作为早期治疗选择的过继细胞疗法的制作方法

本申请要求2016年6月3日提交的美国临时专利申请第62/345,682号的优先权，在此将其全部内容并入作为参考，并主张其优先权。

发明领域

本发明涉及早期过继细胞疗法在疾病例如癌症的管理中的用途，其为被治疗的受试者提供了避免更高风险的治疗方式的可能性。

背景技术：

许多种免疫治疗和/或细胞治疗方法可用于治疗疾病和病状。例如，过继细胞治疗(包括涉及到施用表达嵌合受体例如嵌合抗原受体(car)和/或其他重组抗原受体的细胞的那些治疗，以及其他的过继免疫细胞和过继t细胞治疗，上述嵌合受体对所关注的疾病或病症具有特异性)可以有效地治疗癌症和其他疾病和病状。需要有另外可选的方法，例如，以在某些患者群体中提供增加的效力和/或用于治疗某些疾病和病状。在提供的实施方式当中，有解决该需求的方法和用途。

技术实现要素：

提供用于治疗具有或怀疑具有疾病或病状例如癌症或其他增殖性疾病的受试者的方法和组合物。在一些实施方式中，癌症是淋巴瘤或白血病，例如b细胞增殖性疾病或恶性肿瘤，例如cd19+b细胞恶性肿瘤。在一些实施方式中，这些方法涉及给予受试者一剂量表达重组抗原受体的细胞(在本文中另外称作“rar细胞”)。在一些实施方式中，细胞是表达重组抗原受体的t细胞。在一些实施方式中，重组抗原受体可以是免疫受体，例如t细胞受体或嵌合抗原受体。在一些实施方式中，受体是嵌合受体。在一些实施方式中，嵌合抗原受体与cd19结合。

在一些实施方式中，给予rar细胞用作一线治疗，并且/或者受试者没有接受过用于上述疾病或病状的在先治疗或者没有接受过除诱导化疗和/或巩固化疗以外的这些治疗，并且/或者自上述疾病或病状的诊断起没有接受过这些治疗。在一些实施方式中，患者未另外给予另一治疗，例如另一细胞介导治疗，例如造血干细胞移植(hsct)，在一些情形中，即使患者在给予hsct和/或作为其候选人之后经历过缓解，亦是如此。

在一些实施方式中，上述方法适合于治疗没有用一种或多种其他治疗进行在先、并行、同时或后续治疗的患者和/或不作为这些一种或多种其他治疗的候选人的患者。在一些方面，在给予细胞剂量或其开始之后某一段时间例如1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月或1年之内，受试者不随后或同时接受造血干细胞移植(hsct)，或者不继续接受。在一些方面，在rar细胞剂量给药之后和/或在给予rar细胞或开始rar细胞治疗之内某一段时间例如1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月或1年之内，受试者不接受、不打算接受或者预期不接受hsct。在一些实施方式中，上述方法不涉及给予hsct和/或消融放射或化疗和/或除rar细胞剂量以外和/或任选地诱导和/或巩固化疗以外的其他治疗。

在一些方面，受试者之前没有用hsct治疗过，并且/或者自诊断出上述疾病或病症起和/或在最近的1年或2年或6个月内没有用hsct治疗过。

在一些实施方式中，受试者未接受过hsct(即，hsct-)，并且/或者未接受过用于当前所进行治疗的疾病或病状的一种或多种其他治疗，并且/或者未接受过癌症治疗或化疗或细胞减少性化疗。在一些实施方式中，未接受过hsct的受试者(或者未接受过其他治疗的受试者)是没有接受过造血干细胞移植(或其他治疗)并且/或者自当前所进行治疗的疾病或病状的诊断或获得起没有接受过这些治疗的受试者。在一些实施方式中，受试者在给予rar细胞剂量或者开始rar细胞治疗之后的某一段时间，例如开始给予首剂量的rar细胞之后的至少1、2、3、4、5、6、9或12个月，保持这样的未接受过治疗的状态。在一些实施方式中，受试者在开始给予抗原受体表达细胞之前没有被给予过hsct。在一些方面，受试者在给予细胞之前和/或自疾病或病状的诊断起没有被给予过疾病或病状的治疗；受试者在给药之前和/或自疾病或病状的诊断起没有接受过除诱导化疗或在先剂量的细胞以外的疾病或病状的治疗；并且/或者受试者在给予rar细胞剂量和/或自疾病或病状的诊断起没有接受过除诱导和/或巩固化疗以外的疾病或病状的治疗。

在一些方面，用rar细胞治疗来治疗或开始治疗之后给予hsct可以是禁忌的。在一些方面，在开始或终止细胞治疗之后的一段特定时间，例如，在给予或开始该治疗之后的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内，可以考虑后续的hsct。在具体实施方式中，患有具有一种或多种特定特性或属性的癌症、并且接受过根据本方法的细胞剂量或多个剂量的患者，不应当接受后续的hsct，除非已经穷尽了其他治疗选择并且/或者如果接受后续的hsct则可能表现出并发症诱导的死亡风险增加则不应当接受后续的hsct。

在一些实施方式中，上述方法从而导致指示治疗的结果，例如，例如完全缓解、临床缓解、无复发生存期、总生存、mrd-阴性反应率或其他有利结果。在一些实施方式中，与通过相同的方法接受治疗但受试者在给予抗原受体表达细胞之后或者在给予抗原受体表达细胞的1个月、2个月、3个月或6个月之内接受hsct的受试者中所观察到的相比较，指示治疗的结果或因子得以提高。

在一些实施方式中，与在给予抗原受体表达细胞之后接受过hsct的受试者相比较，受试者的生存期提高、增加或延长。

还提供有治疗方法，其中该方法涉及给予具有疾病或病状的受试者一剂量表达重组抗原受体的细胞，其中受试者在开始给予抗原受体表达细胞之后和/或在开始给予抗原受体表达细胞之前和/或与开始给予抗原受体表达细胞同期，没有同时接受和/或没有接受过造血干细胞移植(hsct)。在一些实施方式中，受试者在给予抗原受体表达细胞之前或与其同期没有接受过hsct，并且受试者在给予抗原受体表达细胞之后不接受hsct。

还提供有给予具有疾病或病状的受试者一剂量表达重组受体的细胞的方法，其中受试者在给予抗原受体表达细胞之后不接受造血干细胞移植(hsct)。

还提供有给予具有疾病或病状的受试者一剂量表达重组受体的细胞的方法，其中受试者在给予细胞之前或与其同时没有接受过造血干细胞移植(hsct)。在一些实施方式中，疾病或病状是肿瘤或癌症。在一些实施方式中，疾病或病状选自白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性成淋巴细胞性白血病(all)、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、霍奇金氏淋巴瘤、宫颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤文肉瘤、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、间皮瘤及其组合。在一些具体实施方式中，疾病或病状是白血病或淋巴瘤，其任选地是b细胞白血病或淋巴瘤。在一些实施方式中，受试者在开始给予抗原受体表达细胞时，表现出形态学病变(morphologicdisease)。

还提供有治疗方法，涉及给予表现出形态学病变的癌症受试者一剂量表达重组抗原受体的细胞，其中受试者在给予抗原受体表达细胞之后不接受造血干细胞移植(hsct)。在一些实施方式中，受试者选择成在开始给予抗原受体表达细胞时具有未接受过hsct的状态。在一些实施方式中，受试者选择成在开始给予抗原受体表达细胞时具有表现出形态学病变的癌症。

在此另外提供一种治疗方法，其包括：

(a)选择符合以下条件的具有疾病或病状的患者：(i)没有(a)接受过造血干细胞移植(hsct)，(b)自疾病或病状的诊断起接受过hsct，(c)被给予过所述疾病或病状的治疗，(d)被给予过除诱导化疗以外的疾病或病状的治疗，(e)被给予过除巩固治疗和/或在先剂量的细胞以外的所述疾病或病状的治疗；和/或(ii)是成人；和/或(iii)表现出一定阈值以上的形态学病变或疾病负担；和/或(iv)不是hsct候选人；和/或(v)不打算或未被设定为接受hsct治疗；和

(b)给予患者一剂量表达重组抗原受体的细胞，所述受体任选地是嵌合抗原受体。

在一些实施方式中，受试者从而在给予rar细胞之后表现出临床缓解、分子缓解、完全缓解或无复发生存至少大约1个月、大约2个月、大约3个月、大约4个月、大约5个月、大约6个月、大约12个月、大约24个月、大约36个月或大约48个月；在非限定性实施方式子集中，所述受试者在所述时间段内，不接受hsct。在一些实施方式中，疾病或病状是肿瘤或癌症。在一些实施方式中，受试者在开始给予抗原受体表达细胞时表现出形态学病变。

在一些实施方式中，提供的治疗方法涉及：

(a)选择表现出形态学病变的癌症受试者；

(b)给予受试者一剂量表达重组抗原受体的细胞；和

(c)在给予抗原受体表达细胞之后不给予受试者造血干细胞移植(hsct)。

在一些实施方式中，提供的治疗方法涉及：

(a)选择表现出微小或分子病变的癌症受试者；

(b)给予受试者一剂量表达重组抗原受体的细胞；和

(c)在给予抗原受体表达细胞之后不给予受试者造血干细胞移植(hsct)。

在一些实施方式中，疾病或病状是白血病或淋巴瘤。在一些具体实施方式中，疾病或病状选自慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性成淋巴细胞性白血病(all)、非霍奇金氏淋巴瘤和急性骨髓性白血病，任选地是b细胞来源的。在一些其他实施方式中，疾病或病状是非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)，其任选地是b细胞来源的。在一些其他实施方式中，疾病或病状是急性成淋巴细胞性白血病(all)。在一些其他实施方式中，疾病是b细胞来源的急性成淋巴细胞性白血病(all)。

在一些可以与其他实施方式和/或本文所述方法结合的实施方式中，受试者在给予抗原受体表达细胞之前被给予hsct。在其他实施方式中，受试者在给予抗原受体表达细胞之前未被给予hsct，和/或在给予细胞剂量之前的某一段时间之内没有被给予过该治疗，例如，自诊断出疾病或病状起没有被给予过该治疗，和/或在过去大约1个月、大约2个月、大约3个月、大约4个月、大约5个月、大约6个月、大约7个月、大约8个月、大约9个月、大约10个月、大约11个月、大约12个月或者过去大约1年、大约2年、大约3年或大约4年或更长时间之内没有被给予过该治疗。

在一些可以与其他实施方式和/或本文所述方法结合的实施方式中，形态学病变包括骨髓中大于5％或大于大约5％的母细胞。在某些实施方式中，形态学病变包括骨髓中大于20％或大于大约20％的母细胞。在一些实施方式中，形态学病变包括骨髓中大于50％或大于大约50％的母细胞。在一些实施方式中，微小或分子病变包括骨髓中小于(少于)大约5％或大约5％的母细胞，和/或其中在血液和骨髓中通过一定检验例如流式细胞术检验基本上检测不到母细胞，但通过分子方法例如pcr可检测到。

在某些实施方式中，受试者表现出微小病变和/或选择成具有微小病变。在一些实施方式中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约99％的在给药之前即刻具有微小病变的具有疾病或病状的受试者，通过所述方法治疗，表现出完全缓解和/或mrd-阴性的完全缓解。

在一些实施方式中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约99％的在给药之前即刻具有形态学病变的具有疾病或病状的受试者，通过所述方法治疗，表现出完全缓解和/或mrd-阴性的完全缓解。

在一些可以与其他实施方式和/或本文所述方法结合的实施方式中，受试者在开始给予抗原受体表达细胞时表现出包括分子水平上可检测的病变的癌症。

在一些实施方式中，在此公开的方法导致，与在给予抗原受体表达细胞之前、与其同时地和/或之后接受过hsct的受试者相比较，受试者的总生存期提高。在一些实施方式中，该方法导致，与在给予抗原受体表达细胞之后接受过hsct的受试者相比较，受试者的总生存期提高。

在本文公开的一些实施方式和/或方法中，与通过除了在给予抗原受体表达细胞之后和/或之前还包括给予hsct以外与所述方法相同的方法治疗的受试者当中的相比较，在给予抗原受体表达细胞之后，使用所述方法治疗之后的受试者当中的平均中位总生存期提高大于或大于大约2个月、大于或大于大约6个月、大于或大于大约1年、或者大于或大于大约2年。

在本文公开的一些实施方式和/或方法中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％或者至少大约99％的用所述方法治疗的受试者，在开始给予抗原受体表达细胞之后，表现出大于或大于大约6个月、1年、2年、大于或大于大约3年、大于或大于大约4年或更长时间的生存期、无事件生存期和/或无复发生存期。在一些实施方式中，hsct对于受试者来说是同种异体的。在一些实施方式中，在开始抗原受体表达细胞时，受试者之前没有被给予过用于治疗疾病或病状的治疗或治疗剂，并且/或者没有接受过靶向肿瘤和/或癌症的治疗剂，并且/或者没有接受过除另一剂量细胞或另一剂量表达嵌合受体的细胞以外的任何这些药剂。

在一些实施方式中，在开始给予抗原受体表达细胞时，受试者在给予先前的用于治疗疾病或病状的治疗或治疗剂之后复发过，或者在给予抗原受体表达细胞之前，受试者通过用于治疗疾病或病状的治疗或治疗剂、任选地靶向肿瘤或癌症的治疗剂治疗过，并且在开始给予抗原受体表达细胞时，对所述治疗或治疗剂是难治性或无应答的。在一些实施方式中，所述方法导致受试者中疾病或病状的负担降低，如通过指示疾病负担的一种或多种因子的降低所指示。在一些实施方式中，细胞表达的抗原受体特异性地结合疾病或病状的细胞或组织所表达的抗原或者与疾病或病状相关的抗原。

在一些本文所述的实施方式和/或方法中，重组抗原受体是t细胞受体或功能性非t细胞受体；并且/或者重组抗原受体是嵌合抗原受体(car)。在一些实施方式中，重组抗原受体是car。在一些实施方式中，抗原受体包括与抗原特异性结合的细胞外抗原识别结构域和包括itam的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，抗原包括cd19。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括cd3-ζ(cd3ζ)链细胞内结构域。在一些实施方式中，car还包括共刺激信号传导区。在一些实施方式中，共刺激信号传导区包括cd28的信号传导结构域，并任选地包括cd28的跨膜和/或细胞外部分。在其他实施方式中，共刺激信号传导结构域包括4-1bb的信号传导结构域。

在一些实施方式中，嵌合抗原受体(car)是包括cd28的信号传导结构域的cd19导向car，如国际专利申请公开第wo2014134165、wo2008121420号和美国专利第7,446,190号中所述。

在一些实施方式中，重组抗原受体导入的细胞包括或者是t细胞。在一些实施方式中，t细胞是cd4⁺和/或cd8⁺。在一些实施方式中，t细胞对于受试者来说是自体的。在一些实施方式中，细胞的剂量包括足以降低受试者中疾病或病状负担的量的细胞。在一些实施方式中，cd4⁺与cd8⁺细胞的比例为大约1:5至大约5:1。在一些实施方式中，cd4⁺与cd8⁺细胞的比例为大约1:2至大约2:1。

在一些可以与本文公开的任何其他实施方式和/或方法结合的实施方式中，细胞的剂量包括大约0.2x10⁶细胞/kg受试者体重至大约6x10⁶细胞/kg、大约0.5x10⁶细胞/kg受试者体重至大约3x10⁶细胞/kg、大约0.75x10⁶细胞/kg至大约2.5x10⁶细胞/kg、或者大约1x10⁶细胞/kg至大约2x10⁶细胞/kg，其均包括两端值。在一些实施方式中，所述剂量的细胞在包括细胞的单一药物组合物中给予。在一些实施方式中，所述剂量的细胞在合计包括所述剂量的细胞的多个组合物中用不超过3天的时间给予。

