用于减少干扰素水平的化合物的制作方法

本发明涉及用于降低个体中干扰素(ifn)水平的cxcr4受体结合化合物。
背景技术：
：干扰素(ifn)介导针对病毒感染的免疫防御。然而，遗传或获得性的ifn的过量产生导致高ifn水平，这可能是各种疾病的原因，例如自身免疫疾病或干扰素病(interferonopothy)，其特别包括aicardi-goutières综合征、家族性冻疮样狼疮、椎骨内生软骨瘤病(spondyenchondromatosis)、蛋白酶体相关的自身炎症综合征(prass)和辛-梅综合征。干扰素病的当前治疗主要是症状性的并且基于糖皮质激素(munoz等人(2015)annalesdedermatologieetdevénérologie142:653-663)。此外，作为对肾上腺皮质激素的补充，物理疗法和心理护理是预防这些疾病的一个主要部分。然而，基于肾上腺皮质激素的治疗有几种副作用，如体重增加、激素紊乱、高血压、儿童生长迟缓、消化功能紊乱、睡眠障碍或情绪障碍。更一般地，目前可用于干扰素病的治疗主要旨在缓解症状而不是治疗疾病的潜在原因并且不能维持持久的缓解。因此，需要这些疗法的替代方案，其除了治疗症状外，这些疗法对于有效治愈干扰素病也是有效的。技术实现要素：本发明源于本发明人意想不到的发现，即胺在体外和在感染了甲型流感的小鼠模型中在体内抑制了通过病毒刺激的浆细胞样树突细胞(pdc)产生的干扰素(ifn)。类似地，本发明人已经表明，这种抑制作用可以扩展到单核细胞、自然杀伤(nk)细胞以及其他细胞因子，例如tnf-α，或白介素如il-6、il-8或il-10。本发明人进一步确定了c-x-c趋化因子受体4(cxcr4)作为胺用于抑制pdc产生的ifn的意想不到的受体以及介导该效应的先前未知的结合位点。因此，本发明涉及结合cxcr4受体的化合物，其用于在个体中减少细胞因子水平，特别是干扰素(ifn)水平，条件是结合cxcr4受体的化合物不同于组胺。在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的用于所述用途的结合cxcr4受体的化合物，其用于抑制免疫细胞(特别是浆细胞样树突细胞、单核细胞和自然杀伤(nk)细胞)分泌细胞因子，特别是分泌ifn。在另一实施方案中，本发明涉及根据本发明的用于所述用途的结合cxcr4受体的化合物，其用于预防或治疗干扰素病。本发明还涉及在个体中减少细胞因子水平，特别是干扰素(ifn)水平的方法，包括给予该个体有效量的至少一种结合cxcr4受体的化合物，条件是该结合cxcr4受体的化合物不同于组胺。本发明还涉及在个体中抑制免疫细胞，特别是浆细胞样树突细胞、单核细胞和nk细胞分泌细胞因子，特别是分泌ifn的方法，包括给予该个体有效量的至少一种结合cxcr4受体的化合物，条件是该结合cxcr4受体的化合物不同于组胺。本发明进一步涉及预防或治疗干扰素病的方法，包括给予该个体预防或治疗有效量的至少一种根据本发明的结合cxcr4受体的化合物，条件是结合cxcr4受体的化合物不同于组胺。本发明还涉及根据本发明的结合cxcr4受体的化合物抑制免疫细胞，特别是浆细胞样树突细胞、单核细胞和nk细胞分泌细胞因子，特别是分泌ifn的体外用途，条件是该结合cxcr4受体的化合物不同于组胺。本发明还涉及抑制免疫细胞，特别是浆细胞样树突细胞、单核细胞和nk细胞分泌细胞因子，特别是分泌ifn的体外方法，包括将免疫细胞，特别是浆细胞样树突细胞、单核细胞和nk细胞与根据本发明的结合cxcr4受体的化合物接触，条件是该结合cxcr4受体的化合物不同于组胺。本发明还涉及从候选化合物中鉴定在个体中减少细胞因子水平，特别是ifn水平的化合物的体外筛选方法，其中所述候选化合物为如上定义的结合cxcr4受体的化合物。本发明还涉及从候选化合物中鉴定在个体中减少ifn水平的化合物的体外筛选方法，包括以下步骤：-将血细胞与候选化合物接触；-测定接触的血细胞分泌ifn的水平；-将测定的ifn分泌水平与和参照化合物接触的血细胞表达ifn的水平进行比较；-选择相对参照化合物具有减少、增加或类似的ifn表达水平的候选化合物，从而鉴定用于减少ifn水平的化合物,其中所述参照化合物为根据本发明的结合cxcr4受体的化合物，特别是12g5抗体或如下定义的式(ii)的化合物，更具体为ffn102或ffn511。本发明还涉及从候选化合物中鉴定在个体中减少细胞因子水平，特别是ifn水平的化合物的体外筛选方法，包括:-将cxrc4受体与如上定义的可检测的结合cxcr4受体的化合物结合；-将结合至可检测的结合cxcr4受体的化合物的cxcr4受体与候选化合物接触；-选择减少可检测的结合cxcr4受体的化合物与cxcr4受体结合的候选化合物，从而鉴定用于减少ifn水平的化合物.本发明还涉及在计算机中进行的从候选化合物筛选可用于在个体中减少细胞因子水平，特别是ifn水平的化合物的方法，或设计可用于在个体中减少细胞因子水平，特别是ifn水平的化合物的方法，包括确定设计的化合物或候选化合物是否与seqidno：1表示的cxcr4受体的至少8个氨基酸相互作用的由计算机执行的步骤，其中所述氨基酸选自色氨酸94、色氨酸102、天冬氨酸97、天冬氨酸187、酪氨酸116、酪氨酸190、精氨酸183、异亮氨酸185、缬氨酸112、半胱氨酸186和谷氨酸288。发明详述如本文所预期的，术语“包含”具有“包括”或“含有”的含义，这意味着当对象“包含”一个或多个元素时，除了所提及的那些之外的其他元素也可以包括在该对象中。相反，当一个对象被称为“由一个或多个元素组成”时，该对象仅限于所列出的元素，并且不能包括除了所提到的元素之外的其他元素。cxcr4受体结合化合物如本领域所知，“cxcr4受体”是4型c-x-c趋化因子受体，也称为融合素或cd184。如本文所预期的，表述“cxcr4受体”等同于“cxcr4”。优选地，根据本发明的cxcr4受体是人cxcr4受体。cxcr4特别由seqidno：1表示。根据本发明的结合cxcr4受体的化合物可以是本领域已知与cxcr4结合的，或者可以确定它与cxcr4结合。确定化合物与cxcr4结合可以通过本领域技术人员已知的多种方式进行。举例来说，通过与待使用抗cxcr4抗体(例如12g5抗体)评估的化合物接触的表达cxcr4的细胞的流式细胞术分析来评估cxcr4结合。在以下实施例中更详细地解释了该过程。优选地，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物包含1至45个碳原子和至少一个胺基，该至少一个胺基在ph为6至8，特别是在ph为7.0至7.8，更具体在人个体的生理血液ph下带正电荷。还优选，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物与seqidno：1表示的cxcr4受体的至少5、6、7、8、9、10或11个氨基酸相互作用，其中所述氨基酸选自色氨酸94、色氨酸102、天冬氨酸97、天冬氨酸187、酪氨酸116、酪氨酸190、精氨酸183、异亮氨酸185、缬氨酸112、半胱氨酸186和谷氨酸288。本发明人已经鉴定了上述氨基酸，其定义了负责减少免疫细胞特别是浆细胞样树突细胞、单核细胞和nk细胞的ifn分泌的cxcr4受体上的结合位点。此外，如本领域技术人员应该清楚的，seqidno：1仅旨在作为参考序列，其明确地定义在根据本发明的结合cxcr4受体的化合物的结合中所涉及的cxcr4受体的氨基酸的位置。因此，seqidno：1并不意味着限制根据本发明的cxcr4受体。