载剂(d-sham)处理的db/db小鼠中观察到更高的白蛋白外渗。使用沙格列汀(d-沙格列汀，滴眼剂)治疗在db/db/小鼠中防止了白蛋白泄漏。图6(a)显示用激光扫描共聚焦显微镜观察到的血清白蛋白结合的伊文思蓝的血管渗漏。在d-sham中，伊文思蓝白蛋白复合物渗漏(箭头)的数量和程度明显高于其他组。在下图中，图6(b)显示了使用fluoviewfv1000激光扫描显微镜对数字图像的白蛋白免疫荧光的定量。未显示其中进行了白蛋白(红色)定量的fluoviewfv1000激光扫描显微镜的免疫组化图像。测试的三种样品是：d-sham、d-沙格列汀和c(db/+)。结果是平均值±sd。用空载剂(d-sham)和其他组处理的db/db之间的*p<0.05。(d)沙格列汀治疗可预防糖尿病引起的erg异常用沙格列汀局部施用于眼睛上可防止由糖尿病引起的a-波和b-波振幅的减少，以及a-波和b-波隐性时间的增加。数据在图5中示出，其中3200cd*s/m2(图a)和12800cd*s/m2(图b)的视网膜电图(erg)代表d-sham小鼠(用空载剂滴眼剂治疗的糖尿病小鼠)、对照(c；d/+)和d-沙格列汀小鼠(用沙格列汀滴眼剂治疗的糖尿病小鼠)。a表示振幅，以微伏(μv)为单位测量；t表示以毫秒(ms)为单位的时间。实施例3.西格列汀局部施用(滴眼剂)预防糖尿病引起的视网膜神经退行性变设计和方法与实施例2中使用的相同。使用西格列汀滴眼剂获得的结果与用沙格列汀滴眼剂处理获得的结果非常相似。在用西格列汀滴眼剂(s-西格列汀)治疗的db/db小鼠中，治疗结束时的血糖浓度和体重与用空载剂(d-sham)治疗的db/db小鼠相似。胶质细胞活化施用西格列汀(滴眼剂)两周导致反应性神经胶质增生显著减少，并且在所有情况下，用西格列汀治疗的小鼠的gfap评分≤3，如表2中的数据所得。表2评分d-shamd-西格列汀(滴眼剂)对照(db/+)10.0085.00100.0020.0010.000.00335.005.000.00450.000.000.00515.000.000.00视网膜凋亡在所有视网膜层中，用空载剂处理的糖尿病小鼠的凋亡率显著高于非糖尿病小鼠。施用西格列汀(滴眼剂)两周导致显著预防了所有视网膜层中的细胞凋亡，如图7所示，d-sham小鼠(糖尿病和接受空载剂滴眼剂的小鼠；每组左侧的黑色条形)、d-西格列汀(接受西格列汀滴剂的；每组中间的灰色条形)和对照(db/+)的tunel阳性细胞的百分比(％)的条形图。描绘了不同视网膜层(神经节细胞层；gcl，内核层；inn和外核层；onl)的数据。与所有视网膜层中的其他组相比，用空载剂处理的db/db小鼠中tunel阳性细胞的百分比显著更高(*p<0.01)。onl：外核层；inl：内核层；gcl：神经节细胞层。n＝10只小鼠/组(每个视网膜最少10个切片)。西格列汀治疗(滴眼剂)也通过以与沙格列汀相同的方式消除由糖尿病诱导的glast的下调来阻止谷氨酸积累(图8)。此外，西格列汀还可以防止通过erg测量的功能异常。最后，西格列汀还保留了brb的密封功能。图9(a)显示用激光扫描共聚焦显微镜观察到的血清白蛋白结合伊文思蓝的血管渗漏。在d-sham中，伊文思蓝白蛋白复合物渗漏(箭头)的数量和程度明显高于其他组。在下图中，图9(b)显示了使用fluoviewfv1000激光扫描显微镜对数字图像的白蛋白免疫荧光的定量。未显示其中进行了白蛋白(红色)定量的fluoviewfv1000激光扫描显微镜的免疫组化图像。测试的三种样品是：d-sham、d-西格列汀和c(db/+)。结果是平均值±sd。用空载剂(d-sham)和其他组处理的db/db之间的*p<0.05。与对照动物(cdb/+)相比，在用空载剂(d-sham)处理的db/db小鼠中观察到白蛋白的外渗。西格列汀(d-西格列汀，滴眼剂)治疗可防止db/db小鼠的白蛋白渗漏。应注意，观察到沙格列汀和西格列汀滴眼液的所有这些作用中血糖水平没有任何变化，因此，它们不能归因于糖尿病环境的变化。然而，不能排除与glp-1受体无关的其他通路的活化。尽管未显示数据，但通过滴眼剂施用的dpp-4抑制剂(沙格列汀和西格列汀)导致glp-1及其主要下游信使camp的视网膜内含量显著增加，从而防止db/db小鼠中的神经退行性和血管渗漏。这并不意味着dpp-4抑制剂的有益作用应该完全归因于glp-1的增强。不受任何理论束缚，发明人认为，事实上，dpp-4抑制剂本身活化了可能参与神经保护的不相关的下游glp-1r通路。