在一些实施方式中，本文公开的方法还包括在给予首剂量的抗原受体表达细胞之后，给予受试者连续剂量的表达重组抗原受体的细胞。

在一些实施方式中，首剂量和连续剂量以pct申请第wo2016/064929号中所述的方式给予。在一些实施方式中，连续剂量的抗原受体表达细胞在开始给予首剂量的细胞之后的大约9至大约35天、大约14至大约28天、大约15至大约27天或者大约17天至大约21天(其均包括两端值)的时间点给予。

在一些实施方式中，连续剂量中的细胞表达的抗原受体与首剂量中的细胞表达的抗原受体相同，或者与首剂量中的细胞表达的抗原受体基本上相同。在一些实施方式中，连续剂量中的细胞表达的抗原受体所特异性结合的抗原与首剂量的细胞表达的抗原受体所特异性结合的抗原相同。

在一些实施方式中，连续剂量的细胞包括足以降低受试者中疾病或病状负担的量的细胞。在一些实施方式中，连续剂量的细胞包括数量小于或大约等于首剂量中的抗原受体表达细胞的数量的抗原受体表达细胞。在一些实施方式中，受试者在开始给予首剂量的细胞之后、在开始给予连续剂量的细胞之前，表现出形态学病变。

在一些实施方式中，连续剂量包括与首剂量相比较数量增加的抗原受体表达细胞。在一些实施方式中，增加的数量比首剂量中的数量大至少大约2倍、5倍或者10倍。在一些实施方式中，受试者在开始给予首剂量的细胞之后、在开始给予连续剂量的细胞之前，表现出微小病变。

附图说明

图1.亚组的完全缓解(cr)率。ph+：费城染色体阳性；ci：置信区间。

图2.所有患者的基线疾病负担的总生存期。

图3.mrd-cr患者的基线疾病负担的总生存期。

图4.mrd-cr患者的基线疾病负担和car-thsct后的总生存期。

表1.基线患者特性。

表2.完全缓解(cr)率。

表3.细胞因子释放综合症(crs)分级系统。

表3a.示例性crs分级标准。

表4.基线疾病负担的crs&神经毒性。

具体实施方式

在此提供涉及将改造的细胞给予具有疾病或病状的受试者的治疗方法。细胞总体加以基因改造，以表达一种或多种重组抗原受体，例如嵌合抗原受体(car)。

用基因改造的细胞进行细胞治疗的方法和用途

提供用于细胞治疗用以治疗疾病或病状包括各种癌症和肿瘤的方法和组合物。上述方法涉及给予表达重组受体的改造的细胞(在本文中另外称作“rar细胞”)，上述受体设计成识别和/或特异性结合与要治疗的疾病或病状有关的分子，并在结合这些分子时导致反应，例如针对这些分子的免疫反应。受体可以包括嵌合受体，例如，例如嵌合抗原受体(car)的嵌合受体，和其他转基因抗原受体，包括转基因t细胞受体(tcr)。

在一些实施方式中，上述方法有利地能够在疾病或病状的诊断之后早期和/或在受试者已接受一种或多种用于疾病或病状的疗法或治疗之前，治疗具有某些疾病或病状例如癌症(例如b细胞白血病或淋巴瘤)的受试者。例如，在一些实施方式中，上述方法涉及在诊断大约1、大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约11、大约12或更多个月之内，和/或在受试者没有接受过用于疾病或病状的治疗和/或没有接受过特定类型的治疗或疗法例如造血干细胞移植(hsct)、高剂量化疗或放射和/或除另一剂量的细胞(和/或其他改造的细胞)和/或诱导化疗或巩固化疗以外的治疗时，给予受试者一个或多个剂量的rar细胞。在一些实施方式中，上述方法和用途提供用于某些疾病和病状的一线治疗。在一些实施方式中，上述方法避免了对给予rar细胞以外的额外治疗、例如可能带来副作用风险(在一些情形中，特别是在某些受试者群体中)的其他治疗例如hsct和/或其他治疗以治疗疾病或病状(例如癌症)的需求。在一些实施方式中，上述方法包括基于受试者之前没有用一种或多种指定疗法治疗过和/或具有一种或多种特性来选择受试者，例如，可能增加随后给予这些一种或多种其他疗法的风险的特性。在一些实施方式中，受试者的选择是基于年龄(例如，选择成年受试者或者年龄至少18、20、30、40、50、55、60、65、70、75或80岁的受试者)，疾病负担(例如，选择具有高形态学病变或微小病变或分子病变的受试者；如果受试者在骨髓中表现出小于大约5％母细胞，受试者选择成表现出微小病变，在某些实施方式中，受试者表现出分子水平上可检测的癌症)。在一些实施方式中，受试者表现出微小病变和/或选择成具有微小病变。在一些实施方式中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约99％的在给药之前即刻具有微小病变的具有疾病或病状的受试者，通过所述方法治疗，表现出完全缓解和/或mrd-阴性的完全缓解。在一些实施方式中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约99％的在给药之前即刻具有形态学病变的具有疾病或病状的受试者，通过所述方法治疗，表现出完全缓解和/或mrd-阴性的完全缓解。

在一些实施方式中，受试者的选择基于疾病或病状，例如白血病或淋巴瘤，例如b细胞白血病或淋巴瘤和/或急性成淋巴细胞性白血病(all)。在一些实施方式中，疾病或病状是非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)和/或慢性淋巴细胞性白血病，例如b细胞来源的。

在一些实施方式中，上述方法包括用一剂量rar细胞治疗受试者，其中这些细胞表达识别或结合与疾病或病状相关的抗原或分子的重组抗原受体，并且不进一步给予受试者造血干细胞移植(hsct)，例如同种异体hsct，并且/或者其中在给予细胞剂量或开始给予之后、或在这之后的一段时间之内，受试者不接受该进一步给予，例如，在给予或开始给予该细胞剂量(其可以是首次或后续的(例如连续的)细胞剂量)之后的大约1、大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约11或者大约12个月之内，不接受该进一步给予。

在一些方面，在用rar细胞治疗来治疗或开始治疗之后，给予hsct可以是禁忌的。在一些实施方式中，在开始或终止细胞治疗之后的一段特定时间内，例如，在给予或开始该治疗之后的大约1、大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约11或大约12个月内，可以考虑后续的hsct。在具体实施方式中，患有具有一种或多种特定特性或属性的癌症、并且根据本方法接受过的细胞剂量或多个剂量的患者，不应当接受后续的hsct，除非已经穷尽了其他治疗选择，并且/或者如果接受后续的hsct的话可能表现出并发症诱导的死亡风险增加，则不应当接受后续的hsct。在这些实施方式方面，受试者或疾病的一种或多种特定特性或属性是或包括：形态学病变，母细胞大于大约5％、大约20％或大约50％，微小病变，分子病变；大于某一特定年龄，例如成年，年龄至少18、20、30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85或90岁；除被治疗的疾病或病状以外，个体中还存在一种或多种共患的疾病或病状，例如，已知存在干细胞移植后并发症风险增加者。例如，在一些实施方式中，如果受试者具有或者怀疑具有一种或多种各自独立地或以任何方式结合的上述属性，则后续的hsct是禁忌的或不推荐的。在一些实施方式中，并发症诱导的死亡是指除直接归因于细胞治疗、疾病负担和/或癌症以外的因子(例如，hsct导致的败血症)诱导的死亡。在一些实施方式中，这些患者可以响应于细胞治疗实现过癌症的完全缓解，但是如果在细胞治疗之后给予hsct，则非癌症原因的并发症和/或死亡风险可能增加。在一些方面，本发明的方法涉及选择具有表现出形态学病态的癌症的患者，或者选择具有微小病变的患者，其包括给予受试者一剂量表达重组抗原受体的细胞，并且在给予抗原受体表达细胞之后不给予受试者造血干细胞移植(hsct)。在一些实施方式中，受试者表现出微小病变和/或选择成具有微小病变。在一些实施方式中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约99％的在给药之前即刻具有微小病变的具有疾病或病状的受试者，通过所述方法治疗，表现出完全缓解和/或mrd-阴性的完全缓解。在一些实施方式中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约99％的在给药之前即刻具有形态学病变的具有疾病或病状的受试者，通过所述方法治疗，表现出完全缓解和/或mrd-阴性的完全缓解。

在一些实施方式中，上述方法包括对受试者、组织或细胞，例如具有或怀疑具有疾病、病状或病症或者处于其风险中的受试者、组织给予rar细胞或者含有该细胞的组合物。在一些实施方式中，将rar细胞、群体和/或组合物给予到具有要治疗的特定疾病或病状的受试者，例如，经由过继细胞治疗，例如过继t细胞治疗。在一些实施方式中，将rar细胞或组合物给予到受试者，例如具有疾病或病状或处于其风险中的受试者，以减轻疾病或病状的一种或多种症状。

在一些实施方式中，受试者未接受过hsct(即，hsct-)，并且/或者未接受过用于当前进行治疗的疾病或病状的一种或多种其他治疗，并且/或者未接受过癌症治疗或化疗或细胞减少性化疗。在一些实施方式中，未接受过hsct的受试者(或者未接受过其他治疗的受试者)是没有接受过造血干细胞移植(或其他治疗)并且/或者自从当前进行治疗的疾病或病状的诊断或获得后没有接受过这样的治疗的受试者。在一些实施方式中，受试者在给予rar细胞剂量或者开始rar细胞治疗之后的某一段时间，例如开始给予首剂量的rar细胞之后的至少大约1、大约2、大约3、大约4、大约5、大约6或大约12个月，保持这样的未接受过治疗的状态。在一些实施方式中，受试者在开始给予抗原受体表达细胞之前没有被给予过hsct。

在一些实施方式中，受试者是在开始给予表达重组抗原受体的细胞剂量之前没有在先通过hsct治疗过、并且/或者在某一段时间内或自诊断后没有这样治疗过的受试者。在一些方面，受试者在所述治疗之后或者在所述治疗后的某一段时间内不进一步接受hsct，并且/或者不需要这样的治疗，以实现特定的生存期或其他效果。

在一些实施方式中，受试者之前用造血干细胞移植(hsct)例如同种异体hsct治疗过，但是不接受后续的hsct。在一些实施方式中，受试者在hsct之后具有顽固性或复发的疾病。

在一些实施方式中，受试者在给予表达重组受体的细胞之前用靶向疾病或病状例如肿瘤的治疗剂治疗过，例如，以降低疾病或减小其大小但不完全根治疾病或病状，例如，诱导和/或巩固化疗。在一些方面，受试者对其他治疗剂是难治性或无应答的。在一些实施方式中，例如，在用另一治疗性干预包括化疗或放射治疗之后，受试者具有顽固性或复发的疾病。

在一些实施方式中，rar细胞作为组合治疗的一部分给予，例如，与其他治疗性介入例如抗体或改造的细胞或受体或药剂例如细胞毒性剂或治疗剂一起，例如同时地或者以任意顺序依次给予。在一些实施方式中，同时地或者以任意顺序依次地，将rar细胞与一种或多种额外的治疗剂一起，或者与其他治疗性干预相结合，共给予或同期给予。在一些情形中，rar细胞与其他治疗的共给予在时间上足够接近，使得rar细胞群体提高了一种或多种额外的治疗剂的效果，或者反过来。在一些实施方式中，将rar细胞在一种或多种额外的治疗剂之前给予。在一些实施方式中，将rar细胞在一种或多种额外的治疗剂之后给予。在一些实施方式中，一种或多种额外的药剂包括细胞因子，例如il-2，例如，以提高持久性。

在一些实施方式中，上述方法在首次或连续剂量的给药之前，包括给予化疗剂，例如，调节性化疗剂，例如，以降低肿瘤负担。

在一些实施方式中，尽管受试者变得耐受其他治疗，并且/或者受试者没有接受过其他治疗或者除其他rar细胞剂量或者一轮或两轮化疗以外没有接受过其他治疗，上述给予有效地治疗受试者。在一些实施方式中，与用其他方法治疗的受试者相比较，用所述方法治疗的受试者的平均生存期增加。

被治疗的疾病或病状通常是目标抗原的表达与之有关和/或参与其病因学的疾病或病状，例如，其中抗原导致、加剧或者另外方式参与这些疾病、病状或病症，或者仅是该疾病或病状的标记物，或者在其细胞上过量表达或独特地表达。示例性的疾病和病状可以包括与恶性肿瘤或细胞转变有关的疾病或病状(例如癌症)。示例性的抗原，包括与各种可治疗的疾病和病状相关的抗原，如上文所述。在具体的实施方式中，嵌合抗原受体或转基因tcr同与疾病或病状相关的抗原特异性结合。

在疾病、病状和病症当中有肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，包括局限性和转移性肿瘤。在一些实施方式中，受试者具有感染性疾病，例如，被病毒或其他病原体例如hiv、hcv、hbv、cmv感染，和寄生虫病。

在一些实施方式中，疾病或病状是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、赘生物或其他增殖性疾病或病症。这些疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，慢性淋巴细胞性白血病(cll)、急性成淋巴细胞性白血病(all)、非霍奇金氏淋巴瘤、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性b细胞淋巴瘤、b细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、霍奇金氏淋巴瘤、宫颈癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤文肉瘤、成神经管细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤和/或间皮瘤。在一些实施方式中，受试者具有急性成淋巴细胞性白血病(all)。在一些实施方式中，受试者具有非霍奇金氏淋巴瘤。

在一些实施方式中，疾病或病状是感染性疾病或病状，例如，但不限于，病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染，免疫缺陷，巨细胞病毒(cmv)、epstein-barr病毒(ebv)、腺病毒、bk多瘤病毒。在一些实施方式中，疾病或病状是自体免疫或炎症性疾病或病状，例如，关节炎例如类风湿性关节炎(ra)、i型糖尿病、系统性红斑狼疮(sle)、炎症性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫氏病(grave'sdisease)、克罗恩病(crohn'sdisease)、多发性硬化、哮喘和/或与移植相关的疾病或病状。

在一些实施方式中，疾病或病状相关的抗原选自孤儿酪氨酸激酶受体rorl、tegfr、her2、ll-cam、cd19、cd20、cd22、间皮素、cea和乙肝表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、egp-2、egp-4、0epha2、erbb2、3或4、fbp、胎儿乙酰胆碱(acethycholine)e受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewisy、l1-细胞粘附分子、mage-al、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、癌胚抗原(oncofetalantigen)、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、her2/neu、雌激素受体、孕激素受体、ephrinb2、cd123、cs-1、c-met、gd-2和magea3、ce7、肾母细胞瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白例如细胞周期蛋白a1(ccna1)和/或生物素化分子和/或由hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。

在一些实施方式中，提供的方法可以提高受试者的总生存期，其中受试者在治疗时表现出特定水平的疾病负荷，例如形态学或微小病变。

用于过继细胞治疗的细胞给予方法是已知的，并可以与提供的方法和组合物结合使用。例如，过继t细胞治疗方法描述于以下文献中：例如，gruenberg等人的美国专利申请公开第2003/0170238号；rosenberg等人的美国专利第4,690,915号；rosenberg(2011)natrevclinoncol.8(10):577-85。参见，例如，themeli等人.(2013)natbiotechnol.31(10):928-933；tsukahara等人.(2013)biochembiophysrescommun438(1):84-9；davila等人.(2013)plosone8(4):e61338。

在一些实施方式中，细胞治疗，例如过继细胞治疗，例如过继t细胞治疗通过自体转移进行，其中由要接受细胞治疗的受试者或者由源自该受试者的样品分离和/或另外制备细胞。因此，在一些方面，细胞源自于对治疗有需求的受试者，例如患者，并将细胞在分离和处理之后给予同一受试者。

在一些实施方式中，细胞治疗，例如过继细胞治疗，例如过继t细胞治疗通过同种异体转移进行，其中由要接受或者最终接受细胞治疗的受试者例如第一受试者以外的受试者分离和/或另外制备细胞。在这些实施方式中，然后将细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方式中，第一和第二受试者是遗传学上等同的。在一些实施方式中，第一和第二受试者是遗传学上相似的。在一些实施方式中，第二受试者表达与第一受试者相同的hla类别或超类型。