实际上，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物还可以与cxcr4受体的变体、突变体或截短形式中的上述氨基酸结合，或者与包含cxcr4受体的蛋白质或多肽结合，它们可以改变所述变体、突变体或截短形式或蛋白质或多肽中的氨基酸的绝对位置，但不改变它们的功能。根据本发明的结合cxcr4受体的化合物可具体为天然胺或合成胺、单胺或多胺。在本发明一个实施方案中，所述根据本发明的结合cxcr4受体的化合物为天然胺且优选选自血清胺、多巴胺、左旋多巴、精胺和亚精胺。这些天然胺是本领域技术人员熟知的且由以下结构表示:组胺通过下式表示:在本发明另一实施方案中，所述根据本发明的结合cxcr4受体的化合物选自抗cxcr4受体抗体、抗体片段、scfv抗体、或适体。本领域技术人员应清楚的是，根据本发明的抗cxcr4受体抗体、抗体片段、scfv抗体、或适体都特异性地针对cxcr4受体，更具体针对seqidno：1表示的cxcr4受体的至少5、6、7、8、9、10或11个氨基酸限定的cxcr4受体的位点，其中所述氨基酸选自色氨酸94、色氨酸102、天冬氨酸97、天冬氨酸187、酪氨酸116、酪氨酸190、精氨酸183、异亮氨酸185、缬氨酸112、半胱氨酸186和谷氨酸288。如本文所预期的，当化合物与靶标结合而基本上不结合不相关的靶标(例如对于蛋白质、非同源靶标)时，该化合物被称为“特异性针对”靶标。如本文所理解，根据本发明的“抗体”可为单克隆或多克隆抗体。优选地，根据本发明的抗体为单克隆抗体(mab)且抗体片段为单克隆抗体片段。还优选，根据本发明的抗体为人源化抗体且根据本发明的抗体片段为人源化抗体的片段。产生针对特定靶标的抗体，特别是单克隆抗体的方法是本领域技术人员熟知的。优选地，根据本发明的抗cxcr4受体抗体是单克隆抗cxcr4受体抗体12g5。该抗cxcr4受体抗体是本领域熟知的，特别描述于endres等人(1996)cell87:745-756并且是可商购的。还优选地，根据本发明的抗cxcr4受体抗体是人源化12g5抗体或人抗体，其上已经移植了12g5抗体的至少一个复合决定区(complexdeterminingregion，cdr)，更优选所有cdr。根据本发明的抗体片段可以是本领域技术人员已知的保留抗体的抗原结合部分的任何类型。特别地，根据本发明的抗体片段选自fab片段、fab'片段或f(ab’)2片段。这些片段以及获得它们的方法是本领域技术人员所熟知的。优选地，根据本发明的抗体片段是12g5抗体片段。单链可变片段(scfv)抗体包含抗体的重链(vh)和轻链(vl)的各自可变区，其通过肽接头连接在一起。根据本发明的scfv抗体可通过本领域技术人员熟知的许多方法获得。适体是单链寡核苷酸分子、dna或rna，优选rna。根据本发明的适体可以特别地通过指数富集(selex)方法通过众所周知的配体系统进化获得。在一个实施方案中，所述根据本发明的结合cxcr4受体的化合物为下式(i)的化合物:其中:-n为1至6的整数,-a1、a2和a3，其可相同或不同，表示:·氢原子，或·具有1至12个碳原子的烷基，其任选取代有至少一个羟基、卤素原子、腈基(carbonitril)、三氟甲基、胺基、脲基、或具有1至12个碳原子的o-烷基或s-烷基，或·杂环基、杂芳基、芳基、芳基烷基或烷基芳基，其具有3至12个碳原子，且任选取代有至少一个羟基、卤素原子、腈基、三氟甲基、胺基、脲基、或具有1至12个碳原子的o-烷基或s-烷基；且-a4表示芳基，杂芳基、芳基烷基或烷基芳基，其具有3至20个碳原子，且任选取代有至少一个羟基、卤素原子、腈基、三氟甲基、胺基、脲基、或具有1至12个碳原子的o-烷基或s-烷基；或其药学上可接受的盐和/或水合物。优选地，如上定义的式(i)的化合物选自clobenpropit(cb)和it1t:还优选，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物为如上定义的式(i)的化合物，除了clobenpropit。在本发明一个实施方案中，所述根据本发明的结合cxcr4受体的化合物为如上定义的式(i)的化合物，其中:-a1、a2和a3，其可相同或不同，表示:·氢原子，或·具有1至12个碳原子的烷基，其任选取代有至少一个羟基或卤素原子，或·芳基、芳基烷基或烷基芳基，其具有3至12个碳原子，且任选取代有至少一个羟基、卤素原子、或具有1至12个碳原子的o-烷基或s-烷基；且-a4表示芳基或杂芳基，其具有3至12个碳原子，且任选取代有至少一个羟基、卤素原子、或具有1至12个碳原子的o-烷基或s-烷基，条件是a4不同于咪唑。本领域技术人员可以容易地合成本发明的式(i)化合物，特别是可按照thoma等人(2008)j.med.chem.51：7915–7920和vandergoot等人europeanjournalofmedicinalchemistry，27：511-157中所述。在另一实施方案中，所述根据本发明的结合cxcr4受体的化合物为下式(ii)的化合物：其中-r1、r2、r3和r4，其可相同或不同，表示氢原子、卤素原子、羟基、具有1至12个碳原子的烷基，该烷基任选取代有至少一个羟基、胺基或卤素原子，其中r1和r2、和/或r2和r3和/或r3和r4可包含在相同的环中；-x和y，其可相同或不同，表示s或o；-r5和r6，其可相同或不同，表示氢原子或取代有至少一个胺基的具有1至5个碳原子的烷基，条件是r5和r6至少一个表示取代有至少一个胺基的具有1至5个碳原子的烷基；或其药学上可接受的盐和/或水合物。优选地，以上定义的式(ii)的化合物选自ffn102和ffn511。有利地，式(ii)化合物，特别是ffn102和ffn5111是荧光的。因此，这些化合物可用于评估与cxcr4受体的结合，例如在竞争研究中。本领域技术人员可以容易地合成本发明的式(ii)化合物，特别是可按照gubernator等人(2009)science，324：1441-1444和lee等人(2010)journaloftheamericanchemicalsociety，132：8828-8830中所述。在另一实施方案中，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物为下式(iii)的化合物：其中-b1和b2，其可相同或不同，表示:·芳基或杂芳基，其具有3至6个碳原子，且任选取代有羟基、卤素原子、烷氧基、硫基烷氧基、cf3基、cn基、-nr7r8基、酰胺或具有1至6个碳原子的烷基、s-烷基或o-烷基，或·具有3至6个碳原子的环烷基或杂环烷基，其任选取代有羟基、卤素原子、烷氧基、硫基烷氧基、cf3基、cn基、-nr7r8基或具有1至6个碳原子的烷基、s-烷基或o-烷基，其中r7和r8，其可相同或不同，表示h、具有1至6个碳原子的烷基或具有3至6个碳原子的杂环烷基；或其药学上可接受的盐和/或其水合物。优选地，如上定义的式(iii)化合物选自debnath等人(2013)theranostics3:47-75的文章的图19中所示的化合物。本领域技术人员可以容易地合成本发明的式(iii)化合物，特别是可按照debnath等人(2013)theranostics3:47-7566-67页中所述。