在此方面，dietrich等[dietrichn，kolibabkam，buschs等，(2016)thedpp4inhibitorlinagliptinprotectsfromexperimentaldiabeticretinopathy.plosone11:e0167853]最近报道，利格列汀(一种dpp-4抑制剂)在c.elegans(由不表达glp-1r的高葡萄糖水平诱导的神经退行性模型)中具有神经保护作用。此外，应该注意到dpp-iv可以活化视网膜神经节细胞中丰富的g蛋白偶联受体(gpcr)凝血因子ii受体样1(f2rl1，以前称为par2)[wronkowitzn，sw，romachot等，(2014)solubledpp4inducesinflammationandproliferationofhumansmoothmusclecellsviaprotease-activatedreceptor2.biochimbiophysacta1842(9):1613-21]。刺激后，f2rl1促进血管生成和炎症，因此，当治疗dr时，它可能是重要的靶标。此外，据报道，il-1β受体的竞争性拮抗剂il-1ra是dpp-4的底物[zhangh，maqsudis，rainczuka等，(2015)identificationofnoveldipeptidylpeptidase9substratesbytwo-dimensionaldifferentialin-gelelectrophoresis.febsj282(19):3737-57]。因此，dpp-4的抑制可通过阻止il-1ra的切割来减轻il-1β在dr发病机制中的缺失作用。考虑到dpp-4抑制剂出人意料地在局部施用于眼表面(通过角膜、巩膜或结膜)时可以有效地到达视网膜，它们也给出了将glp-1或任何glp-1激动剂局部用于眼表面以到达视网膜的真正替代方案，因为dpp-4抑制剂由于其非肽性质而在制备包含它们的组合物时更为稳定并且易于操作。对检索到的数据进行了统计分析。使用kolmogorov-smirnov检验评估变量的正态分布。数据表示为平均值±sd。使用未配对的studentt检验进行连续变量的比较。当进行多重比较时，使用单向anova，然后进行bonferroni检验。通过fisher精确检验进行分类变量之间的比较。统计学显著性水平设定为p<0.05。所有这些数据共同首次提供了证据表明dpp-4抑制剂的局部眼部施用(滴眼剂)在预防糖尿病视网膜病变早期阶段发生的视网膜神经退行性过程中具有有效作用。该数据还提供证据表明，其中神经退行性发挥重要作用的其他视网膜疾病(与glp-1受体通路相关或不相关)可以用这些化合物的局部眼部施用(滴眼剂)治疗和/或预防。本申请援引参考文献-schmidt等,“neurodegenerativediseasesoftheretinaandpotentialfortheprotectionandrecovery”,currentneuropharmacology–2008，第6卷，第164-178页。-simo等,“neurodegenerationisanearlyeventindiabeticretinopathy:therapeuticimplications”,br.j.ophthalmol.–2012，第96卷，第1285-1290页。-urttia等,“challengesandobstaclesofocularpharmacokineticsanddrugdelivery”.adv.drug.deliv.rev.2006，第58卷，第1131-1135页。-aiello等,“targetingintraocularneovascularizationandedema–onedropatatime”,n.eng.jmed–2008，第359卷，第967-969页。-malhotra等,“permeationthroughcornea”,indianjournalofexperimentalbiology-2001，第39卷，第11-24页。-demeesteri等,“cd26,letitcutorcutitdown”,immunoltoday-1999，第20卷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