细胞可以通过任何适当的方式给予，例如，通过大量输注(bolusinfusion)，通过注射，例如，静脉或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔(trans-septal)注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、subconjectval注射、结膜下注射、眼球筋膜下(sub-tenon's)注射、眼球后注射、眼球周注射或后巩膜旁递送。在一些实施方式中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给药，如果需要局部治疗，则通过病灶内给药。肠胃外注射包括肌肉内、静脉内、动脉内注射、腹膜内或皮下给药。在一些实施方式中，通过单次大剂量推注细胞来给予指定的剂量。在一些实施方式中，将其通过细胞的多次大剂量推注来给药，例如在不超过3天的时间内，或者通过细胞的连续输注给药来给予。

对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可以取决于要治疗的疾病的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、出于预防性还是治疗性目的而给予细胞、在先的治疗、受试者的病史和对细胞的应答以及主治医师的判断。在一些实施方式中，一次地或者在一系列治疗中将组合物和细胞适当地给予受试者。

一经将细胞给予受试者(例如人)，通过若干已知方法中任一种测量改造的细胞群体在一些方面的生物活性。评价参数包括改造的或天然的t细胞或其他免疫细胞对抗原的特异性结合，例如，通过成像进行体内评价，或者，例如，通过elisa或流式细胞术进行离体评价。在某些实施方式中，改造的细胞破坏目标细胞的能力可以使用本领域已知的任何适当方法来测量，例如，细胞毒性检验，例如，如kochenderfer等人,j.immunotherapy,32(7):689-702(2009)；和herman等人.j.immunologicalmethods,285(1):25-40(2004)中所述。在某些实施方式中，细胞的生物活性也可以通过检验某些细胞因子例如cd107a、ifnγ、il-2和tnf的表达和/或分泌来测量。在一些方面，生物活性通过评价临床结果来测量，例如，肿瘤负担或荷载的降低。在一些方面，对毒性结果、耐久性和/或细胞的扩张和/或宿主免疫反应的存在或不存在进行评价。

在某些实施方式中，改造的细胞通过任意若干方式进行修饰，使得其治疗或预防效力增加。例如，群体表达的改造car或tar可以通过接头与目标部分直接或间接缀合。将化合物例如car或tcr与目标部分缀合的实施是本领域已知的。例如，参见wadwa等人,j.drugtargeting3:111(1995)和美国专利5,087,616。

细胞表达的重组抗原受体

在一些实施方式中，所提供方法中使用或给予的细胞含有或者被改造成含有改造的受体，例如，改造的抗原受体，例如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr)。另外提供了这些细胞的群体、含有这些细胞的组合物和/或这些细胞富集的组合物，例如，其中某些类型的细胞例如t细胞或cd8⁺或cd4⁺细胞得以富集或选择。这些组合物当中，有用于给药例如过继细胞治疗的药物组合物和制剂。另外提供根据所提供的方法将细胞和组合物给予受试者例如患者的治疗方法。

在一些实施方式中，细胞包括一种或多种经由基因改造引入的核酸，从而表达这些核酸的重组或基因改造产物。在一些实施方式中，基因转移通过以下方法实现：首先，例如，通过将细胞与诱导例如增殖、存活和/或激活等反应的刺激物合并，对细胞进行刺激，例如，如通过细胞因子或激活标记物的表达而测量，然后，对激活的细胞进行转导，在培养中扩张至足以进行临床应用的数量。

细胞总体表达重组受体，例如，抗原受体，包括功能性非tcr抗原受体，例如，嵌合抗原受体(car)和其他的抗原结合受体，例如，转基因t细胞受体(tcr)。受体当中还有其他的嵌合受体。

嵌合抗原受体(car)

在所提供方法和用途的一些实施方式中，嵌合抗体例如嵌合抗原受体含有一个或多个将提供针对所需抗原(例如肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如，抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域结合起来的结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域是提供主要激活信号的激活性的细胞内结构域部分，例如t细胞激活结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域含有或额外地含有共刺激信号传导结构域，以促进效应子功能。在一些实施方式中，嵌合受体在基因改造到免疫细胞中时可以调节t细胞活性，在一些情形中，可以调节t细胞分化或体内平衡，从而产生体内寿命、生存和/或耐久性提高的基因改造的细胞，例如，用于过继细胞治疗方法。

示例性的抗原受体包括car以及将这些受体改造并引入细胞中的方法包括以下文献中所述者：例如，国际专利申请公开第wo200014257号、第wo2013126726号、第wo2012/129514号、第wo2014031687号、第wo2013/166321号、第wo2013/071154号、第wo2013/123061号、美国专利申请公开第us2002131960号、第us2013287748号、第us20130149337号、美国专利第6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118号以及欧洲专利申请第ep2537416号，和/或以下文献中所述者：sadelain等人,cancerdiscov.2013april；3(4):388-398；davila等人.(2013)plosone8(4):e61338；turtle等人,curr.opin.immunol.,2012年10月；24(5):633-39；wu等人,cancer,2012march18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括car，如美国专利第7,446,190号中所述，以及国际专利申请公开第wo/2014055668a1号中所述者。car的例子包括任意前述出版物中所述者，例如，wo2014031687、us8,339,645、us7,446,179、us2013/0149337、美国专利第7,446,190号、美国专利第8,389,282号，kochenderfer等人,2013,naturereviewsclinicaloncology,10,267-276(2013)；wang等人.(2012)j.immunother.35(9):689-701；和brentjens等人,scitranslmed.20135(177)。另外参见，wo2014031687、us8,339,645、us7,446,179、us2013/0149337、美国专利第7,446,190号和美国专利第8,389,282号。

嵌合受体例如car总体上包括细胞外抗原结合结构域，例如抗体分子部分，通常为抗体的可变重链(vh)区和/或可变轻链(vl)区，例如scfv抗体片段。

在一些实施方式中，受体靶向的抗原是多肽。在一些实施方式中，受体靶向的抗原是碳水化合物或其他分子。在一些实施方式中，与正常或非靶向细胞或组织相比较，抗原在疾病或状况的细胞上例如肿瘤或致病性细胞上选择性表达或过量表达。在其他实施方式中，抗原在正常细胞上表达和/或在改造的细胞上表达。

在一些实施方式中，受体靶向的抗原包括孤儿酪氨酸激酶受体rorl、tegfr、her2、ll-cam、cd19、cd20、cd22、间皮素、cea和乙肝表面抗原、抗叶酸受体、cd23、cd24、cd30、cd33、cd38、cd44、egfr、egp-2、egp-4、0epha2、erbb2、3或4、fbp、胎儿乙酰胆碱e受体、gd2、gd3、hmw-maa、il-22r-α、il-13r-α2、kdr、κ轻链、lewisy、l1-细胞粘附分子、mage-al、间皮素、muc1、muc16、psca、nkg2d配体、ny-eso-1、mart-1、gp100、癌胚抗原、ror1、tag72、vegf-r2、癌胚抗原(cea)、前列腺特异性抗原、psma、her2/neu、雌激素受体、孕激素受体、ephrinb2、cd123、c-met、gd-2和magea3、ce7、肾母细胞瘤1(wt-1)、细胞周期蛋白例如细胞周期蛋白a1(ccna1)和/或生物素化分子和/或由hiv、hcv、hbv或其他病原体表达的分子。

在一些实施方式中，car与病原体特异性抗原结合。在一些实施方式中，car对于病毒抗原(例如hiv、hcv、hbv等)、细菌抗原和/或寄生抗原具有特异性。

在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，抗体或片段包括scfv。

在一些实施方式中，重组受体例如car的抗体部分还包括至少一部分免疫球蛋白恒定区，例如铰链区，例如igg4铰链区和/或ch1/cl和/或fc区。在一些实施方式中，恒定区或部分是人igg，例如igg4或igg1。在一些方面，恒定区部分起到抗原识别组分例如scfv和跨膜结构域之间的间隔区的作用。与不存在间隔区的情况相比较，间隔区的长度可以是提供增加细胞在抗原识别之后的反应性。示例性间隔区包括，但不限于，hudecek等人.(2013)clin.cancerres.,19:3153、国际专利申请公开第wo2014031687号、美国专利第8,822,647号或美国专利公开第us2014/0271635号中所述者。

在一些实施方式中，抗原受体包括与细胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方式中，嵌合抗原受体包括将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域。在一些实施方式中细胞内信号传导结构域包括itam。例如，在一些方面，抗原识别结构域(例如，细胞外结构域)通常与一个或多个细胞内信号传导组件连接，例如，上述信号传导组件在car的情形中模拟通过抗原受体复合物例如tcr复合物的激活，和/或模拟经由另一细胞表面受体的信号。在一些实施方式中，嵌合受体包括在细胞外结构域(例如scfv)和细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方式中，抗原结合组件(例如抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域连接。

在一实施方式中，使用天然地与受体例如car中的结构域之一缔合的跨膜结构域。在一些情形中，跨膜结构域选择或者通过氨基酸置换修饰成避免这些结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以将与受体复合物其他成员的相互作用最小化。

在一些实施方式中，跨膜结构域来自天然来源，或者来自合成来源。当来源是天然的时，在一些方面中，结构域来自任何膜结合或跨膜蛋白质。

跨膜区域包括源自t细胞受体α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cds、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154的区域(即，包括至少它们的跨膜区)。另外可选地，在一些实施方式中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包括疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成的跨膜结构域的各端将会发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方式中，连接通过接头、间隔区和/或跨膜结构域实现。在一些方面，跨膜结构域含有cd28的跨膜部分。在一些方面，受体还包括一部分cd28的细胞外区域，例如，美国专利第7,446,190号中所述的嵌合受体中的那些。在一些实施方式中，例如，当抗原是cd19时，嵌合受体是如美国专利第7,446,190号中所述者，例如，其具有其中所述的cd28-来源的序列和抗-cd19scfv，在一些方面，还具有cd3ζ细胞内部分。在一些实施方式中，其为1928z。1928z的示例性结构和序列可见于国际专利申请公开第wo2014134165、wo2008121420号和美国专利第7,446,190号中。

在一些实施方式中，细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接地连接。在一些实施方式中，细胞外结构域和跨膜结构域可以通过间隔区连接，例如本文所述任意间隔区。在一些实施方式中，受体含有跨膜结构域来源的分子的细胞外部分，例如，cd28细胞外部分。

在细胞内信号传导结构域当中，有模拟或近似以下信号的结构域：通过天然抗原受体的信号，与共刺激受体结合通过该受体的信号，和/或通过单独的共刺激受体的信号。在一些实施方式中，存在有短的寡肽或多肽接头，例如，长度为2-10个氨基酸的接头，例如，其含有甘氨酸和丝氨酸，例如甘氨酸-丝氨酸二联体，该接头在car的跨膜结构域和胞质信号传导结构域之间形成连接。

在一些方面，t细胞激活描述成由两类胞质信号传导序列介导：通过tcr引发依赖于抗原的主要激活的序列(主要胞质信号传导序列)，和以不依赖于抗原的方式作用提供次要或共刺激信号的序列(次要胞质信号传导序列)。在一些方面，car包括一个或两个这样的信号传导组件。

受体例如car通常包括至少一个细胞内信号传导组件或多个组件。在一些方面，car包括调节tcr复合物的主要激活的主要胞质信号传导序列。主要胞质信号传导序列以刺激方式发挥作用，其可以含有称作基于免疫受体酪氨酸的激活基序或itam的信号传导基序。含有主要胞质信号传导序列的itam的例子包括源自cd3ζ链、fcrγ、cd3γ、cd3δ和cd3ε的基序。在一些实施方式中，car中的胞质信号传导分子含有胞质信号传导结构域、其部分或源自cd3ζ的序列。

在一些实施方式中，受体包括tcr复合物的细胞内组件，例如介导t细胞激活和细胞毒性的tcrcd3链，例如cd3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分与一个或多个细胞信号传导模块连接。在一些实施方式中，细胞信号传导模块包括cd3跨膜结构域、cd3细胞内信号传导结构域和/或其他cd跨膜结构域。在一些实施方式中，受体例如car还包括一种或多种额外的分子例如fc受体γ、cd8、cd4、cd25或cd16的一部分。例如，在一些方面，car或其他嵌合受体在cd3-zeta(cd3-ζ)或fc受体γ和cd8、cd4、cd25或cd16之间包括嵌合分子。

在一些实施方式中，一经car或其他嵌合受体的配合，受体的胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活正常效应器功能或者免疫细胞例如改造成表达car的t细胞的反应中的至少一种。例如，在一些情形中，car诱导t细胞功能，例如溶细胞活性或辅助性t细胞活性，例如分泌细胞因子或其他因子。在一些实施方式中，例如，如果其转导效应器功能信号，则使用抗原受体组件或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分来代替完整的免疫刺激链。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域或多个结构域包括t细胞受体(tcr)的胞质序列，在一些方面，还包括在天然环境中与这些受体一起作用以在抗原受体衔接之后引发信号转导的共受体的序列。

在天然tcr环境中，完全激活通常不仅要求通过tcr进行信号传导，还要求有共刺激信号。因此，在一些实施方式中，为了促进完全激活，car中还包括用于产生第二或共刺激信号的组件。在其他实施方式中，car不包括用于产生共刺激信号的组件。在一些方面，在相同的细胞中表达额外的car，其提供用于产生第二或共刺激信号的组件。

在一些实施方式中，嵌合抗原受体含有t细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方式中，car包括共刺激受体例如cd28、4-1bb、ox40、dap10和icos的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，同一car既包括激活组件，也包括共刺激组件。在一些实施方式中，嵌合抗原受体含有源自t细胞共刺激分子或其功能性变体的细胞内结构域，例如，在跨膜结构域和细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，t细胞共刺激分子是cd28或41bb。

在一些实施方式中，激活结构域包括在一car中，而共刺激组件由识别另一抗原的另一car提供。在一些实施方式中，car包括激活或刺激car、共刺激car，其均在相同细胞上表达(参见wo2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或激活car和/或共刺激car。在一些实施方式中，细胞还包括抑制性car(icar，参见fedorov等人,sci.transl.medicine,5(215)(2013年12月))，例如识别与疾病或病状有关并/或对其有特异性的抗原以外的抗原的car，从而通过抑制性car与其配体的结合，使通过靶向疾病的car递送的激活信号得以减少或抑制，例如，以降低脱靶作用。

在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括与cd3(例如，cd3-ζ)细胞内结构域连接的cd28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内信号传导结构域包括嵌合的cd28和cd137(4-1bb、tnfrsf9)共刺激结构域，其与cd3ζ细胞结构域连接。

在一些实施方式中，car在胞质部分中包括一个或多个，例如2个或更多个共刺激结构域和激活结构域，例如主要激活结构域。示例性car包括cd3-ζ、cd28和4-1bb的细胞内组件。

在一些实施方式中，抗原受体还包括标记物，并且/或者表达car或其他抗原受体的细胞还包括替代标记物，例如细胞表面标记物，其可以用于确认用以表达受体的细胞的转导或改造。在一些方面，标记物包括全部或部分(例如，截短形式)的cd34、ngfr或表皮生长因子受体，例如截短形式的该细胞表面受体(例如，tegfr)。在一些实施方式中，编码标记物的核酸与编码接头序列例如可切割接头序列例如t2a的多核苷酸可操作连接。例如，标记物和任选的接头序列可以如专利申请公开第wo2014031687号所公开中的任意者。例如，标记物可以是截短的egfr(egfrt)，其任选地与接头序列例如t2a可切割接头序列连接。

在一些实施方式中，标记物是分子，例如，t细胞上未天然发现或者t细胞表面上未天然发现的细胞表面蛋白质或者其一部分。在一些实施方式中，分子是非自身(non-self)分子，例如，非自身蛋白质，即，不被细胞所要过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为自身的蛋白质。