在另一实施方案中，所述根据本发明的结合cxcr4受体的化合物为下式(iv)的化合物：其中-d1和d2，其可相同或不同，表示:·具有1至6个碳原子的烷基，其任选取代有至少一个羟基、卤素原子、cf3基、cn基、胺基、或具有1至12个碳原子的烷基、o-烷基或s-烷基，或·芳基、杂芳基、环烷基、杂环烷基、烷基芳基、烷基杂芳基或烷基杂多芳基，其具有3至12个碳原子，且任选取代有至少一个羟基、卤素原子、cf3基、cn基、胺基、或具有1至12个碳原子的烷基、o-烷基或s-烷基；或·d1和d2连接在一起以形成含n芳基或杂芳基，其具有3至12个碳原子且任选取代有至少一个胺基，所述胺基任选取代有具有3至12个碳原子的烷基杂芳基，且-x表示:·具有1至6个碳原子的烷基，或·-r9-y-r10-，其中，r9和r10，其相同或不同，表示具有1至6个碳原子的烷基，且y表示芳基或杂芳基，所述芳基或杂芳基具有3至6个碳原子，且任选取代有卤素原子、羟基、酰胺基、胺基、烷氧基、酯基、cf3基、cn基或具有1至6个碳原子的烷基、o-烷基或s-烷基，该烷基、o-烷基或s-烷基任选取代有羟基、胺基或具有1至6个碳原子的o-烷基；或其药学上可接受的盐和/或其水合物。优选地，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物为如上定义的式(iv)的化合物，其中:-d1和d2，其可相同或不同，表示芳基或杂芳基，其具有3至12个碳原子，且任选取代有羟基或具有1至6个碳原子的烷基,--x表示具有1至6个碳原子的烷基,或其药学上可接受的盐和/或水合物。或其药学上可接受的盐和/或其水合物。优选地，如上定义的式(iv)的化合物选自debnath等人(2013)theranostics3:47-75的文章中的图9和图16所示的化合物。还优选，如上定义的式(iv)的化合物通过下式(v)表示:其中:-e1表示具有1至12个碳原子的烷基、或具有3至12个碳原子的杂芳基，且-e2表示具有1至12个碳原子的取代有胺基的杂烷基，且-e3表示具有1至12个碳原子的杂烷基；或其药学上可接受的盐和/或水合物。最优选地，如上定义的式(iv)的化合物选自以下结构表示的化合物:和优选地，根据本发明的式(iv)的化合物为amd070:本领域技术人员可容易合成根据本发明的式(iv)的化合物，特别是可按照miller等人(2010)bioorg.med.chem.lett.，20：3026-30中所述。式(i)、(ii)、(iii)和(iv)的化合物的药学上可接受的盐和/或水合物对本领域技术人员是显而易见的。优选地，式(i)、(ii)、(iii)和(iv)的化合物的药学上可接受的盐和/或水合物选自氢溴化物、盐酸盐、二氢溴化物和二盐酸盐。如本文预期，术语“烷基”是指直链、支链的烷基或环烷基。如本文预期，术语“芳基”表示包含至少一个芳环的芳族基。如本文预期，术语“杂芳基”表示包含至少一个杂原子的芳基，该杂原子优选选自o、p、n、s和si，更优选n。如本文所预期的，术语“杂烷基”，特别是“杂环烷基”，表示包含至少一个杂原子的烷基，特别是环烷基，所述杂原子优选选自o、p、n、s和si，更优选n。如本文所预期的，术语“烷基芳基”表示被至少一个芳基取代的烷基。如本文所预期的，术语“芳基烷基”表示被至少一个烷基取代的芳基。根据本发明的卤素原子可以是本领域技术人员已知的任何类型。优选地，根据本发明的卤素原子选自f、cl、br和i。优选地，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物选自it1t、clobenpropit、ffn102、ffn511和amd070。更优选地，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物选自it1t、ffn102、ffn511和amd070。预防和治疗根据本发明的细胞因子可以是促炎细胞因子或抗炎细胞因子。优选地，根据本发明的细胞因子是tnf-α，白介素例如il-6、il-8或il-10，或干扰素，更优选地选自i型干扰素(也称为ifn-i)，ii型干扰素(也称为ifn-ii)，和iii型干扰素(也称为ifn-iii)。更优选地，根据本发明的ifn选自ifn-α、ifn-β、ifn-ω、ifn-γ和ifn-λ。最优选地，根据本发明的干扰素是ifn-α。如本领域技术人员所知，根据本发明要降低的细胞因子或干扰素，优选ifn-i、ifn-ii或ifn-iii的水平优选是异常或病理水平，更优选异常或病理性升高。如本文所预期的，异常或病理性升高的干扰素特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii的水平，优选为高于1u.i/ml的干扰素水平，即干扰素浓度，特别是在人个体内。优选地，根据本发明，抑制细胞因子分泌，特别是ifn分泌，涉及免疫细胞即免疫系统细胞的分泌抑制，更优选抑制树突细胞特别是浆细胞样树突细胞、单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，特别是单核细胞和自然杀伤(nk)细胞的分泌。优选地，根据本发明的预防或治疗涉及预防或治疗与ifn(特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii)过量产生或过量或高或升高的ifn水平(特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii水平)相关或由其引起的至少一种症状、病症或疾病。过量产生或过量的ifn，特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii，或高或升高的ifn水平，特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii水平，可以例如，由于病毒感染或遗传(例如遗传疾病)而获得。更优选地，本发明涉及预防或治疗干扰素病，特别是i型干扰素病，即与ifn-i相关的干扰素病。i型干扰素病通常被定义为一组孟德尔病症，其特征在于以下病理生理学：i型干扰素的上调。在munoz等人(2015)annalesdedermatologieetdevénéréologie，142：653-663中特别描述了干扰素病。根据本发明的干扰素病优选选自aicardi-goutières综合征、家族性冻疮样狼疮、椎骨内生软骨瘤病(spondyenchondromatosis)、系统性红斑狼疮(特别是与trex基因的有害的杂合突变相关)、sting-相关的血管病变、蛋白酶体-相关的自身炎症综合征(praas)和辛-梅综合征。更优选地，本发明还涉及预防或治疗由ifn-ii的过量产生、上调、过量，或高、升高或高于正常水平引起或与之相关的疾病，特别是自身免疫性疾病，如baccala等人，(2005)immunologicalreviews，204：9-26中所述的那些。优选地，由ifn-ii的过量产生、上调、过量、或高、升高或高于正常水平引起或与之相关的疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和i型糖尿病。还优选，本发明涉及预防或治疗自身免疫性疾病，特别是选自系统性红斑狼疮、舍格伦综合征、aicardi-goutières、肌炎(特别是多肌炎和皮肤肌炎)、牛皮癣、全身性硬化、i型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、类风湿性关节炎、克罗恩病和多发性硬化、以及动脉粥样硬化。更优选地，本发明涉及预防或治疗类风湿性关节炎或系统性红斑狼疮或牛皮癣。已知所有这些后面的疾病都与ifn有关，或已知ifn是其发病原因之一，如在niewold(2014)frontiersinimmunology5:1-2,goosenset等人(2010)cellmetabolism12:142-153,greenberg(2010)arthritisresearch&therapy12(suppl1):s4,以及pollard等人(2013)discov.med.16:123-131中所述。因此，本发明优选涉及预防或治疗选自以下的疾病：aicardi-goutières综合征、家族性冻疮样狼疮、椎骨内生软骨瘤病、系统性红斑狼疮(特别是与trex基因的有害的杂合突变相关)、sting-相关的血管病变、蛋白酶体-相关的自身炎症综合征(praas)、辛-梅综合征、舍格伦综合征、肌炎(特别是多肌炎和皮肤肌炎)、牛皮癣、全身性硬化、i型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、类风湿性关节炎、多发性硬化和动脉粥样硬化。个体根据本发明的个体优选是哺乳动物，更优选是人。还优选地，根据本发明的个体是儿童或婴儿。优选地，根据本发明的个体具有异常或病理水平的ifn，特别是ifn-i、ifn-ii和ifn-iii，其更优选是异常或病理学升高的水平。优选地，根据本发明的个体也表现出过量产生或过量的ifn，特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii，或高或升高的ifn水平，特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii水平。过量产生或过量的ifn，特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii，或高或升高的ifn水平，特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii水平，可以例如，由于病毒感染，或遗传，例如遗传疾病获得。在本发明的一个实施方案中，根据本发明的个体患有慢性病毒感染，特别是导致ifn特别是ifn-i、ifn-ii或ifn-iii过量产生的慢性病毒感染。优选地，根据本发明的个体患有选自以下病毒的慢性病毒感染：人免疫缺陷病毒、流感或登革热。给药优选地，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物以预防或治疗有效量施用，用于预防或治疗与ifn过量产生相关的病症，特别是用于预防或治疗干扰素病或如上定义的疾病。还优选地，根据本发明的结合cxcr4受体的化合物以适于降低个体中ifn水平的量施用。根据本发明的cxcr4受体结合化合物可以通过本领域的任何途径给药，例如静脉内、肌肉内、皮下注射、口服或局部途径。体外筛选方法优选地，从候选化合物中鉴定在个体中减少ifn水平的化合物的体外筛选方法，其中所述候选化合物为根据本发明的结合cxcr4受体的化合物，包括以下步骤:-将血细胞与候选化合物接触；-确定接触的血细胞分泌ifn的水平；-选择相对血细胞接触候选化合物之前的ifn分泌水平降低了ifn分泌水平的候选化合物，从而鉴定用于减少ifn水平的化合物。优选地，根据本发明的体外筛选方法通过流式细胞术进行。血细胞根据本发明可为本领域技术人员已知的任何类型。优选地，根据本发明的血细胞为外周血单核细胞(pbmc)，更优选浆细胞样树突细胞(pdc)、单核细胞或nk细胞。优选地，根据本发明的从候选化合物中鉴定在个体中减少ifn水平的化合物的体外筛选方法，该cxrc4受体在细胞，如hek细胞表面表达。根据本发明的可检测的cxcr4受体结合化合物可以是本领域技术人员已知的任何类型。优选地，根据本发明的可检测的结合cxcr4受体的化合物是抗体，例如12g5抗体，其具有可检测标记或如上定义的式(ii)化合物，特别是ffn102和ffn511。在计算机中进行的实验用于筛选化合物的在计算机中进行的方法是本领域技术人员公知的。根据本发明的在计算机中进行的方法优选地是指用于通过生物信息学工具鉴定候选化合物或设计用于降低个体中ifn水平的化合物的方法。根据本发明的在计算机中进行的方法可以是任何类型，例如对接，例如使用诸如cdocker之类的软件，基于结构、基于配体、受体依赖性的-定量结构-活性关系(rdqsar)、定量结构-活性关系(qsar)、定量结构-性质关系(qspr)、药效团模型和从头设计。优选地，根据本发明的用于从候选化合物中筛选化合物或用于设计化合物以降低个体中的ifn水平的在计算机中进行的方法是在计算机中进行的对接实验。例如，根据本发明的用于从候选化合物中筛选化合物或用于设计化合物以降低个体中的ifn水平的在计算机中进行的方法可以通过以下进行：使用具有结构上与cb相关的小配体(特别是具有it1t)的cxcr4的晶体结构，然后鉴定cxcr4细胞外结构域上潜在的结合口袋。优选地，根据本发明设计的化合物或候选化合物与seqidno：1表示的cxcr4受体的至少8个氨基酸相互作用，其中所述氨基酸选自色氨酸94、色氨酸102、天冬氨酸97、天冬氨酸187、酪氨酸116、酪氨酸190、精氨酸183、异亮氨酸185、缬氨酸112、半胱氨酸186和谷氨酸288。通过以下非限制性图和实施例进一步描述本发明。附图说明图1图1显示了在用10μm浓度的组胺或cb预处理、然后用单独的微泡(模拟)或用hiv刺激过夜的pdc中，通过elisa测量的上清液中ifn-α的产生量(ng/ml)。符号3星(***)表示p<0.001，符号2星(**)表示p<0.01，符号1星(*)表示p<0.05。图2图2显示了使用均化器从脾获得并使用35％等渗percoll密度梯度(amershambiosciences)纯化的小鼠mnc(多核细胞)中，通过elisa在上清液中定量的ifn-α。使用红细胞裂解缓冲液(8.3mg/mlnh4cl，1mg/mlkhco3和3.72μg/mledta置于mat和med中)去除脾脏mnc的rbc。将野生型(wt)(n＝14)或h4rko小鼠(n＝10)脾mnc与cb(10μm)预温育，然后与甲型流感病毒一起培养过夜。图3图3显示来自用组胺、cb、多巴胺、血清胺和亚精胺预温育并用hiv刺激过夜的纯化pdc的trail和ifn-(α，β)的mrna水平，通过rt-qpcr测量并以rpl13a归一化。未指定时，显示的数据代表三个独立实验。使用双尾student’st检验确定p值(p)。符号3星(***)表示p<0.001，符号2星(**)表示p<0.01且符号1星(*)表示p<0.05。图4a、4b和4c图4a-4c显示来自用组胺和cb预温育并用流感病毒刺激过夜的pbmc的ifn-α(图4a)、ifn-β(图4b)和ifn-λ2/3(图4c)的mrna水平，通过rt-qpcr测量并以rpl13a归一化。显示的数据代表三个独立实验。图5a、5b和5c图5a-5c显示通过elisa测量的用x31(800tcid50)感染的29s8小鼠的bal液中的ifn-α(图5a)、ifn-β(图5b)和ifn-λ2/3(图5c)水平。符号3星(***)表示p<0.0001，符号2星(**p)表示<0.001且符号1星(*)表示p<0.01，通过bonferroni后检验的双因素anova确定。图6图6显示通过流式细胞术从用cxcl12(100nm)、ha(1mm)或cb(1mm)在4℃温育30分钟、然后用12g5抗体(抗cxcr4)染色的jurkat细胞在cxcr4上的化合物固定。图7图7显示，相对于对照暴露于流感病毒的人pbmc中的mrna表达水平(100％)，在10μm/50μmcb或10μm/50μmit1t存在下暴露于流感病毒的人pbmc中的trail(第一个柱)、ifn-α(第二个柱)和ifn-β(第三个柱)的mrna表达水平。图8图8显示了在不存在(/)或存在clobenpropit(cb)或单克隆抗体12g5的情况下由人pdc产生的hiv刺激的i型干扰素。图9图9显示通过流式细胞术测量的nk细胞表达的ifn-γ(白条)、tnf-α(阴影条)和cd107a(黑条)的细胞内水平，所述nk细胞不用或用it1t、clobenpropit(cb)和精胺处理1小时，然后由k562细胞系激活。