在一些实施方式中，标记物不发挥治疗性功能，并且/或者不产生用作基因改造标记物(例如用于选择被成功改造的细胞)以外的作用。在其他实施方式中，标记物可以是治疗性分子或者另外施加一些所需效果的分子，例如，细胞要在体内遇到的配体，例如，共刺激或免疫检查点分子，以提高和/或抑制过继转移和遇到配体时的细胞反应。

在一些情形中，car被称作是第一、第二和/或第三代car。在一些方面，第一代car是在抗原结合时仅仅提供cd3-链诱导的信号的那些；在一些情形中，第二代car是提供该信号和共刺激信号的那些，例如，包括来自共刺激受体例如cd28或cd137的细胞内信号传导结构域的那些；在一些方面，第三代car是包括多个不同共刺激受体的共刺激结构域的那些。

例如，在一些实施方式中，car含有抗体例如抗体片段、作为或含有cd28或其功能性变体的跨膜部分的跨膜结构域、以及含有cd28或其功能性变体的信号传导部分和cd3ζ或其功能性变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，car含有抗体例如抗体片段、作为或含有cd28或其功能性变体的跨膜部分的跨膜结构域、以及含有4-1bb或其功能性变体的信号传导部分和cd3ζ或其功能性变体的信号传导部分的细胞内信号传导结构域。在一些这样的实施方式中，受体还包括间隔区，该间隔区含有ig分子例如人ig分子的一部分，例如ig铰链，例如igg4铰链，例如仅铰链的间隔区。

例如，在一些实施方式中，car包括抗体，例如抗体片段(包括scfv)，间隔区，例如含有免疫球蛋白分子一部分例如铰链区的间隔区和/或一个或多个重链分子的恒定区，例如含有ig-铰链的间隔区，含有全部或部分源自cd28的跨膜结构域的跨膜结构域，源自cd28的细胞内信号传导结构域，和cd3ζ信号传导结构域。在一些实施方式中，car包括抗体或片段例如scfv，间隔区，例如任意的含有ig-铰链的间隔区，源自cd28的跨膜结构域，源自4-1bb的细胞内信号传导结构域，和cd3ζ信号传导结构域。

在一些实施方式中，编码这些car构建物的核酸分子还包括编码t2a核糖体跳过(skip)元件和/或tegfr序列的序列，例如在编码car的序列的下游。在一些实施方式中，也可以产生表达抗原受体(例如car)的t细胞，以将截短的egfr(egfrt)表达成非免疫原性选择表位(例如，通过引入编码由t2a核糖体开关隔开的car和egfrt的构建物，以从同一构建物表达两种蛋白质)，然后将其用作检测这些细胞的标记物(参见，例如，美国专利第8,802,374号)。

由给予到受试者的细胞表达的重组受体例如car通常识别或特异性结合在被治疗的疾病或病状或其细胞中表达、与其相关并/或对其有特异性的分子。一经与该分子例如抗原特异性结合，受体通常向细胞中递送免疫刺激信号，例如itam-转导的信号，从而促进靶向疾病或病状的免疫反应。例如，在一些实施方式中，细胞表达car，其与疾病或病状的细胞或组织表达的或者与疾病或病状相关的抗原特异性结合。

tcr

在一些实施方式中，基因改造的抗原受体包括重组t细胞受体(tcr)和/或由天然t细胞克隆的tcr。在一些实施方式中，从患者中识别、分离目标抗原(例如癌症抗原)的高亲和力t细胞克隆，并将其引入到细胞中。在一些实施方式中，目标抗原的tcr克隆已经在用人免疫系统基因(例如，人白血球抗原系统或hla)改造的转基因小鼠中产生。参见，例如，肿瘤抗原(参见，例如，parkhurst等人(2009)clincancerres.15:169-180；和cohen等人.(2005)jimmunol.175:5799-5808)。在一些实施方式中，使用噬菌体展示来分离针对目标抗原的tcr(参见，例如，varela-rohena等人.(2008)natmed.14:1390-1395；和li(2005)natbiotechnol.23:349-354)。

在一些实施方式中，获得t细胞克隆之后，将tcrα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方式中，tcrα和β基因经由小核糖核酸病毒2a核糖体跳过肽连接，使得两个链得以共表达。在一些实施方式中，tcr的基因转移经由逆转录病毒或慢病毒载体或者经由转座子完成(参见，例如，baum等人.(2006)moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy.13:1050-1063；frecha等人.(2010)moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy.18:1748-1757；和hackett等人(2010)moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy.18:674-683)。

剂量

在一些实施方式中，剂量的大小或时机随着受试者中具体疾病或病状的变化而确定。鉴于提供的说明，从经验上确定具体疾病的剂量大小和时机在技术人员的水平之内。

在过继细胞治疗的背景中，给予指定的“剂量”包括给予指定量或数量的细胞作为单一组合物和/或单次不间断的给药，例如，作为单次注射或连续输注，并且还包括在不超过3天的特定一段时间内，给予指定量或数量的细胞作为分次剂量(splitdose)，其在多个单独的组合物或输注物中提供。因此，在一些情形中，首次或连续剂量是在单一时间点给予或开始的单次或连续的特定数量的细胞的给药。但是，在一些情形中，首次或连续剂量在不超过3天的时间段内，在多次注射或输注中给予，例如3天或2天内一天一次，或者通过在单日时间内多次输注。

因此，在一些方面，首剂量的细胞在单一药物组合物中给予。在一些实施方式中，连续剂量的细胞在单一药物组合物中给予。

在一些实施方式中，首剂量的细胞在合计含有首剂量细胞的多个组合物中给予。在一些实施方式中，连续剂量的细胞在合计含有连续剂量细胞的多个组合物中给予。在一些方面，额外的连续剂量可以在不超过3天的时间内在多个组合物中给予。

术语“分次剂量”是指将剂量分割成将其在一天以上时间内给予。该类型的剂量包括在本发明的方法中，并视作是单一剂量。

因此，细胞剂量可以作为分次剂量给予。例如，在一些实施方式中，剂量可以在2天或3天内给予受试者。分次剂量的示例性方法包括在第1天给予大约25％的剂量，在第2天给予剩余大约75％的剂量。在其他实施方式中，可以在第1天给予大约33％的第一剂量，在第2天给予剩余大约67％。在一些方面，在第1天给予大约10％的剂量，在第2天给予大约30％的剂量，在第3天给予大约60％的剂量。在一些实施方式中，分次剂量分散在不超过3天的时间内。

在一些实施方式中，细胞的剂量通常足够大，以有效降低疾病负担。

在一些实施方式中，细胞以所需的剂量给予，其在一些方面包括所需剂量和数量的细胞或细胞类型和/或所需比例的细胞类型。因此，在一些实施方式中，细胞的剂量基于细胞的总数量(或者数量/kg体重)和所需的单独的群体或亚型的比例，例如cd4⁺与cd8⁺的比例。在一些实施方式中，细胞的剂量基于单独的群体中或单独的细胞类型的细胞总数量(或者数量/kg体重)。在一些实施方式中，细胞的剂量基于这些特征例如所需的总细胞数量、所需的比例和单独的群体中所需的细胞总数量的组合。

在一些实施方式中，细胞的群体或亚型例如cd8⁺和cd4⁺t细胞以所需的总细胞剂量例如所需的t细胞剂量或者在其容许差异内给予。在一些方面，所需的剂量是所需数量的细胞或所需数量的细胞/被给予细胞的受试者的单位体重，例如细胞/kg。在一些方面，所需的剂量等于或大于最小数量的细胞或最小数量的细胞/单位体重。在一些方面，在以所需的剂量给予的总细胞当中，单独的群体或亚型以所需的输出比(例如cd4⁺与cd8⁺的比例)或接近其存在，例如，在该比例的一定容许差异或误差内。

在一些实施方式中，以一种或多种单独的群体或亚型的细胞的所需剂量，例如cd4⁺细胞的所需剂量和/或cd8⁺细胞的所需剂量，或者在其容许差异内，给予细胞。在一些方面，所需的剂量是所需数量的亚型或群体的细胞，或所需数量的这些细胞/被给予细胞的受试者的单位体重，例如细胞/kg。在一些方面，所需的剂量等于或大于最小数量的群体或亚型的细胞，或最小数量的群体或亚型的细胞/单位体重。

因此，在一些实施方式中，剂量基于所需的固定剂量的总细胞和所需的比例，并且/或者基于所需固定剂量的一种或多种例如每种单独的亚型或亚群体。因此，在一种实施方式中，剂量基于所需的固定或最小剂量的t细胞和所需的cd4⁺与cd8⁺细胞的比例，并且/或者基于所需固定或最小剂量的cd4⁺和/或cd8⁺细胞。

在某些实施方式中，将细胞或者细胞的单独的亚型群体，以如下范围或者这些范围间的任意数值给予受试者：大约1百万至大约1000亿细胞，例如，例如大约1百万至大约500亿细胞(例如，大约5百万细胞、大约2500万细胞、大约50000万细胞、大约10亿细胞、大约50亿细胞、大约200亿细胞、大约300亿细胞、大约400亿细胞或任意两个前述数值定义的范围)，例如，大约1千万至大约1000亿细胞(例如，大约2000万细胞、大约3000万细胞、大约4000万细胞、大约6000万细胞、大约7000万细胞、大约8000万细胞、大约9000万细胞、大约100亿细胞、大约250亿细胞、大约500亿细胞、大约750亿细胞、大约900亿细胞或任意两个前述数值定义的范围)，在一些情形中，大约10000万细胞至大约500亿细胞(例如，大约12000万细胞、大约25000万细胞、大约35000万细胞、大约45000万细胞、大约65000万细胞、大约80000万细胞、大约90000万细胞、大约30亿细胞、大约300亿细胞、大约450亿细胞)。

在一些实施方式中，总细胞的剂量和/或单独的细胞亚群体的剂量在如下范围内：大约10⁴至大约10⁹细胞/千克(kg)体重，例如，大约10⁵至大约10⁶细胞/kg体重，例如，大约1x10⁵细胞/kg、大约1.5x10⁵细胞/kg、大约2x10⁵细胞/kg、或大约1x10⁶细胞/kg体重。例如，在一些实施方式中，将细胞以如下剂量或者在其一定误差范围内给予：大约10⁴至大约10⁹t细胞/千克(kg)体重，例如，大约10⁵至大约10⁶t细胞/kg体重，例如，大约1x10⁵t细胞/kg、大约1.5x10⁵t细胞/kg、大约2x10⁵t细胞/kg或大约1x10⁶t细胞/kg体重。

在一些实施方式中，细胞以如下剂量或者在其一定误差范围内给予：大约10⁴至大约10⁹cd4⁺和/或cd8⁺细胞/千克(kg)体重，例如，大约10⁵至大约10⁶cd4⁺和/或cd8⁺细胞/kg体重，例如，大约1x10⁵cd4⁺和/或cd8⁺细胞/kg、大约1.5x10⁵cd4⁺和/或cd8⁺细胞/kg、大约2x10⁵cd4⁺和/或cd8⁺细胞/kg，或1x10⁶cd4⁺和/或cd8⁺细胞/kg体重。

在一些实施方式中，细胞以如下剂量或者在其一定误差范围内给予：大于，和/或至少大约1x10⁶、大约2.5x10⁶、大约5x10⁶、大约7.5x10⁶或大约9x10⁶cd4⁺细胞，和/或至少大约1x10⁶、大约2.5x10⁶、大约5x10⁶、大约7.5x10⁶或大约9x10⁶cd8+细胞，和/或至少大约1x10⁶、大约2.5x10⁶、大约5x10⁶、大约7.5x10⁶或大约9x10⁶t细胞。在一些实施方式中，细胞以如下剂量或者在其一定误差范围内给予：大约10⁸至大约10¹²或大约10¹⁰至10¹¹t细胞，大约10⁸至大约10¹²或大约10¹⁰至大约10¹¹cd4⁺细胞，和/或大约10⁸至10¹²或大约10¹⁰至大约10¹¹cd8⁺细胞。

在一些实施方式中，细胞以多种细胞群体或亚型例如cd4⁺和cd8⁺细胞或亚型的所需输出比例或者在其容许范围内给予。在一些方面，所需的比例可以是特定的比例或可以是比例范围。例如，在一些实施方式中，所需的比例(例如，cd4⁺与cd8⁺细胞的比例)为大约1:5至大约5:1(或者大于大约1:5且小于大约5:1)，或者大约1:3至大约3:1(或者大于大约1:3且小于大约3:1)，例如，大约2:1至大约1:5(或者大于大约1:5且小于大约2:1)，例如，大约5:1、大约4.5:1、大约4:1、大约3.5:1、大约3:1、大约2.5:1、大约2:1、大约1.9:1、大约1.8:1、大约1.7:1、大约1.6:1、大约1.5:1、大约1.4:1、大约1.3:1、大约1.2:1、大约1.1:1、大约1:1、大约1:1.1、大约1:1.2、大约1:1.3、大约1:1.4、大约1:1.5、大约1:1.6、大约1:1.7、大约1:1.8、大约1:1.9、大约1:2、大约1:2.5、大约1:3、大约1:3.5、大约1:4、大约1:4.5或者大约1:5。在一些方面，容许的差异在所需比例的大约1％、大约2％、大约3％、大约4％、大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％内，包括这些范围间的任意数值。

在一些实施方式中，例如，当受试者是人时，剂量包括小于或等于大约1x10⁸总重组受体(例如car)表达细胞、t细胞或外周血单核细胞(pbmc)，例如，范围在大约1x10⁶至大约1x10⁸的这些细胞，包括两端值，例如，不大于大约2x10⁶、大约5x10⁶、大约1x10⁷、大约5x10⁷或大约1x10⁸或者全部的这些细胞，或者任意两个前述数值之间的范围。在一些实施方式中，剂量含有小于或等于大约1x10⁸总重组受体(例如car)表达细胞、t细胞或外周血单核细胞(pbmc)/m²受体，例如，范围在大约1x10⁶至大约1x10⁸这些细胞/m²受体，包括两端值，例如，不大于大约2x10⁶、大约5x10⁶、大约1x10⁷、大约5x10⁷或大约1x10⁸这些细胞/m²受体，或者任意两个前述数值之间的范围。

在一些实施方式中，剂量中的细胞数量为大约0.5x10⁶细胞/kg受试者体重至大约3x10⁶细胞/kg，大约0.75x10⁶细胞/kg至大约2.5x10⁶细胞/kg，或者大约1x10⁶细胞/kg至大约2x10⁶细胞/kg，其均包括两端值。

在具体实施方式中，剂量含有的细胞数量、重组受体(例如，car)表达细胞的数量、t细胞数量或外周血单核细胞(pbmc)数量的范围为大约10⁵至大约10⁶这些细胞/千克受试者体重，其包括两端值，并且/或者这些细胞的数量不大于大约10⁵或大约10⁶这些细胞/千克受试者体重，其包括两端值。例如，在一些实施方式中，剂量包括小于或不大于或大约1x10⁵、大约2x10⁵、大约5x10⁵、或大约1x10⁶这些细胞/千克受试者体重。在一些实施方式中，剂量包括大约1x10⁵、大约2x10⁵、大约5x10⁵、大约1x10⁶这些细胞/千克受试者体重，或者任意前述数值之间的范围内的数值。

在具体实施方式中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如car)表达细胞的数量。在其他实施方式中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、t细胞或外周血单核细胞(pbmc)的数量或浓度。

在一些方面，剂量的大小基于一种或多种标准确定，例如，受试者对在先治疗例如化疗的反应，受试者中的疾病负荷例如肿瘤负荷、体积、大小或程度，范围，或者转移的类型，阶段，和/或受试者发展毒性结果例如crs、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒素的可能性或发病率，和/或对被给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫反应。