图10图10显示了用cb、it1t或氯喹预温育、然后用hiv或脂多糖(lps)刺激的单核细胞的ifn-γ的mrna水平，通过rt-qpcr测量并以rpl13a表达归一化。所示数据代表两个独立实验。图11图11显示了在研究的日子里，每天一次腹膜内注射pbs(黑方块)、泼尼松龙(三角形)和3mg/kg(mpk)(圆圈)、10mg/kg(mpk)(菱形)和30mg/kg(mpk)(方形)的it1t的小鼠关节炎迹象(胶原诱导的关节炎小鼠模型)的平均得分。图12图12显示了在研究的日子里，每天一次腹膜内注射pbs(黑方块)、泼尼松龙(三角形)和3mg/kg(mpk)(圆圈)、10mg/kg(mpk)(菱形)和30mg/kg(mpk)(方形)的clobenpropit的小鼠关节炎迹象(胶原诱导的关节炎小鼠模型)的平均得分。图13图13显示在第14天(终止)测量的，通过每日腹膜内注射pbs(黑色柱)、泼尼松龙(垂直阴影线)和3mg/kg(mpk)(向右阴影线)、10mg/kg(mpk)(向左阴影线)和30mg/kg(mpk)(水平阴影线)的it1t处理的小鼠il-β的平均血浆浓度(胶原诱导的关节炎小鼠模型)。符号一星(*)表示p≤0.05vspbs，符号两星(**)表示p≤0.01vspbs，符号三星(***)表示p≤0.001vspbs，符号四星(****)表示p≤0.0001vspbs，符号五星(*****)表示p<0.00001vspbs。图14图14显示通过每日腹膜内注射pbs(黑色柱)、泼尼松龙(垂直阴影线)和3mg/kg(mpk)(向右阴影线)、10mg/kg(mpk)(向左阴影线)和30mg/kg(mpk)(水平阴影线)的clobenpropit处理的小鼠il-β的平均血浆浓度(胶原诱导的关节炎小鼠模型)。符号一星(*)表示p≤0.05vspbs，符号两星(**)表示p≤0.01vspbs，符号三星(***)表示p≤0.001vspbs，符号四星(****)表示p≤0.0001vspbs，符号五星(*****)表示p<0.00001vspbs。图15图15显示通过每日腹膜内注射pbs(黑色柱)、泼尼松龙(垂直阴影线)和3mg/kg(mpk)(向右阴影线)、10mg/kg(mpk)(向左阴影线)和30mg/kg(mpk)(水平阴影线)的it1t处理的小鼠il-6的平均血浆浓度(胶原诱导的关节炎小鼠模型)。符号一星(*)表示p≤0.05vspbs，符号两星(**)表示p≤0.01vspbs，符号三星(***)表示p≤0.001vspbs，符号四星(****)表示p≤0.0001vspbs，符号五星(*****)表示p<0.00001vspbs。图16图16显示通过每日腹膜内注射pbs(黑色柱)、泼尼松龙(垂直阴影线)和3mg/kg(mpk)(向右阴影线)、10mg/kg(mpk)(向左阴影线)和30mg/kg(mpk)(水平阴影线)的clobenpropit处理的小鼠il-6的平均血浆浓度(胶原诱导的关节炎小鼠模型)。符号一星(*)表示p≤0.05vspbs，符号两星(**)表示p≤0.01vspbs，符号三星(***)表示p≤0.001vspbs，符号四星(****)表示p≤0.0001vspbs，符号五星(*****)表示p<0.00001vspbs。图17图17显示通过每日腹膜内注射pbs(黑色柱)、泼尼松龙(垂直阴影线)和3mg/kg(mpk)(向右阴影线)、10mg/kg(mpk)(向左阴影线)和30mg/kg(mpk)(水平阴影线)的it1t处理的小鼠trail的平均血浆浓度(胶原诱导的关节炎小鼠模型)。符号一星(*)表示p≤0.05vspbs，符号两星(**)表示p≤0.01vspbs，符号三星(***)表示p≤0.001vspbs，符号四星(****)表示p≤0.0001vspbs，符号五星(*****)表示p<0.00001vspbs.图18图18显示通过每日腹膜内注射pbs(黑色柱)、泼尼松龙(垂直阴影线)和3mg/kg(mpk)(向右阴影线)、10mg/kg(mpk)(向左阴影线)和30mg/kg(mpk)(水平阴影线)的clobenpropit处理的小鼠trail的平均血浆浓度(胶原诱导的关节炎小鼠模型)。符号一星(*)表示p≤0.05vspbs，符号两星(**)表示p≤0.01vspbs，符号三星(***)表示p≤0.001vspbs，符号四星(****)表示p≤0.0001vspbs，符号五星(*****)表示p<0.00001vspbs.图19图19显示用载体(pbs)(菱形)、阳性对照(泼尼松龙)(带有短划线的黑色方块)和3mg/kg(三角形)、10mg/kg(带有虚线的黑色方块)和30mg/kg(星形符号)的clobenpropit处理的小鼠体重(克)(姥鲛烷诱导的系统性红斑狼疮(sle)的balb/c小鼠模型)。图20图20显示用载体(pbs)(菱形)、阳性对照(泼尼松龙)(带有短划线的黑色方块)和3mg/kg(圆圈)、10mg/kg(带有虚线的黑色方块)和30mg/kg(黑线)的it1t处理的小鼠体重(克)(姥鲛烷诱导的系统性红斑狼疮(sle)的balb/c小鼠模型)。图21图21显示了用载体(黑色柱)，泼尼松龙(虚线柱)，3mg/kg(向右阴影线的柱)、10mg/kg(带破横线的柱)、30mg/kg(具有花片的柱(tilebar))的clobenpropit，3mg/kg(具有白色花片的黑柱)、10mg/kg(带菱形的柱)、30mg/kg(垂直阴影柱)的it1t处理的balb/c小鼠中姥鲛烷诱导的系统性红斑狼疮(sle)模型中dsdna水平的水平。实施例i：抑制通过病毒刺激的浆细胞样树突细胞的干扰素产生a.材料和方法1.血液样品、血液白细胞的分离和培养。血液来自健康的hiv-1血清阴性血库供体。人体血液的实验程序根据欧盟指南和赫尔辛基宣言进行。使用从外周血白细胞分离培养基(cambrex，gaithersburg，md)通过密度离心分离的人外周血单核细胞(pbmc)进行体外实验。用人浆细胞样dc富集试剂盒(stemcelltechnologies)通过阴性选择纯化pdc。细胞在含有10％胎牛血清(hyclone，logan，ut)的rpmi1640(invitrogen，gaithersburg，md)中培养。纯化后，所得纯度高于pdc的91％。2.病毒刺激和感染。将pbmc以1.106/1ml接种或将纯化的pdc以5.104/100μl接种，然后用以下病毒刺激：灭活的at-2hiv-1mn(cxcr4共受体特异性的)或at-2hiv-1ada(ccr5共受体特异性的)，以60ng/mlp24ca当量(由j.d.lifson(saic-nci，frederick，md)提供)；传染性人流感a/pr/8/34病毒(流感)，滴度为1：8192，稀释度为1：1000；或moi10的denv-216681。传染性hiv-1mn[组织培养50％感染剂量(tcid50)＝106]和hiv-1ada(tcid50＝1,000)以相同浓度使用。在用病毒过夜刺激之前，用氨基化合物预处理纯化的pdc1小时。收集上清液用于细胞因子检测。从与产生病毒的培养物匹配的未感染细胞培养物中分离的微泡被用作阴性对照(模拟)。3.化学化合物将组胺二盐酸盐、clobenpropit二氢溴化物、多巴胺、血清胺和亚精胺(sigma-aldrich，mo，usa)在纯水中稀释，并将it1t(r&dsystem/tocris)在dmso中稀释。在用不同的病毒刺激前1小时(或不刺激)将化合物以10μm(或其他，如果指定的话)加入pdc培养物中。对于组胺，使用x-vivo培养基(lonza)以避免组胺酶。