在一些方面，剂量的大小通过受试者中疾病或病状的负担确定。例如，在一些方面，给予的细胞数量基于给予细胞剂量之前即刻受试者中存在的肿瘤负担确定。在一些实施方式中，剂量的大小与疾病负担呈负相关。在一些方面，如在大疾病负担的情形中，给予受试者少量的细胞，例如，小于或等于或大约1x10⁶细胞/千克受试者体重，或者小于或等于或大约0.5x10⁶细胞/kg。在其他实施方式中，如在较低疾病负担的情形中，给予受试者大量的细胞，例如，大于大约1x10⁶细胞/千克受试者体重，例如，大于大约2x10⁶、大约2.5x10⁶或大约3x10⁶细胞/kg。在一些实施方式中，剂量中细胞、重组受体(例如car)表达细胞、t细胞或外周血单核细胞(pbmc)的数量大于大约1x10⁶这些细胞/千克受试者体重，例如，大约2x10⁶、大约3x10⁶、大约5x10⁶、大约1x10⁷、大约5x10⁷、大约1x10⁸、大约1x10⁹或大约1x10¹⁰这些细胞/千克体重和/或大约1x10⁸、大约1x10⁹、大约1x10¹⁰这些细胞/m²受试者或全部，或者任意两个前述数值之间的范围。

在一些实施方式中，在治疗之前对受试者进行疾病负担的评价，如果受试者表现出小于5％的骨髓母细胞，则受试者可以给予如下剂量的重组受体表达(例如car表达，例如car表达t细胞)：大于大约1x10⁶细胞/kg、大约2x10⁶细胞/kg、大约5x10⁶细胞/kg或大约1x10⁷细胞/kg，或者，如果受试者表现出大于或等于大约5％的骨髓母细胞，则受试者可以给予如下剂量的重组受体表达(例如car表达，例如car表达t细胞)：小于或等于或大约1x10⁶细胞/kg或大约0.5x10⁶细胞/kg。在一些实施方式中，在治疗之前对受试者进行疾病负担的评价，如果受试者表现出小于10％(例如，小于大约9％、小于大约8％、小于大约7％、小于大约6％、小于大约5％、小于大约4％、小于大约3％、小于大约2％、小于大约1％、小于大约0.5％)的骨髓母细胞，则受试者可以给予如下剂量的重组受体表达(例如car表达，例如car表达t细胞)：大于大约1x10⁶细胞/kg、大约2x10⁶细胞/kg、大约5x10⁶细胞/kg或大约1x10⁷细胞/kg，或者，如果受试者表现出大于或等于大约10％的骨髓母细胞，则受试者可以给予如下剂量的重组受体表达(例如car表达，例如car表达t细胞)：小于或等于或大约1x10⁶细胞/kg或大约0.5x10⁶细胞/kg。在一些实施方式中，在治疗之前对受试者进行疾病负担的评价，如果受试者表现出小于大约20％的骨髓母细胞，则受试者可以给予如下剂量的重组受体表达(例如car表达，例如car表达t细胞)：大于大约1x10⁶细胞/kg、大约2x10⁶细胞/kg、大约5x10⁶细胞/kg或大约1x10⁷细胞/kg，或者，如果受试者表现出大于或等于大约20％的骨髓母细胞，则受试者可以给予如下剂量的重组受体表达(例如car表达，例如car表达t细胞)：小于或等于或大约1x10⁶细胞/kg或大约0.5x10⁶细胞/kg。在一些实施方式中，在首剂量的重组受体表达(例如car表达，例如car表达t细胞)之前，评价疾病负担，并选择适应风险的剂量。在一些实施方式中，在一个或多个连续剂量的重组受体表达(例如car表达，例如car表达t细胞)之前，评价疾病负担，并选择适应风险的剂量。

关于细胞数量，在一些实施方式中，这些数值是指重组受体-表达(例如car-表达)细胞的数量；在其他实施方式中，这些数值是指给予的t细胞或pbmc或总细胞的数量。

在一些情形中，可以给予一个或多个另外的连续剂量。在一些实施方式中，在连续剂量中给予的细胞数量与在任意在此的实施方式中首剂量中给予的细胞数量相同或类似。在一些实施方式中，选择具体的剂量方案，以降低或最小化给予表达重组抗原受体的细胞时受试者中的毒性，例如，如pct专利申请公开第wo2016/064929号中所述。

在一些情形中，在特定的疾病或情形中如果要求或需要，提供的方法涉及以相比于首剂量的细胞增加的数量、因而以更高的剂量给予连续剂量的细胞。在一些实施方式中，首先给予低剂量重组受体-表达(例如car-表达)细胞的方法可以降低受试者中的疾病负担，例如从形态学病变状态降低至最小病变，使得在受试者中后续给予更高剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞不太可能在大多数被治疗的受试者中导致毒性结果。

在一些实施方式中，在给予连续剂量之前，受试者表现出非形态学病变，例如，分子水平上可检测的病变和/或微小病变。如果受试者表现出骨髓中小于大约5％的母细胞，则称受试者表现出最小病变。在某些实施方式中，具有最小病变的受试者表现出分子水平上可检测的癌症。在一些实施方式中，基于疾病或病状，例如白血病或淋巴瘤，例如b细胞白血病或淋巴瘤和/或疾病成淋巴细胞性白血病(all)选择受试者。在一些实施方式中，受试者表现出微小病变和/或选择成具有微小病变。在一些实施方式中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约99％的在给药之前即刻具有微小病变的具有疾病或病状的受试者，通过所述方法治疗，表现出完全缓解和/或mrd-阴性的完全缓解。在一些实施方式中，至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约75％、至少大约80％、至少大约85％、至少大约90％或者至少大约99％的在给药之前即刻具有形态学病变的具有疾病或病状的受试者，通过所述方法治疗，表现出完全缓解和/或mrd-阴性的完全缓解。

在一些实施方式中，在给予首剂量之后、给予连续剂量之前，可对受试者进行肿瘤负担的评价，以确认与用首剂量治疗之前存在的肿瘤负担相比较，肿瘤负担已降低。在一些实施方式中，如果对受试者的评价表明肿瘤负担降低和/或受试者表现出非形态学病变，例如分子水平上可检测的病变和/或最小病变，则提供的方法包括给予比首次或初始剂量高的连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞。在一些实施方式中，如果对受试者的评价表明肿瘤负担没有降低和/或受试者表现出形态学病变，则提供的方法包括给予等于或小于首次或初始剂量的连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞。

在一些实施方式中，在给予首次或初始剂量的细胞之后受试者的肿瘤负担有可能已经通过首剂量降低的时间，给予受试者连续剂量的重组受体-表达(例如car-表达)细胞。在一些实施方式中，给予连续剂量之前所有受试者中肿瘤负担均实际上被降低并非必需，但在被治疗的受试者中肿瘤负担平均上得以降低，例如，基于临床数据，其中大多数用该首剂量治疗过的受试者表现出降低的肿瘤负担，例如，至少大约50％、大约60％、大约70％、大约80％、大约90％、大约95％或更多的用首次或初始剂量治疗的受试者表现出降低的肿瘤负担。通常，在疾病负担已通过首剂量降低或者有可能已通过首剂量降低之后的时间点，给予受试者连续剂量，从而进一步降低和/或消除疾病或其症状或结果或者防止其扩散或发展。在一些方面，在连续给药时疾病负担降低的情形中，转移的细胞耗尽的可能性降低，从而提高了效力。与首剂量相比较，连续剂量可以相同、更低或更高。在一些实施方式中，在首剂量之后给予多个连续剂量。

在一些实施方式中，以高于首剂量的剂量给予连续剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞，使得通过连续剂量将数量增加的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞给予受试者。在一些实施方式中，较高剂量的重组受体-表达(例如，car-表达)细胞可以促进反应或效力的增加，例如，与给予较低剂量或数量的细胞所实现的情形相比较，肿瘤负担改善或有更多的降低和/或受试者的总生存期提高或更大。在一些实施方式中，由于给予首剂量的细胞可以降低受试者中的肿瘤负担，以较高数量的细胞给予连续剂量，可以在给予连续剂量之后，在受试者中避免否则可能在具有形态学病变的受试者中发生的crs和/或神经毒性或使其最小化。

在一些方面，连续剂量大于首剂量。例如，在一些实施方式中，连续剂量含有大于大约1x10⁶细胞、重组受体(例如car)-表达细胞、t细胞和/或pbmc/千克受试者体重，例如，大约或至少大约2x10⁶、大约3x10⁶、大约5x10⁶、大约1x10⁷、大约1x10⁸或大约1x10⁹这些细胞/千克受试者体重。在一些实施方式中，连续剂量中的细胞数量为大约2x10⁶细胞/kg受试者体重至大约6x10⁶细胞/kg、大约2.5x10⁶细胞/kg至大约5.0x10⁶细胞/kg或者大约3.0x10⁶细胞/kg至大约4.0x10⁶细胞/kg，其均包括两端值。在一些实施方式中，连续剂量的量或大小足以降低疾病负担或其指标，和/或疾病或病状的一种或多种综合症。在一些实施方式中，剂量的大小有效地提高受试者的生存期，例如，诱导受试者的生存期、无复发生存期或无事件生存期为至少6个月或者至少大约1、大约2、大约3、大约4或大约5年。在一些实施方式中在连续剂量中给予的细胞、重组受体(例如car)-表达细胞、t细胞和/或给予的pbmc和/或给予的这些细胞的数量/受试者体重比首剂量中给予的数量大至少2倍、5倍、10倍、50倍或100倍或更大。在一些实施方式中，在连续剂量之后，与给予首剂量或连续剂量之前即刻相比较，疾病负担、肿瘤大小、肿瘤体积、肿瘤质量和/或肿瘤负载或体积降低了至少大约50％、大约60％、大约70％、大约80％或大约90％或更多。

在其他实施方式中，在连续剂量中给予的细胞数量低于在首剂量中给予的细胞数量。

在一些实施方式中，在首剂量之后给予多个连续剂量，使得在给予连续剂量之后给予额外的剂量或多个剂量。在一些实施方式中，额外的剂量或多个剂量(即，第三个、第四个、第五个等等)中给予受试者的细胞数量与首剂量和/或连续剂量相同或类似。在一些实施方式中，额外的剂量或多个剂量大于在先的剂量。

在一些实施方式中，连续剂量相对于第一剂量和/或相对于彼此的时机设计成降低有害毒性结果的风险，并促进最大效力。在一些实施方式中，在受试者中疾病负担保持降低或受试者疾病负担平均降低(例如，基于临床数据)、但crs和/或神经毒性风险保持低的时候，给予连续剂量，例如相同、较低或较高的连续剂量。在一些实施方式中，通常在毒性结果或症状或其生化指标——例如crs或神经毒性、巨噬细胞激活综合症或肿瘤溶解综合症——等于或低于可接受水平时相对于首次或之前的剂量的时间点，给予连续剂量。例如，在初始剂量之后，可以在毒性结果达到高峰并在降低中或者已减少至低于可接受水平之后给予连续剂量。因此，在一些实施方式中，连续剂量在开始首次或在先剂量之后的大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、大约10、大约11、大约12、大约13、大约14、大约15、大约16、大约17、大约18、大约19、大约20、大约21、大约22、大约23、大约24、大约25、大约26或大约27天给予，或者在开始首次或在先剂量之后的大于大约14或大约15天或21天给予。在一些实施方式中，通过监测和/或评价与毒性事件有关的一种或多种症状或结果的存在，并在确定症状或结果处在或低于可接受水平之后递送连续剂量，确定适当的时机。

疾病负担的降低、效力和生存期

根据提供的方法给药通常降低或预防受试者中疾病或病状的扩散或负担。例如，当疾病或病状是肿瘤时，上述方法通常降低肿瘤的大小、体积、转移、骨髓中母细胞百分含量或分子水平上可检测的癌症和/或改善预后或存活期或与肿瘤负担相关的其他症状。

疾病负担可以包括受试者中疾病细胞的总数量，或者受试者的器官、组织或体液例如肿瘤的器官或组织或其他位置(例如，其将指示转移)中疾病细胞的总数量。例如，在某些恶性血液病的情形中，可以检测和/或定量血液或骨髓中的肿瘤细胞。在一些实施方式中，疾病负担可以包括肿瘤质量、转移的数量或程度和/或骨髓中存在的母细胞的百分含量。

在一些实施方式中，受试者具有白血病。疾病负担的程度可以通过评价血液或骨髓中的残余白血病来确定。在一些实施方式中，如果骨髓中有大于或等于5％母细胞，如通过光学显微镜所确定，例如，骨髓中大于或等于大约10％母细胞，骨髓中大于或等于大约20％母细胞，骨髓中大于或等于大约30％母细胞，骨髓中大于或等于大约40％母细胞，或者骨髓中大于或等于大约50％母细胞，则受试者表现出形态学病变。在一些实施方式中，如果骨髓中有少于大约5％母细胞，则受试者表现出完全或临床缓解。

在一些实施方式中，受试者可以表现出完全缓解，但存在有少部分形态学上检测不到(通过光学显微镜技术)的残余白血病细胞。如果受试者表现出骨髓中母细胞少于5％，并表现出分子水平上可检测的癌症，则称受试者表现出微小残余病变(mrd)。在一些实施方式中，分子水平上可检测的癌症可以使用许多种允许敏感检测少量细胞的分子技术中的任一种来评价。在一些方面，这些技术包括pcr检验，其可以确定染色体易位产生的独特的ig/t-细胞受体基因重排或融合转录物。在一些实施方式中，可以使用流式细胞术来基于白血病特异性免疫表型识别癌细胞。在一些实施方式中，癌症的分子检测可以检测到100,000个正常细胞中少达1个的白血病细胞。在一些实施方式中，如果例如通过pcr或流式细胞术在100,000细胞中检测到至少或大于1个白血病细胞，则受试者表现出在分子水平上可检测的mrd。在一些实施方式中，在一些实施方式中，受试者的疾病负担在分子水平上不可检测或mrd，使得在一些情形中，使用pcr或流式细胞术技术在受试者中不能检测到白血病细胞。

在一些方面，在给予第一剂量之后疾病或病状持续，和/或给予第一剂量不足以根治受试者中的疾病或病状。

在一些方面，与首剂量之前即刻时或连续剂量之前即刻时的疾病负担相比较，给予连续剂量降低了疾病负担。在一些方面，例如，在复发的情形中，与给予首剂量之后的疾病负担峰值水平相比较，给予连续剂量实现了疾病负担的降低。

在一些实施方式中，与使用替代剂量方案的相当的方法观察到的降低结果相比较，例如在上述相当的方法中受试者接受在先和/或随后的hsct和/或通常例如在某些患者群体中携带有害副作用风险的其他治疗，所述方法降低疾病或病状负担的程度更大和/或时间更长，上述负担例如肿瘤细胞的数量、肿瘤的大小、患者生存期或无事件生存期。

在一些实施方式中，检测、评价或测量受试者中疾病或病状的负担。在一些方面，通过检测受试者中或者受试者器官、组织或液体例如血液或血清中的疾病或疾病相关细胞例如肿瘤细胞的总数量，可以检测疾病负担。在一些实施方式中，通过测量实体肿瘤的质量和/或转移的数量或程度，评价疾病负担，例如肿瘤负担。在一些方面，评价受试者的生存期、某段时间内的生存期、生存的程度、无事件或无症状生存期的存在或持续时间或无复发生存期。在一些实施方式中，评价疾病或病状的任意症状。在一些实施方式中，疾病或病状负担的测量是指定的。