荧光化合物ffn-511和fc-co2-的合成类似于gubernator等人(2009)science，324：1441-1444和lee等人(2010)journaloftheamericanchemicalsociety，132：8828-8830中描述的方法。在cb或组胺温育之前，将细胞用amd(20μm)(sigma-aldrich，mo，usa)预温育1小时。在5mm寡核苷酸a151(ttaggg)odn(integrateddnatechnologies，coralville，ia)存在下培养pdc。组胺受体拮抗剂(吡拉明/pyr用于h1r，西咪替丁/cim用于h2r，噻普酰胺/thio用于h3r且jnj7777120/jnj和a943931用于h4r)(sigma-aldrich，mo，usa)以10μm使用。4.h4r和cxcr4敲除实验.将pdc以105细胞/ml接种于96孔板中并在37℃下温育。h4r和cxcr4小干扰rna(sirna)(smartpool，dharmarcon)在dotap(rocheappliedsciences)中稀释。将混合物轻轻混合并在室温下温育15分钟。温育后，将混合物加入培养的细胞中，终浓度为160nm。最后，将细胞在37℃下温育24小时，然后加入不同的病毒过夜。使用sirna对照进行对照。5.流式细胞术.将培养的细胞在4℃下用以下温育20分钟：合适的抗体藻红蛋白(pe)缀合的trail克隆rik-2(bdbioscience，sanjose，ca)、apc缀合的bdca-4、fitc-cd123(miltenyi，bergischgladbach，德国)、fitc-hladr、percp-cy5.5-ccr7、apc-cd40、bv421-cd80、fitc-cd86、pe-cxcr4克隆12g5(biolegend，sandiego，ca)或用适当的同种型匹配的对照抗体(每种5μg/ml)，在含有2％小鼠血清(sigma，saintlouis，mo)和fc-受体阻断剂(bdbiosciences，sanjose，ca)的pbs中。使用流式细胞术diva软件(bdbiosciences，sanjose，ca)在流式细胞术cantoii或lsrii流式细胞仪上进行流式细胞术分析。flowjo软件(treestar，ashland，or)用于分析数据。6.细胞因子检测.根据制造商的说明，通过elisa(pblassayscience，nj，usa)测试pdc的上清液的多种类可溶ifn-α。7.rt-qpcr分析.使用rneasymicro试剂盒提取总rna，并按照制造商的说明进行dna酶处理(qiagen)。通过分光光度法(biophotometer，eppendorf)评估rna浓度和纯度。使用primescriptrt试剂盒(perfectrealtime，takara)在10μl反应中逆转录500ngrna。使用takyonroxsybrmastermixbluedttp(eurogentec)在7900ht快速实时pcr系统(appliedbiosystems)上一式两份进行实时pcr反应。使用以下程序对转录物进行定量：在95℃下3分钟，然后在95℃下15秒、在60℃下20秒和在72℃下20秒的35个循环。使用2-δδct方法将每种转录物的值以rpl13a(60s核糖体蛋白l13a)的表达水平归一化。用于通过实时定量pcr定量转录物的引物如下所示：1：引物扩增ifn-α1和ifn-α13转录物二者2：引物扩增ifn-α4和ifn-α10转录物二者3：引物扩增ifn-λ2(il-28a)和ifn-λ3(il-28b)转录物二者。8.小鼠的体内处理在无特定病原体条件下将在mrc-国立医学研究所(nationalinstituteformedicalresearch，nimr)繁殖的12周龄129s8小鼠(jacksonlaboratory)在感染前18小时用clobenpropit二氢溴酸盐(sigma-aldrich，c209)(450μg/30μl/小鼠)、组胺二盐酸盐(sigma-aldrich，h7250)(450μg/30μl/小鼠)或载体对照(pbs)(30μl/小鼠)处理。将小鼠以800tcid/30μl感染甲型流感病毒株x31(h3n2)(来自j.skehel博士的友情赠送，mrc-nimr)。根据spearman-karber方法，x31在10天胚胎鸡蛋的尿囊腔中生长，没有细菌、支原体和内毒素污染，储存在-70℃并在mdck细胞上滴定。在轻度异氟烷诱导的麻醉下，对所有小鼠进行鼻内(i.n)治疗和感染。在感染后3天，使小鼠安乐死并收集支气管肺泡灌洗液(bal)。将bal样品在4℃下以1,300rpm离心5分钟并收集上清液。然后根据制造商的说明通过elisa分析样品的ifnα、(ebioscience)ifnβ(biolegenduk)和ifnλ(r&d)的浓度。9.三维显微镜在一些情况下，将纯化的pdc细胞在hiv-1的存在下与不同化合物(cb，ffn-511和fc-co2-)培养过夜。将pdc(1×105个细胞/载玻片)涂布在胶原包被的载玻片上，并用4％多聚甲醛固定。然后将细胞用抗cxcr4抗体(biolegend，sandiego，ca)在饱和缓冲液pbs-bsa0.5％中温育以用于膜染色，或在含有1％皂苷的透化缓冲液中用单克隆抗体抗trail(biolegend，sandiego，ca，usa)温育。通过驴抗小鼠igg-af647(molecularprobes，or，usa)显示cxcr4，并通过驴抗小鼠igg-花青3(jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)显示trail。使用dapi(molecularprobes，paisley，uk)染色细胞核。使用fluoromount-g(ebioscience，ca，usa)安装载玻片，并使用nikxeclipse90iupright显微镜(nikoninstrumentseurope，badhoevedorp，thenetherlands)使用100xplanapovc压电物镜(na1.4)和chromabloc滤镜(et-dapi，et-gfp)扫描，随后用meinel算法和8次迭代去卷积，并使用(mdsanalyticaltechnologies，winnersh，uk)进行分析。trail/dapi/overlay/confocal平面：代表性2d焦点计划。明亮覆盖：明亮。重新卷积覆盖：沿z轴的最大强度像素的2d投影。在其他情况下，将细胞在单独培养基中培养过夜，然后在冰冷的pbs-bsa0.2％中洗涤，并在4℃下用cxcr4抗体(r&dsystems)染色1小时。然后用0.2％pbs-bsa洗涤细胞，并在4℃下用cb刺激1小时。数据表示为残留表面表达和细胞内染色的平均百分比±sem平均通道荧光强度(mfi)值。在悬浮液中染色后，用shandoncytocentrifuge(thermoscientific，st-herblain，france)以400rpm旋转pdc(1×105细胞/载玻片)10分钟，并用4％多聚甲醛固定。然后在膜上或在用triton0.2％透化后，用二抗抗小鼠-af647(molecularprobes，or，usa)染色细胞。最后，将载玻片在pbs中洗涤，用hoechst33342复染并固定在fluoromount-g培养基中。使用zexlsm710共聚焦显微镜使用63xplapoo.n.＝1.4/oil物镜数字化获取图像。使用imagej软件(nih，bethesda，md，usa)进行所有分析。10.图像定量.对于构成核的每个z切片，从每个载玻片拍摄7张照片。在imagej中通过jacop插接分析后，获得使用mander系数的纯化pdc的细胞质中的共区域化的定量。11.cxcr4内化与cxcr4的相互作用。使用抗人cxcr4抗体通过jurkat细胞的流式细胞术分析(facscantoii；bectondickinson)评估cb和组胺与cxcr4的结合。简而言之，将jurkat细胞与cb、组胺(1,000μm)或缓冲液在4℃下在facs缓冲液(pbs-1％fcs)中预温育30分钟。温育后，通过离心用facs缓冲液洗涤细胞，然后用pe标记的抗人cxcr4抗体12g5(pharmingen)在4℃染色30分钟。洗涤后，将细胞用在facs缓冲液中的4％多聚甲醛在4℃下固定5分钟。通过流式细胞术分析(每个样品10,000个细胞)在细胞计数器(facscantoii，becton-dickinson)上定量cxcr4染色。使用facsdiva软件(bectondickinson)处理数据。所有值代表细胞相对于缓冲液处理过的细胞中cxcr4水平(100％)的平均荧光强度，其来自一式三份实验±sd。使用graphpadprismversion5.03，使用双尾配对student'st-检验进行统计学计算。p<0.05被认为是显著的。cxcr4的内化。使用抗人cxcr4抗体通过jurkat细胞的流式细胞术分析评估cxcr4的内化。简而言之，将jurkat细胞与cb(10μm)、cxcl12(250nm)或缓冲液在37℃下在无血清培养基中预温育30分钟。温育后，通过离心用facs缓冲液洗涤细胞，然后用pe标记的抗人cxcr4抗体(1d9，bdpharmingen)在4℃染色30分钟。洗涤后，将细胞用在facs缓冲液中的4％多聚甲醛在4℃下固定5分钟。通过流式细胞术分析(每个样品10,000个细胞)在细胞计数器上定量cxcr4表达。使用facsdiva软件(bectondickinson)处理数据。所有值代表细胞相对于缓冲液处理过的细胞中cxcr4水平(100％)的平均荧光强度，其来自一式三份实验±sd。使用graphpadprismversion5.03，使用双尾配对student'st-检验进行统计学计算。p<0.05被认为是显著的。12.cxcr4与各种配体的分子模拟分子对接程序cdocker用于自动分子对接模拟，并使用各种评分函数对姿态进行排序：jain,cdockerinteractionoptimized,ludi。使用discoverystudio4.1的制备蛋白质方案清洁pdb文件，根据im.w算法添加膜。在生成构象后使用制备配体方案制备配体及其构象异构体。基于相互作用能量的标准结合几何匹配质量以及评分函数的折衷来选择复合物。图是使用discoverystudio4.1图形系统生成的。discoverystudio的分子结构相互作用的2d表示被用于描绘配体和cxcr4之间的详细相互作用(pdb代码：3odu)。如果vanderwalls分数为0.7则该相互作用被认为是疏水性相互作用，并且如果它在列出的供体和受体之间并且由氢键周围的原子形成的角度和距离在默认标准内，则认为相互作用是是氢键。使用discoverystudio4.1计算rmsd且以cxcr4/it1t共晶体中的it1t作为参照(pdb代码3odu)。13.统计分析.p值(p)使用双尾studentt检验确定。p<0.05被认为是统计学显著的。*＝p<0,05；**＝p<0,01和***＝p<0,001。使用flowjo软件在300个箱中通过概率装箱进行流式细胞术数据的单变量分布。对于小鼠数据，数据显示为平均值±s.e.m。样品量的设计旨在提供统计功效，同时尽量减少动物使用。通过具有bonferroni后测试(细胞因子浓度时间过程)的双因素anova分析数据集。graphpadprism5(graphpadsoftware，sandiego，ca)用于数据分析和所有图的制备。p值小于0.01被认为是统计学上显著的。b.结果1.组胺和clobenpropit抑制hiv-诱导的pdc活化.已经研究了组胺对hiv-1激活pdc的作用。剂量范围分析表明10μm的组胺在纯化的pdc上具有活性，没有明显的毒性。已经测试了h4r激动剂clobenpropit(cb)的作用。cb显示出比组胺更强的抑制作用，并且在hiv刺激后分泌的ifn-α水平降低了约90％(图1)。cb在10μm的浓度下没有细胞毒性作用。接下来评估ifn-α产生动力学并显示cb在温育9小时后抑制hiv刺激的pdc产生的ifn-α。将cb抑制作用与tlr-7拮抗剂a151进行比较，可以显示两种分子具有相似的活性。通过rt-qpcr评估相对trailmrna表达水平并确认这些结果。cb还强烈抑制用流感和登革热病毒培养的pdc产生的ifn-α和膜trail表达，证明cb效应不限于hiv。然后测试5.10-7至10-3m范围的内源性和合成的胺在人流感病毒-活化的原代pbmc上对i型ifn产生和trail表达的作用。此外，同时研究了在几种浓度的胺下的细胞活力。结果表明，对于绝大多数分子，在10-5和5.10-5m之间观察到胺的最佳效应。更高浓度诱导了高水平的细胞死亡(表1)。化合物ec50(μm)tc50(μm)治疗指数(比例tc50/ec50)组胺1.4±1<2mm<1500clobenpropit24±2417±617.4血清胺1.3±0.5/113±31500±541150/13.3it1t7.1±1237.9±2133.5表1：组胺(ha)、clobenpropit(cb)、血清胺(5-ht)和it1t的ec50、tc50和治疗指数的总结。2.在对pdc的抑制中不涉及组胺受体已测试了cb的活性是否依赖于组胺受体。在不同组胺受体拮抗剂存在下(吡拉明/pyr用于h1r，西咪替丁/cim用于h2r，噻普酰胺/thio用于h3r且jnj7777120/jnj或a943931化合物用于h4r)，在流感病毒刺激的pdc上评估了10μmcb。已发现这些拮抗剂都没有逆转由cb引发的对ifn-α产生的抑制。为了证实这些结果，分析了cb和组胺对从野生型(wt)或h4r敲除(ko)小鼠分离的pdc的病毒活化的作用。在这些实验中使用流感病毒刺激细胞。实际上，hiv不能在小鼠pdc中诱导i型ifn或trail表达，因为小鼠pdc不表达hiv共受体cd4，而hiv共受体cd4对于pdc识别和激活是必需的。cb抑制了由来自野生型和h4rko小鼠的流感病毒刺激的pdc产生ifn-α(图2)。接下来，通过sirna在人原代pdc中沉默h4r，然后测定组胺和cb的作用。我们发现h4r敲低不会阻断组胺或cb对ifn-α、ifn-β和trail产生(通过hiv刺激的pdc)的抑制活性。因此，h4r与通过组胺或cb的pdc调节模型无关，提示了另一种机制。因此，已经检查了胺是否通常对pdc活化显示出抑制作用，并且分析了天然胺多巴胺，血清胺和亚精胺。所有胺抑制hiv介导的膜trail和hladr，以及迁移和成熟标记物如ccr7、cd40、cd86和cd80表达，以及通过hiv刺激的pdc的trail、ifn-α/βmrna(图3)。值得注意的是，这些分子在使用的浓度下均不具有细胞毒性。还测试了在人原代pdc培养物上的单独的不同胺。作为阳性对照，hiv被用于刺激pdc产生细胞因子。膜trail和hladr以及迁移和成熟标记物如ccr7、cd40、cd86和cd80表达不受胺的影响。通过rt-pcr定量ifn-α、ifn-β和trailmrna表达，并且显示所测试的胺单独对i型ifn的产生都不具有作用。3.在pbmc和129s8小鼠中组胺和clobenpropit抑制流感病毒诱导的干扰素产生.首先测试cb和组胺对暴露于流感病毒的人pbmc的影响。当细胞在流感病毒暴露前用组胺或cb预处理时，ifn-α/β和ifn-λ2/3mrna水平显著降低，证实胺在含有各种免疫细胞群的混合培养系统中具有抑制活性(图4a-4c)。