在一些实施方式中，与其他方法相比较，本发明的方法提高了受试者的无事件生存率或总生存率。例如，在一些实施方式中，通过所述方法治疗的受试者在首剂量之后6个月的无事件生存率或概率大于大约40％、大于大约50％、大于大约60％、大于大约70％、大于大约80％、大于大约90％或者大于大约95％。在一些方面，总生存率大于大约40％、大于大约50％、大于大约60％、大于大约70％、大于大约80％、大于大约90％或者大于大约95％。在一些实施方式中，用所述方法治疗的受试者表现出至少大约6个月、至少大约1年、大约2年、大约3年、大约4年、大约5年、大约6年、大约7年、大约8年、大约9年或大约10年的无事件生存期、无复发生存期或生存期。在一些实施方式中，疾病进展时间得以改善，例如，疾病进展时间大于大约6个月、至少大约1年、大约2年、大约3年、大约4年、大约5年、大约6年、大约7年、大约8年、大约9年或大约10年。

在一些实施方式中，与其他方法相比较，通过所述方法治疗之后，复发概率降低。例如，在一些实施方式中，首剂量之后6个月的复发概率小于大约80％、小于大约70％、小于大约60％、小于大约50％、小于大约40％、小于大约30％、小于大约20％或者小于大约10％。

基因改造的细胞和细胞制造方法

在一些实施方式中，提供的方法涉及给予具有疾病或病状的受试者表达重组抗原受体的细胞。引入基因改造的组件例如重组受体例如car或tcr的多种方法是公知的，可以用于提供的方法和组合物中。示例性方法包括编码受体的核酸的转移，包括经由病毒例如逆转录病毒或慢病毒，以及转导、转座子和电穿孔。

在表达受体并通过提供的方法给予的细胞当中，有改造的细胞。基因改造通常涉及将编码重组体的核酸或改造的组件引入到含有细胞的组合物中，例如，通过逆转录病毒转导、转染或转化。

用于基因改造的载体和方法

在一些实施方式中，使用重组感染病毒颗粒，例如，例如源自猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、腺相关病毒(aav)的载体，将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方式中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体例如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移到t细胞中(参见，例如，koste等人.(2014)genetherapy2014apr3.doi:10.1038/gt.2014.25；carlens等人.(2000)exphematol28(10):1137-46；alonso-camino等人(2013)molthernuclacids2,e93；park等人,trendsbiotechnol.2011november29(11):550-557)。

在一些实施方式中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(ltr)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)、骨髓增殖性肉瘤病毒(mpsv)、鼠胚胎干细胞病毒(mesv)、鼠干细胞病毒(mscv)、脾病灶形成病毒(sffv)或腺相关病毒(aav)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方式中，逆转录病毒包括源自任何鸟类或哺乳动物细胞来源的病毒。逆转录病毒典型地是双嗜性的，意味着它们能够感染若干物种包括人的宿主细胞。在一实施方式中，要表达的基因代替逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了若干种说明性的逆转录病毒系统(例如，美国专利第5,219,740；6,207,453；5,219,740号；miller和rosman(1989)biotechniques7:980-990；miller,a.d.(1990)humangenetherapy1:5-14；scarpa等人(1991)virology180:849-852；burns等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:8033-8037；和boris-lawrie和temin(1993)cur.opin.genet.develop.3:102-109)。

慢病毒转导方法是已知的。示例性的方法描述于以下文献中：例如，wang等人(2012)j.immunother.35(9):689-701；cooper等人(2003)blood.101:1637-1644；verhoeyen等人(2009)methodsmolbiol.506:97-114；和cavalieri等人.(2003)blood.102(2):497-505。

在一些实施方式中，经由电穿孔将重组核酸转移到t细胞中(参见，例如，chicaybam等人,(2013)plosone8(3):e60298；和vantedeloo等人(2000)genetherapy7(16):1431-1437)。在一些实施方式中，经由转座将重组核酸转移到t细胞中(参见，例如，manuri等人.(2010)humgenether21(4):427-437；sharma等人.(2013)molecthernuclacids2,e74；和huang等人.(2009)methodsmolbiol506:115-126)。其他在免疫细胞中引入和表达基因材料的方法包括磷酸钙转染(例如，如currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork.n.y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒子轰击(johnston,nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶dna共沉淀(brash等人,mol.cellbiol.,7:2031-2034(1987))。

用于转移编码重组产物的核酸的方法和载体描述于以下文献中：例如，国际专利申请公开第wo2014055668号和美国专利第7,446,190号。

在一些实施方式中，可以在扩增过程中或者在其之后将细胞例如t细胞用t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)转染。例如，引入所需受体的基因的这种转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以从初始刺激物(例如，cd3/cd28刺激物)释放基因修饰的细胞群体，随后将其用第二类型的刺激物例如经由从头诱导的受体刺激。该第二类型的刺激物可以包括以下形式的抗原性刺激物：肽/mhc分子，基因引入的受体的同源(交联)配体(例如，天然car受体)或者任何(例如通过识别受体内的恒定区)直接结合在新受体框内的配体(例如抗体)。参见，例如，cheadle等人,"chimericantigenreceptorsfort-cellbasedtherapy"methodsmolbiol.2012；907:645-66或者barrett等人,chimericantigenreceptortherapyforcancerannualreviewofmedicinevol.65:333-347(2014)。

在一些情形中，可以使用不要求细胞例如t细胞被激活的载体。在一些这种情形中，可以在激活之前对细胞进行选择和/或转导。因此，可以在细胞培养之前或之后对细胞进行改造，在一些情形中，在培养的同时或者在至少一部分培养的过程中对细胞进行改造。

在额外的核酸当中，例如，用于引入的基因是例如通过提高转移的细胞的生存力和/或功能来提高治疗效力的基因；为细胞的选择和/或评价提供基因标记物的基因，例如，以在体内评价存活或定位；提高安全性的基因，例如，通过使细胞在体内对阴性选择易感，如以下文献所述：luptons.d.等人,mol.andcellbiol,11:6(1991)；和riddell等人,humangenetherapy3:319-338(1992)；另外参见lupton等人的ct/us91/08442和pct/us94/05601的公开，其说明了由将显性阳性选择标记物与阴性选择标记物融合得到双功能选择融合基因的用途。参见，例如，riddell等人,美国专利第6,040,177号，第14-17栏。

用于基因改造的细胞和细胞的制备

在一些实施方式中，核酸是异源性的，即，正常不存在于细胞或获自细胞的样品中，例如，获自另一有机体或细胞，例如，其通常不发现于被改造的细胞和/或这些细胞所源自的有机体中。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，例如，自然界不存在的核酸，其包括，包括编码来自多种不同细胞类型的不同结构域的核酸的嵌合组合的核酸。

细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，典型地为人细胞。在一些实施方式中，细胞来自于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，例如，先天或获得性免疫的细胞，例如，髓样细胞或淋巴样细胞，其包括淋巴细胞，典型地为t细胞和/或nk细胞。其他的示例性细胞包括干细胞，例如专能(multipotent)或多能干细胞，包括诱导的多能干细胞(ipsc)。细胞典型地是原代细胞，例如，直接分离自受试者和/或分离自受试者并冷冻的细胞。在一些实施方式中，细胞包括t细胞或其他细胞类型的一种或多种亚群，例如整个t细胞群体、cd4+细胞、cd8+细胞及其亚群，例如，通过功能、活化状态、成熟度、分化潜能、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌图谱和/或分化程度定义的亚群。参考要治疗的受试者，细胞可以是同种异体和/或自体的。上述方法当中包括现成的(off-the-shelf)方法。在一些方面，例如，对于现成的技术，细胞是多能和/或专能的，例如干细胞，例如诱导的多能干细胞(ipsc)。在一些实施方式中，上述方法包括从受试者中分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或改造，并在冷冻保存之前或之后将其再引入到相同受试者中。

在t细胞和/或cd4⁺和/或cd8⁺t细胞的亚型和亚群当中，有天然t(tn)细胞、效应t细胞(teff)、记忆t细胞及其亚型，例如干细胞记忆t(tscm)、中心记忆t(tcm)、效应记忆t(tem)或终末分化的效应记忆t细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(til)、不成熟t细胞、成熟t细胞、辅助t细胞、细胞毒性t细胞、黏膜相关的非变体t(mait)细胞、天然和获得性调节t(treg)细胞、辅助t细胞，例如th1细胞、th2细胞、th3细胞、th17细胞、th9细胞、th22细胞、滤泡性辅助t细胞、α/βt细胞和δ/γt细胞。

在一些实施方式中，细胞是自然杀伤(nk)细胞。在一些实施方式中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。

在一些实施方式中，细胞包括一种或多种经由基因改造引入的核酸，从而表达这些核酸的重组或基因改造产物。在一些实施方式中，核酸是异源性的，即，正常不存在于细胞或获自细胞的样品中，例如，获自另一有机体或细胞，例如，其通常并不见于被改造的细胞和/或这些细胞所源自的有机体中。在一些实施方式中，核酸不是天然存在的，例如，自然界不存在的核酸，其包括，包括编码来自多种不同细胞类型的不同结构域的核酸的嵌合组合的核酸。

在一些实施方式中，改造的细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体例如car的核酸的细胞可以从样品中分离，例如，生物样品，例如，获自或源自受试者的生物样品。在一些实施方式中，由其分离细胞的受试者是具有疾病或病状或者对细胞治疗有需求或者将要给予细胞治疗的受试者。在一些实施方式中，受试者是对特定治疗性干预有需求的人，上述干预例如，细胞被分离、处理和/或改造的过继细胞治疗。

因此，在一些实施方式中，细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。样品包括直接来自受试者的组织、液体或其他样品，以及从一个或多个处理步骤产生的样品，上述步骤例如分离、离心、基因改造(例如，用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育。生物样品可以是直接获自生物来源的样品或者被处理的样品。生物样品包括，但不限于，体液，例如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿和汗、组织和器官样品，包括由其得到的处理过的样品。

在一些方面，获得或分离细胞的来源样品是血液或源自血液的样品，或者，是或源自血液成分分离(apheresis)或白细胞去除术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(pbmc)、白血球、骨髓、胸腺、组织活检物、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠道相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳腺、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其得到的细胞。在细胞治疗例如过继细胞治疗的背景中，样品包括来自于自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方式中，细胞源自细胞系，例如，t细胞系。在一些实施方式中，细胞获自异种异体来源，例如，获自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。

在一些实施方式中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞洗涤、离心和/或在一种或多种试剂的存在下孵育，例如，以除去不希望的组分，富集所需的组分，溶解或除去对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性，例如密度、粘附特性、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性来分离细胞。

在一些例子中，例如，通过血液成分分离或白细胞去除术获得来自受试者循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，其包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他的有核白血球、红血球和/或血小板，在一些方面，含有红血球和血小板以外的细胞。

在一些实施方式中，将自受试者收集的血细胞洗涤，例如，以除去血浆部分，将细胞置于合适的缓冲液或介质中，用于后续处理步骤。在一些实施方式中，将细胞用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤。在一些实施方式中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或任意或所有二价阳离子。在一些方面，洗涤步骤使用半自动化“流通”离心法(例如，cobe2991细胞处理器，baxter)根据制造商说明书进行。在一些方面，洗涤步骤通过切向流动过滤(tff)根据制造商说明书进行。在一些实施方式中，洗涤之后，将细胞再悬浮在多种生物相容的缓冲液中，例如，如不含ca⁺⁺/mg⁺⁺的pbs。在某些实施方式中，除去血细胞样品的组分，将细胞直接再悬浮在培养基中。

在某些实施方式中，上述方法包括基于密度的细胞分离方法，例如通过将红血球溶解，并通过percoll或ficoll梯度进行离心，由外周血制备白血球。

在一些实施方式中，分离方法包括：基于细胞中一种或多种特异性分子例如表面标记物例如表面蛋白质、细胞内标记物或核酸的表达或存在，分离不同的细胞类型。在一些实施方式中，可以使用任何已知的基于这些标记物的分离方法。在一些实施方式中，分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于一种或多种标记物、典型地为细胞表面标记物的细胞表达或表达水平对细胞和细胞群体进行分离，例如，其通过以下方法进行：与特异性结合这些标记物的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤，以及将结合有抗体或结合配偶体的细胞与没有结合抗体或结合配偶体的细胞分离。

这些分离步骤可以基于阳性选择，其中结合有试剂的细胞得以保留，用于进一步使用，和/或基于阴性选择，其中没有结合抗体或结合配偶体的细胞得以保留。在一些例子中，两个部分均得以保留，用于进一步使用。在一些方面，当没有可用于在异源性群体中特异性识别细胞类型的抗体时，阴性选择可以是特别有用的，使得最好基于所需群体以外的细胞所表达的标记物进行分离。

分离不需要导致100％富集或除去特定的细胞群体或表达特定标记物的细胞。例如，阳性筛选或富集特定类型的细胞例如表达标记物的细胞是指，增加这些细胞的数量或百分含量，但不需要导致完全不存在不表达标记物的细胞。类似地，阴性选择、除去或耗尽特定类型的细胞例如表达标记物的细胞，是指降低这些细胞的数量或百分含量，但不需要导致完全除去所有这些细胞。

在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中对来自一步骤的阳性或阴性选择的部分进行另一分离步骤，例如后续的阳性或阴性选择。在一些例子中，单一分离步骤可以同时耗尽表达多种标记物的细胞，例如，通过将细胞与多种抗体或结合配偶体一起孵育，其每一种均对阴性选择靶向的标记物具有特异性。类似地，通过将细胞与多种在不同细胞类型上表达的抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时对多种细胞类型同时进行阳性选择。

例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术分离特定的t细胞亚群，例如，一种或多种表面标记物阳性或将其高水平表达的细胞，例如，cd28⁺、cd62l⁺、ccr7⁺、cd27⁺、cd127⁺、cd4⁺、cd8⁺、cd45ra⁺、和/或cd45ro⁺t细胞。

例如，可以使用cd3/cd28缀合的磁珠对cd3⁺、cd28⁺t细胞进行阳性选择(例如，m-450cd3/cd28t细胞扩增器)。

在一些实施方式中，通过阳性选择富集特定类型的细胞群体，或者通过阴性选择耗尽特定类型的细胞群体，进行分离。在一些实施方式中，通过将细胞同一种或多种抗体或其他结合试剂一起孵育进行阳性或阴性选择，上述抗体或其他结合试剂与一种或多种分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记物⁺)或者以相对较高的水平(标记物^高)表达的表面标记物特异性结合。

在一些实施方式中，通过对在非t细胞例如b细胞、单核细胞或其他白血球上表达的标记物例如cd14的阴性选择，从pbmc样品中分离t细胞。在一些方面，使用cd4⁺或cd8⁺分离步骤分离cd4⁺辅助和cd8⁺细胞毒性t细胞。通过对在一种或多种天然、记忆和/或效应t细胞亚群上表达或以相对较高的程度表达的标记物的阳性或阴性选择，可以将这些cd4⁺和cd8⁺细胞进一步分类成亚群。

在一些实施方式中，例如，通过基于与各个亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将cd8⁺细胞进一步富集或耗尽天然、中心记忆、效应记忆和/或中心记忆干细胞。在一些实施方式中，进行中心记忆t(tcm)细胞的富集，以增加效力，例如，改善给药之后的长期生存期、扩增和/或植入，在一些方面，其在这些亚群中特别强健。参见terakura等人.(2012)blood.1:72-82；wang等人.(2012)jimmunother.35(9):689-701。在一些实施方式中，将tcm-富集的cd8⁺t细胞和cd4⁺t细胞组合进一步提高了效力。

在实施方式中，cd8⁺外周血淋巴细胞的cd62l⁺和cd62l^-两种亚型中均存在有记忆t细胞。例如，使用抗-cd8和抗-cd62l抗体，可以对pbmc富集或耗尽cd62l^-cd8⁺和/或cd62l⁺cd8⁺部分。

在一些实施方式中，富集中心记忆t(tcm)细胞是基于cd45ro、cd62l、ccr7、cd28、cd3和/或cd127的阳性或高表面表达；在一些方面，其基于表达或高度表达cd45ra和/或颗粒酶b的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达cd4、cd14、cd45ra的细胞的耗尽，和表达cd62l的细胞的阳性选择或富集，进行富集tcm细胞的cd8⁺群体的分离。一方面，以基于cd4表达选择的阴性部分细胞开始，对其进行基于cd14和cd45ra表达的阴性选择，以及基于cd62l的阳性选择，进行中心记忆t(tcm)细胞的富集。在一些方面，这些选择同时进行，在其它方面，这些选择以任一顺序依次进行。在一些方面，相同的基于cd4表达的选择步骤用于制备cd8⁺细胞群体或亚群，也用于产生cd4⁺细胞群体或亚群，使得来自基于cd4分离的阳性和阴性部分均加以保留，并用于该方法的后续步骤中，任选地其在一个或多个进一步的阳性或阴性选择步骤之后。

在具体的例子中，对pbmc样品或其他白血球样品进行cd4⁺细胞的选择，其中阴性和阳性部分均加以保留。然后对阴性部分进行基于cd14和cd45ra或cd19表达的阴性选择，以及基于中心记忆t细胞标记物特征例如cd62l或ccr7的阳性选择，其中以任一顺序进行阳性和阴性的选择。

通过识别具有细胞表面抗原的细胞群体，将cd4⁺t辅助细胞分选成天然、中心记忆和效应细胞。cd4⁺淋巴细胞可以通过标准方法得到。在一些实施方式中，天然cd4⁺t淋巴细胞为cd45ro^-、cd45ra⁺、cd62l⁺、cd4⁺t细胞。在一些实施方式中，中心记忆cd4⁺细胞为cd62l⁺和cd45ro⁺。在一些实施方式中，效应cd4⁺细胞为cd62l^-和cd45ro^-。

在一例子中，为了通过阴性选择富集cd4⁺细胞，单克隆抗体混合物典型地包括cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在一些实施方式中，抗体或结合配偶体与固体支持物或基质结合，例如磁珠或顺磁珠，以使得细胞出于阳性和/或阴性选择而分离。例如，在一些实施方式中，使用免疫磁性(或亲和力磁性)分离技术来分隔或分离细胞和细胞群体(综述见methodsinmolecularmedicine,vol.58:metastasisresearchprotocols,vol.2:cellbehaviorinvitroandinvivo,p17-25,s.a.brooks和u.schumacher编著,humanapressinc.,totowa,nj)。

在一些方面，将要分离的细胞样品或组合物与小的可磁化或磁响应性材料例如磁响应性颗粒或微粒例如顺磁珠(例如，如dynalbeads或macs珠)一起孵育。磁响应性材料例如颗粒通常与结合配偶体例如与分子特异性结合的抗体直接或间接连接，上述分子例如希望分离的细胞、多种细胞或细胞群体例如希望进行阴性或阳性选择的细胞上存在的表面标记物。

在一些实施方式中，磁性颗粒或磁珠包括与特异性结合成员例如抗体或其他结合配偶体结合的磁响应性材料。有许多种公知的磁分离方法中使用的磁响应性材料。合适的磁性颗粒包括molday的美国专利第4,452,773号和欧洲专利说明书ep452342b中所述者，在此将其并入作为参考。其他例子有胶体大小的颗粒，例如owen的美国专利第4,795,698号中的那些，liberti等人的美国专利第5,200,084号是其它实例。

孵育通常在以下条件下进行：抗体或结合配偶体或分子例如与这些抗体或结合配偶体特异性结合的第二抗体或其他试剂与磁性颗粒或磁珠连接，特异性地结合样品中细胞上(如果存在)的细胞表面分子。

在一些方面，将样品置于磁场中，其上连接有磁响应性或可磁化颗粒的细胞将会与磁体结合，并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，磁体上吸引的细胞得以保留；对于阴性选择，未吸引的细胞(未标记细胞)得以保留。在一些方面，在同一选择步骤中进行阳性和阴性选择的结合，其中保留阳性部分和阴性部分，并进一步处理或进行进一步分离步骤。

在某些实施方式中，磁响应性颗粒包覆在初级抗体或其他结合配偶体、第二抗体、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方式中，磁性颗粒经由对一种或多种标记物具有特异性的初级抗体的覆层与细胞连接。在某些实施方式中，将细胞(而不是磁珠)用初级抗体或结合配偶体标记，然后加入细胞类型特异性的第二抗体或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包覆的磁性颗粒。在某些实施方式中，链霉亲和素包覆的磁性颗粒与生物素化的初级或第二抗体结合使用。

在一些实施方式中，磁响应性颗粒保留连接到后续要被孵育、培养和/并改造的细胞；在一些方面，保留颗粒与用于给予患者的细胞连接。在一些实施方式中，将可磁化或磁响应性颗粒从细胞中除去。从细胞中除去可磁化颗粒的方法是已知的，其包括，例如，使用竞争性非标记抗体，和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方式中，可磁化颗粒是可生物降解的。

在一些实施方式中，基于亲和力的选择经由磁性活化的细胞分选(macs)(miltenyibiotech,auburn,ca)。磁性活化的细胞分选系统(macs)能够高纯度地选择其上连接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方式中，macs以如下方式工作：其中在应用外部磁场之后，非目标和目标物种依次洗脱。即，与磁化颗粒连接的细胞保持在原位，而洗脱出未连接的物种。然后，在该第一洗脱步骤完成之后，将捕获在磁场中并防止被洗脱的物种以使得其得以洗脱和回收的一定方式释放。在某些实施方式中，将非目标细胞标记，并从异源性细胞群体中耗尽。

在某些实施方式中，使用进行所述方法的一个或多个分离、细胞制备、分隔、处理、孵育、培养和/或配置步骤的系统、装置或设备，进行分离或分隔。在一些方面，系统用于在封闭或无菌的环境中进行这些步骤中的每一步，例如，以使误差、用户处理和/或污染最小化。在一例子中，系统是如国际专利申请公开号wo2009/072003或us20110003380a1中所述的系统。

在一些方面，系统或设备用于在整合或独立式系统中，和/或以自动化或可编程方式，进行分离、处理、改造和配制步骤中的一个或多个，例如全部。在一些方面，系统或装置包括与系统或装置通讯的计算机和/或计算机程序，其允许用户对处理、分离、改造和配制步骤的结果进行编程、控制、评价，和/或对其各个方面进行调节。

在一些方面，分离和/或其他步骤使用clinimacs系统(miltenyibiotic)进行，例如，用于在封闭无菌的系统中在临床级水平上进行细胞的自动化分离。组件可以包括集成的微计算机、磁性分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成的计算机控制仪器的所有部件，并指导系统以标准化顺序进行重复过程。在一些方面，磁性分离单元包括可移动永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵通过管道组控制流速，并与夹管阀一起保证通过系统的缓冲液的受控流和持续的细胞悬液。

在一些方面，clinimacs系统使用在无菌、无热源的溶液中提供的抗体偶联的可磁化颗粒。在一些实施方式中，将细胞用磁性颗粒标记之后，洗涤细胞，除去过量颗粒。然后将细胞制备袋与管道组连接，该管道组进而与含有缓冲液的袋子和细胞收集袋连接。管道组由预组装的无菌管道组成，其包括预柱和分离柱，并仅用于单次使用。开始分离程序之后，系统自动化地将细胞样品应用于分离柱。标记的细胞保留在柱内，而非标记的细胞通过一系列洗涤步骤除去。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群体是未标记的，不保留在柱中。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群体是标记的，并保留在柱中。在一些实施方式中，用于本文所述方法的细胞群体在撤去磁场之后从柱中洗脱，并收集在细胞收集袋内。

在某些实施方式中，分离和/或其他步骤使用clinimacsprodigy系统(miltenyibiotec)进行。在一些方面，clinimacsprodigy系统装有细胞处理单元，其允许通过离心进行细胞的自动洗涤和分级。clinimacsprodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过分辨源细胞产物的肉眼可见层确定最优的细胞分级终点。例如，将外周血自动分离成红细胞、白血球和血浆层。clinimacsprodigy系统还可以包括集成的细胞培养室，其实现细胞培养方案，例如，如细胞分化和增殖、抗原负荷和长期细胞培养。输入端口可以允许进行培养基的无菌除去和补充，细胞可以使用集成的显微镜监测。参见，例如，klebanoff等人.(2012)jimmunother.35(9):651-660；terakura等人.(2012)blood.1:72-82；和wang等人.(2012)jimmunother.35(9):689-701。

在一些实施方式中，本文所述的细胞群体经由流式细胞术收集和富集(或耗尽)，其中对于多种细胞表面标记物进行染色的细胞携带在射流性液流(fluidicstream)中。在一些实施方式中，本文所述的细胞群体经由制备级(facs)-分选收集并富集(或耗尽)。在某些实施方式中，本文所述的细胞群体通过结合基于facs的检测系统使用微电机系统(mems)芯片收集并富集(或耗尽)(参见，例如，wo2010/033140；cho等人.(2010)labchip10,1567-1573；和godin等人.(2008)jbiophoton.1(5):355-376)。在两种情形中，可以将细胞用多种标记物标记，允许高纯度地分离定义明确的t细胞亚型。

在一些实施方式中，将抗体或结合配偶体用一种或多种可检测标记物标记，以有利于用于阳性和/或阴性选择的分离。例如，分离可以是基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记物有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合进行的细胞分离，在射流性液流中进行，例如，通过荧光激活的细胞分选(facs)，其包括制备级(facs)和/或微电机系统(mems)芯片，例如与流式细胞术检测系统结合。这些方法允许同时基于多种标记物进行阳性和阴性选择。

在一些实施方式中，制备方法包括在分离、孵育和/或改造之前或之后对细胞进行冷冻的步骤，例如，冷冻储藏。在一些实施方式中，冷冻和随后的解冻步骤除去粒细胞，并在一定程度上除去细胞群体中的单核细胞。在一些实施方式中，例如，在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中，以除去血浆和血小板。在一些方面，可以使用许多种已知的冷冻溶液和参数中的任意者。一个例子涉及使用含有20％dmso和8％人血清白蛋白(hsa)的pbs或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其与培养基1:1稀释，使得dmso和hsa的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80℃，并保存在液氮储罐的蒸汽相中。

在一些实施方式中，在基因改造之前或者与其结合，将细胞孵育和/或培养。孵育步骤可以包括培养(culture)、培育(cultivation)、刺激、活化和/或繁殖。孵育和/或改造可以在培养容器中进行，例如，单位、室、孔、柱、管、管道组、阀门、小瓶、培养皿、袋或其他用于细胞培养的容器。在一些实施方式中，将组合物或细胞在刺激条件或刺激试剂的存在下孵育。这些条件包括设计成诱导群体中细胞增殖、扩增、激活和/或存活，以模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因改造例如引入重组抗原受体的那些条件。

条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、试剂，例如营养物、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子，例如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白质、重组可溶性受体和任何其他设计成激活细胞的试剂。

在一些实施方式中，刺激条件或试剂包括一种或多种试剂，例如，能够激活tcr复合物的细胞内信号传导结构域的配体。在一些方面，试剂开启或引发t细胞中的tcr/cd3细胞内信号传导级联。这些试剂可以包括抗体，例如，对tcr组件和/或共刺激受体有特异性的抗体，例如，抗-cd3、抗-cd28，其与固体载体如珠子和/或一种或多种细胞因子结合。任选地，扩增方法还可以包括(例如，以至少大约0.5ng/ml的浓度)向培养基中加入抗-cd3和/或抗cd28抗体的步骤。在一些实施方式中，刺激试剂包括il-2和/或il-15，例如，il-2浓度为至少大约10单位/ml。

在一些方面，孵育根据以下文献中所述的技术进行：riddell等人的美国专利第6,040,177号；klebanoff等人.(2012)jimmunother.35(9):651-660；terakura等人(2012)blood.1:72-82；和/或wang等人.(2012)jimmunother.35(9):689-701。

在一些实施方式中，t细胞通过下方法增殖：向培养引发组合物中加入饲养细胞，例如不分裂的外周血单核细胞(pbmc)(例如，使得对于要增殖的初始群体中的每个t淋巴细胞，产生的细胞群体含有至少大约5、10、20或40或更多的pbmc饲养细胞)；和孵育培养物(例如，时间足够长，以使t细胞的数量扩大)。在一些方面，不分裂的饲养细胞可以包括γ-辐照的pbmc饲养细胞。在一些实施方式中，pbmc用范围大约3000-3600拉德的γ射线辐照，以防止细胞分裂。在一些方面，在加入t细胞群体之前，向培养基中加入饲养细胞。

在一些实施方式中，刺激条件包括适合于人t淋巴细胞生长的温度，例如，至少大约25℃，通常为至少大约30℃，通常为大约37℃。

任选地，孵育还可以包括加入不分裂的ebv-转化的淋巴母细胞样细胞(lcl)作为饲养细胞。lcl可以用范围大约6000-10,000拉德的γ射线辐照。在一些方面，lcl饲养细胞可以任何适当的量提供，例如，lcl饲养细胞与初始t淋巴细胞的比例为至少大约10:1。

在实施方式中，通过将天然或抗原特异性t淋巴细胞用抗原刺激，得到抗原特异性t细胞，例如抗原特异性cd4+和/或cd8+t细胞。例如，通过从感染的受试者中分离出t细胞，并在体外用相同抗原刺激细胞，可以产生针对巨细胞病毒抗原的抗原特异性t细胞系或克隆。

组合物和制剂

在一些实施方式中，提供包括用重组抗原受体例如car或tcr改造的细胞的细胞剂作为组合物或制剂，例如药物组合物或制剂。这些组合物可以根据提供的方法使用，例如用于预防或治疗疾病、病状和病症，或者用于检测、诊断和预防方法。

术语“药物制剂”是指其形式使得其中含有的活性成分的生物活性有效、并且不含额外的对将会给予制剂的受试者来说不可接受的毒性的额外组分的制剂。

“药学可接受载体”是指药物制剂中活性成分以外的成分，其对于受试者无毒性。药学可接受载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面，载体的选择部分地取决于具体的细胞或试剂和/或取决于给药方法。因此，存在有许多种合适的制剂。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括，例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以全部组合物的大约0.0001wt％至大约2wt％的量存在。例如，载体描述于remington'spharmaceuticalsciences16thedition,osol,a.ed.(1980)中。药学上可接受的载体通常在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，其包括，但不限于：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于大约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，其包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；形成盐的反离子，例如钠；金属复合物(例如，zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如聚乙二醇(peg)。

在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括，例如，柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和多种其他的酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以全部组合物大约0.001wt％至大约4wt％的量存在。制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于以下文献中：例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,lippincottwilliams&wilkins；21sted.(may1,2005)。

制剂或组合物还可以含有多于一种的用于采用细胞或试剂进行预防或治疗的特定适应症、疾病或病状的活性成分，其中各个活性彼此之间没有不利影响。这些活性成分适当地以对于预期目的有效的量的组合存在。因此，在一些实施方式中，药物组合物还包括其他的药物活性药剂或药物，例如化疗药剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、氨甲蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春花碱、长春新碱等。在一些实施方式中，药剂或细胞以盐例如药学可接受的盐的形式给予。合适的药学可接受的酸加成盐包括衍生自以下酸的盐：无机酸，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸；和有机酸，例如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如，对甲苯磺酸。

活性成分可以包埋在微胶囊中，胶体药物释放系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中，或者粗乳液中。在某些实施方式中，药物组合物配制成包合物，例如环糊精包合物复合物，或者配制成脂质体。脂质体可以起到将药剂或宿主细胞(例如t-细胞或k细胞)靶向特定组织的作用。制备脂质体可以有许多种方法，例如，如以下文献中所述者：szoka等人.,ann.rev.biophys.bioeng.,9:467(1980)和美国专利第4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369号。

在一些方面，药物组合物可以使用时间释放、延迟释放和持续释放递送系统，使得组合物的递送在要治疗的部位敏化之前发生，并有足够的时间导致敏化。许多种类型的释放递送系统是有效和已知的。这些系统可以避免组合物的反复给予，从而增加受试者和医师的便利性。

在一些实施方式中，药物组合物以有效治疗或预防疾病或病状的量、例如治疗有效量或预防有效量含有药剂或细胞。在一些实施方式中，治疗或预防效力通过对被治疗受试者的定期评价检测。对于在若干天或更长时间内重复给药，取决于条件，重复治疗，直至发生所需的疾病症状的抑制。但是，也可使用，并可以确定其他的剂量方案。要求的剂量可以通过组合物的单次大剂量灌注给药、通过组合物的多次大剂量灌注给药或者通过组合物的连续灌注给药来递送。

药剂或细胞可以通过任何适当的方式给予，通过大量输注(bolusinfusion)，通过注射，例如，静脉或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔(trans-septal)注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、subconjectval注射、结膜下注射、眼球筋膜下(sub-tenon's)注射、眼球后注射、眼球周注射或后巩膜旁递送。在一些实施方式中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给药，如果需要局部治疗，则通过病灶内给药。肠胃外注射包括肌肉内、静脉内、动脉内注射、腹膜内或皮下给药。在一些实施方式中，通过单次大剂量推注细胞或药剂来给予指定的剂量。在一些实施方式中，将其通过细胞或药剂的多次大量输注给药例如在不超过3天的时间内或者通过细胞或药剂的连续输注给药来给予。

对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可以取决于要治疗的疾病的类型、药剂或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、出于预防性还是治疗性目的而给予药剂或细胞、在先的治疗、受试者的病史和对药剂或细胞的应答以及由主治医师决定。在一些实施方式中，一次地或者在一系列治疗中将组合物适当地给予受试者。

可以使用标准给药技术、制剂和/或装置给予细胞或药剂。提供制剂和装置，例如注射器和小瓶，用于组合物的存储和给药。对于细胞，给药可以是自体的或异源的。例如，免疫反应细胞或祖细胞可以获自一受试者，并给予相同受试者或者不同、相容的受试者。源自外周血的免疫反应细胞或其子代(例如，体内、离体或体外获得)可以经由局部注射给予，其包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当给予药物组合物时(例如，含有治疗或减轻神经毒性症状的基因改造的免疫反应细胞或药剂的药物组合物)，通常将其配置成可注射形式(溶液、悬液、乳液)的单位剂型。

制剂包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、经皮、肌内、鼻内、颊含、舌下或栓剂给药的制剂。在一些实施方式中，将药剂或细胞群体肠胃外给药。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内给药。在一些实施方式中，使用肠胃外全身递送通过静脉内、腹膜内或皮下注射将药剂或细胞群体给予受试者。

在一些实施方式中，将组合物提供成无菌液体制剂，例如等渗水溶液、悬液、乳液、分散液或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的ph。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物多少更便于给药，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当粘度范围内配置，以提供更长的与特定组织接触的时间。液体或粘性组合物可以包括载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其适当混合物。

通过将药剂或细胞引入到溶剂中，例如与适当的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合，可以制备无菌可注射溶液。组合物还可以是冻干的。取决于给药的路径和要求的制剂，组合物可以含有辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、凝胶化或粘度增强添加剂、防腐剂、风味剂、着色剂等。在一些方面，可以查阅标准文本制备适当的制剂。

可以加入许多种提高组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保预防微生物的作用。通过使用延迟吸收的药剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射药物形式的延迟吸收。

可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，上述基质是成型制品例如膜或微胶囊的形式。

要用于体内给药的制剂通常是无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤，可以容易地实现无菌性。

试剂盒

另外提供制品，例如试剂盒，其含有根据所提供实施方式中任意者、例如所述制剂或组合物中任意者的一个或多个细胞剂量(其可以存在于一个或多个容器中，例如袋子或小瓶，细胞的数量或浓度足以用于单个剂量或其一部分的给药)，以及说明书和/或包装材料或者具有用于根据本文所提供方法给药的指示的文献。在一些方面，说明书示出任意所述实施方式的警告或禁忌。

定义

术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物，并不限定最小长度。包括所提供的受体和其他多肽例如接头或肽在内的多肽可以包括氨基酸残基，其包括天然和/或非天然氨基酸残基。术语还包括多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，多肽可以相对于天然或自然序列含有修饰，只要蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变，或者可以是偶然的，例如，通过产生蛋白质的宿主的突变或者由于pcr扩增产生的错误。

如本文所用，“受试者”是哺乳动物，例如人或其他动物，典型地为人。在一些实施方式中，对其给予药剂或多种药剂、细胞、细胞群体或组合物的受试者例如患者是哺乳动物，典型地为灵长类动物，例如人。在一些实施方式中，灵长类动物是猴或猿。受试者可以是雄性或雌性，可以是任何适当的年龄，例如婴儿、少年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方式中，受试者是非灵长类哺乳动物，例如啮齿动物。

如本文所用，“治疗”(及其语法变形例如“治疗的”或“治疗性”)是指疾病或病状或病症或症状、副作用或结果或其相关表型的完全或部分减轻或降低。所需的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发，减轻症状，消除疾病的任何直接或间接病理结果，预防转移，降低疾病进展速度，改善或缓解疾病状态，以及缓解或改善预后。该术语并不意味着疾病的完全治愈或者所有症状或结果方面任何症状或影响的完全消除。

如本文所用，“延缓疾病发展”是指推迟、阻碍、延缓、延迟、稳定、抑制和/或延迟疾病(例如癌症)的发展。这种延迟可以是不同的时间长度，其取决于疾史和/或被治疗的个体。对本领域技术人员来说，明显的是，足够或显著的延迟实际上可以包括预防，因为个体不会发展出疾病。例如，可以延缓晚期癌症，如转移的发展。

如本文所用，“预防”包括对于受试者中疾病的发生或复发提供预防，上述受试者可能易患疾病、但尚未诊断出疾病。在一些实施方式中，使用提供的细胞和组合物延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。

如本文所用，“抑制”功能或活动是指，在与除所关注的条件或参数以外其他条件相同时相比较，或者另外可选地，与另一条件相比较，功能或活性降低。例如，与不存在细胞的情况下肿瘤的生长速度相比较，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速度。

在给药的情形中，药剂例如药物制剂、细胞或组合物的“有效量”是指在一段时间有效实现期望效果例如治疗或预防结果所需的在剂量/数量上的量。

药剂例如药物制剂或细胞的“治疗有效量”是指在一段时间有效实现期望的治疗效果例如疾病、病状或病症的治疗和/或治疗的药代动力学或药效作用所需的剂量上的量。治疗有效量可以根据多种因素变化，例如疾病状态、年龄、性别和受试者体重以及给予的细胞群体。在一些实施方式中，提供的方法涉及以有效的量例如治疗有效的量给予细胞和/或组合物。

“预防有效量”是指在一段时间有效实现期望的预防效果所需的剂量上的量。典型地，但并非必需地，由于预防性剂量用于疾病之前或疾病早期的受试者，预防有效量将小于治疗有效量。在肿瘤负荷较低的情形中，在一些方面，预防有效量将会高于治疗有效量。

如本文所用，术语“大约”是指本领域技术人员很容易知晓的各个数值的通常误差范围。在本文中，提到“大约”一数值或参数包括(并描述)了涉及该数值或参数自身的实施方式。例如，根据本领域实际情况，“大约”可以表示3或3以上的标准偏差。此外，“大约”可以指给定数值的以下范围：至多20％，优选至多10％，更优选至多5％，再更优选至多1％。另外可选地，具体地关于生物系统或过程，该术语可以指在数值的数量级内，优选地，5倍内，更优选2倍内。

如本文所用，除非上下文明确另有规定，单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数指称。例如，“一”或“一种”表示“至少一种”或“一种或多种”。

在整个公开内容中，要求保护的主题的各个方面均以范围形式表示。应当理解到，范围形式的说明仅仅是为了方便和简洁，而不应解释成对要求保护的主题的范围的僵化限定。因此，对范围的描述应当视作具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，当提供数值范围时，应当理解到，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及所述范围内的任何所述或中间值均包括在要求保护的主题中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，也包括在要求保护的主题内，但须受所述范围内任何明确的排除所限。当所述范围包括一项或两项限制时，排除一项或两项所包括限制的范围也包括在要求保护的主题内。这无论范围多宽均适用。

如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物包括细胞的任意混合物。它可以是含水或不含水的溶液、悬液、液体、粉末、糊剂或其任意组合。

如本文所用，当涉及到一种或多种具体的细胞类型或细胞群体时，“富集”是指，例如相对于组合物中细胞的总数量或者组合物的体积，或者相对于其他细胞类型，所述细胞类型或群体的数量或百分含量增加，其通过以下方法实现：例如，基于群体或细胞表达的标记物的阳性选择，或者基于要耗尽的细胞群体或细胞上不存在的标记物的阴性选择。该术语不要求从组合物中完全除去其他的细胞、细胞类型或群体，并且不要求在富集的组合物中细胞富集成接近100％地存在。

如本文所用，描述细胞或细胞群体对于特定的标记物呈“阳性”，是指在细胞上或细胞中可检测到地存在特定的标记物，典型地为表面标记物。当提到表面标记物时，该术语是指通过流式细胞术检测时表面表达存在，例如，通过用特异性结合标记物的抗体进行染色，并检测所述抗体，其中在以下情形中通过流式细胞术可检测到染色：水平基本上高于在其他均相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(fluorescenceminusone，fmo)门控对照时进行相同方法而检测到的染色，和/或水平基本上类似于已知对标记物呈阳性的细胞，和/或水平基本上高于已知对标记物呈阴性的细胞。

如本文所用，描述细胞或细胞群体对于特定的标记物呈“阴性”，是指在细胞上或细胞中不存在有基本上可检测的特定标记物，典型地为表面标记物。当提到表面标记物时，该术语是指通过流式细胞术检测时表面表达不存在，例如，通过用特异性结合标记物的抗体进行染色，并检测所述抗体，其中在以下情形中通过流式细胞术没有检测到染色：水平基本上高于在其他均相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(fmo)门控对照时进行相同方法而检测到的染色，和/或水平基本上低于已知对标记物呈阳性的细胞，和/或与已知对标记物呈阴性的细胞向比较水平基本上类似。

如本文所用，术语“载体”是指能够使与之连接的另一核酸增殖的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及并入到其被导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。这些载体在本文中被称作是“表达载体”。

除非另外定义，本文使用的所有技术术语、符号和其他科技术语或命名法均要与要求保护的主题所涉及领域的普通技术人员通常理解的含义相同。在一些情形中，在本文中出于清楚和/或出于易于引用对具有通常理解含义的术语加以定义，在本文中包含这些定义不应当必然理解成代表与本领域通常理解的具有大的差异。

出于所有目的将本申请中提到的所有出版物包括专利文件、科学文章和数据库均全文并入作为参考，其程度如同将每个单独的出版物单独地并入作为参考。如果本文所述的定义与在此作为参考并入的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或不相符，则对于在此引入作为参考的定义，以本文所述的定义为准。

本文所用的小节标题仅出于条理目的，而不应理解成对所描述的主题进行限定。

实施例

仅出于说明目的包括以下实施例，其无意于对本发明的范围加以限定。

本发明无意被局限于例如为说明本发明各个方面而提供的具体公开的实施方式的范围。从本文的说明和教导，对所描述组合物和方法的各种修改将会是显而易见的。这些变化可以在不偏离本公开内容真实范围和精神的情况下加以实施，其均要落入本公开内容的范围内。

实施例1：在具有复发性、难治性b-细胞all的成年患者中给予cd19-靶向car修饰的t细胞

将具有复发性、难治性cd19⁺b-细胞急性成淋巴细胞性白血病(b-all)的成年患者用表达抗-cd19嵌合抗原受体(car)的t细胞治疗。简言之，进行白细胞去除术，从来自患者的外周血单核细胞(pbmc)样品富集t细胞。将这些细胞用编码cd19car表达组件(19-28z；包括抗-cd19scfv、人cd28的细胞外、跨膜和胞质部分和cd3ζ信号传导结构域)的逆转录病毒载体转导。选择进行治疗的患者年龄至少18岁，患有复发性、难治性cd19⁺b-all(在同种异体造血干细胞移植(hsct)之后复发和/或允许单独的骨髓外疾病)。如果个体患有以下疾病则被排除：任何活跃中枢神经系统(cns)疾病、表现出需要免疫抑制剂的活跃移植物抗宿主疾病或严重的心脏病(例如，6个月内患心肌梗死或射血分数高于40％的患者)。在输注car-t细胞之前2天给予调节化疗(通常以1x10⁶或3x10⁶表达car的细胞/kg的至少一剂量给予)。在输注后第28-35天对疾病进行评价。在一些情形中，受试者在输注后大约第14天接受第二剂量。

跟进一个月以上，被治疗的五十一(51)名患者当中五十(50)名具有反应评价价值(所有51名均具有毒性评价价值)。在t细胞输注之前，评价每名患者的疾病负担。三十一(31)名患者具有形态学病变(骨髓中至少5％母细胞)，而二十(20)名患者具有微小病变(骨髓中小于5％母细胞)。跟进一个月以上有反应评价价值的50名患者当中，29名(58％)接受6个月或更长时间的跟进评价，17名(34％)接受1年或更长时间的跟进评价。这些受试者的基线患者特性如表1所示。

表1

几乎百分之五十(48％)的形态学病变队列有过4或更多的在先线治疗；36％接受过在先的博纳吐单抗治疗(cd19-靶向治疗)。

可评价患者的完全缓解(cr)率、微小残余病变(mrd)-阴性(mrd-)率和cr平均时间显示于表2中(对于单独的队列包括基线疾病负担(形态学病变(30)和微小病变(20))。各个其他小组的cr率显示于图1中。

表2

*微小残余病变(mrd)评价在2名患者中无法进行。

在19-28zcart细胞输注治疗之后，41名达到cr的患者中16名(39％)在实现cr之后进行同种异体hsct。这16名患者中9名(39％)在基线状态具有形态学病变，7名在基线状态具有微小病变。在进行同种异体hsct的16名患者当中，14名没有接受过在先hsct，2名接受过在先hsct。

在33名mrd-阴性cr患者当中，15名(45％)复发，而9名(21％)保持无疾病1年以上。4名(27％)复发患者中的疾病确定为cd19-阴性或cd19-不可检测的。

通过基线疾病负担分组的所有患者的总生存期反映在图2中。通过基线疾病负担分组的mrd-cr患者的总生存期反映在图3中。通过基线疾病负担和car-t后hsct而分组的患者总生存期显示在图4中。

通过qpcr和流式细胞术测量外周血(pb)和骨髓(bm)中的car-改造的t细胞。在输注后第7-14天检测到最大t细胞扩增，其与细胞因子释放综合症(crs)的发生相关。t细胞输注之后t细胞坚持了1-6个月，如通过qpcr所测量。

观察到的不良事件包括crs(例如，发热、低血压和呼吸功能不全)、神经变化(例如，精神错乱、全球脑病、失语症、癫痫和癫痫样活动)。在大多数患者中，神经症状是可逆的；神经毒性可以独立于crs而发生。该实施例中使用的crs分级系统总结于表3中。已知且可以使用其他分级系统，例如，如lee等人,blood.2014；124(2):188-95所述的系统，和/或如表3a所总结。通过基线疾病负担分组的患者中的crs和神经毒性显示于表4中。在该研究中使用托珠单抗(tocilizumab)和/或类固醇治疗毒性对无复发生存期(rfs)没有影响。

表3

严重crs＝3或4级crs

表3a

表4

**所有患者均接受较高的剂量(3x10⁶cart细胞/kg)：2名患者具有败血症/多器官衰竭；1名患者癫痫，死因未知。

在该研究中，在评价的患者当中，观察到77-90％的cr率和68-70％的mrd-阴性cr率。在形态学和微小病变两个队列中，在没有后续同种异体hsct的患者小组中均观察到持久的响应和生存率。与形态学基线疾病负担队列相比较，具有基线微小病变的患者没有表现出严重crs，并且观察到神经毒性率较低。