接下来，已经研究了胺是否在体内对抗病毒细胞因子反应表现出抑制活性。我们确定了组胺和cb如何影响感染x31流感病毒株或接种载体对照的12周龄129s8小鼠中的ifn产生。在流感病毒感染的第3天，与未治疗的流感病毒感染小鼠相比，用cb预处理的小鼠显示支气管肺泡灌洗液(bal)中ifn-α、ifn-β和ifn-λ2/3蛋白产生的强烈减少(图5a-5c)。当在流感病毒感染之前用组胺处理小鼠时，注意到ifn减少的趋势没有统计学显著性。该结果可以通过组胺是天然胺的事实来解释，并因此其被血清中发现的组胺酶降解。4.铵基(nh3+)对抑制pdc活化是重要的.为了进一步研究胺对pdc活化的作用，合成了ffn-511，一种血清胺的荧光胺模拟物。该化合物含有铵基团(nh3+)和荧光香豆素核心，可进行显微镜检查和流式细胞术分析。ffn-511(50μm)强烈减少hiv刺激的pdc产生的ifni型，没有任何明显的细胞毒性作用。为了进一步研究nh3+官能团的作用，合成了带负电荷的ffn-511类似物fc-co2-，其中铵基团(nh3+)被羧基(co2-)部分代替。使用rt-qpcr分析测定法在一组活化标记物上检查胺ffn-511及其类似物fc-co2-的作用。选择病毒暴露后通常被激活的一组基因：trail、ifn(ifn-α、ifn-β、ifn-γ、ifn-λ1和ifn-λ2/3)、白介素(il6、il8、il10和il15)、趋化因子(cxcl10)、诱导型一氧化氮合酶(inos)和早期isg(isg56)。将每种转录物的值归一化为核糖体蛋白l13a(rpl13a)的表达水平。所有病毒诱导的基因均由hiv-1在pdc中诱导，并且它们的转录被cb和ffn-511显著抑制，但不被fc-co2-抑制。然而，cb和ffn-511都不影响inos或il-15基因表达，这表明病毒诱导的基因表达的特异性抑制而不是对细胞基因转录的全局影响。5.合成和天然的胺抑制hiv刺激的pdc膜上的trail重定位病毒暴露导致trail从细胞质重新定位到细胞膜。因此，已经使用3维(3d)显微镜检查了胺是否影响该过程。正如预期的那样，trail主要定位于未激活的pdc中的胞质溶胶中，但在hiv刺激后在质膜上变得可检测到。cb和ffn-511显著抑制hiv刺激的pdc中trail向细胞膜的定位，而fc-co2-没有抑制。进行膜trail的图像定量并通过流式细胞术结果验证。因此，在hiv-1暴露后，胺阻止细胞内trail库的表面进入，从而抑制hiv激活的pdc10的促杀伤活性。6.趋化因子受体cxcr4是胺对pdc的抑制作用所必需的。已经发现ha和cb抑制cxcr4抗体12g5在t细胞上的结合(图6)，因此证实了胺与cxcr4的直接相互作用。此外，通过用受体特异性抗体染色透化和非透化的pdc来评估cxcr4的细胞内和/或细胞外水平。当细胞与cb一起温育时，与未处理的细胞相比，大多数cxcr4在细胞内被检测到。此外，还使用抗人cxcr4抗体克隆1d931通过jurkatt细胞的流式细胞术分析评估cxcr4的内化。为了可视化cxcr4和胺之间的相互作用，使用ffn-511的荧光特性。pdc的共聚焦显微镜检查证实了ffn-511和cxcr4之间的强烈共定位。由于已经显示化合物可以内化cxcr4，因此研究了cxcr4天然配体cxcl12对pdc活化的影响。将纯化的pdc在不同时间点(15分钟，30分钟，60分钟)与cxcl12(62.5nm)预温育。已经发现，无论预温育的时间如何，cxcl12都不会通过hiv刺激的pdc降低ifn-α/βmrna表达。为了证实这些令人惊讶的结果，cxcl12以用于胺的浓度(10μm)使用，甚至在该浓度下，cxcl12也不抑制i型ifnmrna表达。因此，发明人证明cxcl12不像胺那样起作用并且不能抑制人pdc的病毒活化。然后使用小干扰rna(sirna)在pdc中沉默cxcr4。在cxcr4-向性hiv-1刺激的pdc中，cxcr4基因沉默抑制了组胺或cb对i型ifn和trail的抑制作用。应该注意到hiv-1激活pdc不需要cxcr4。为了推广该发现，证实了cxcr4沉默还阻断了对ccr5-向性(r5)hiv-1和流感病毒激活的pdc的cb抑制作用。因此，胺通过cxcr4的接合抑制了pdc中的病毒感知。7.在cxcr4细胞外结构域上鉴定胺的结合口袋。为了更好地理解胺和cxcr4之间的分子相互作用，进行了计算机对接实验。it1t被用作内部对照以验证分子建模方案。因此，it1t和化合物在cxcr4的ito结合口袋中进行了对接。首先，已经证实，与晶体结构相比，it1t被恰当替换。实际上在评分后，在晶体结构(pdb代码3odu)和it1t对接姿态中解析的it1t重原子的rmsd大约为(相当于将3odu共晶体中的it1t与其他共结晶结构(pdb代码3oe6-3oe8-3oe9)进行比较时观察到的变化)(表2)。表2：对接协议的验证。使用cdocker在cxcr4(pdb代码：3odu)中对接后，对it1t姿态进行评分。根据使用jain、优化的cdocker相互作用或ludi作为评分函数计算的他们的分数对姿态进行排序。每个顶部姿态和作为参考的结晶it1t之间的rmsd以计算。rmsd：均方根偏差。组胺、cb和ffn-511的各种构象异构体对接至cxcr4中，且最小化复合物以建立最佳模型。2d表示用于描绘配体和cxcr4之间的详细相互作用。使用该模型，所有测试的配体可在与it1t相同的细胞外口袋中与cxcr4相互作用，并且具有先前表征的关键残基(表3)。表3：涉及it1t中配体结合的残基对姿态进行评分，并根据其性质对化合物进行分类。高分表示与口袋内的各种残基的强烈相互作用。如所预期的，fc-co2-显示最低得分，表明化合物与cxcr4的结合位点之间的弱相互作用。此外，在计算机中进行的化合物评分与其实验效力直接相关。由于cxcr4中胺的推定结合位点与it1t的结合口袋重叠，因此研究了it1t是否能够抑制通过暴露于病毒的pdc产生的i型ifn和trail。8.it1t抑制hiv或流感诱导的人pdc或pbmc中干扰素的表达将人pdc与it1t一起培养1小时，然后暴露于hivx4。已经发现it1t抑制通过hiv刺激的pdc表达ifn-α、ifn-β和trail。通过比较cb和it1t对活化的pdc产生细胞因子的影响，显示出it1t比cb更强的效应。对于暴露于流感病毒的人pbmc获得了类似的结果(图7)。it1t在有效浓度下没有毒性，但在较高浓度下显示出一些毒性，这是由于用于稀释其的dmso。此外，为了证明it1t活性是通过cxcr4接合(engagement)介导的，进行了人pdc中的cxcr4rna沉默。在这些条件下，it1t显示减少用对照sirna(sictr)转染的细胞中的i型ifn，但在用hivx4或hivr5刺激的被cxcr4sirna处理的细胞中丧失其生物活性。因此，与内源性胺类似，it1t通过cxcr4接合抑制i型ifn。然后评估了已知的cxcr4拮抗剂amd3100是否可以抑制hiv刺激的pdc产生干扰素。有趣的是，它证实单独的amd3100不会阻断hiv激活的pdc表达i型ifn和trail，这表明其作用机制不同于it1t和其他胺。然后测试了amd3100是否能够通过限制it1t口袋的进入来阻止胺作用。实际上，amd-3100结合位点与鉴定的胺结合口袋重叠。trail、ifn-α和ifn-β的表达也在用amd3100处理或未处理的pdc中被定量。将纯化的细胞用amd3100预温育1小时，然后用组胺或cb预温育1小时，最后暴露于hiv-1过夜。amd3100彻底废除了组胺和cb对hiv激活的pdc的生物活性。实际上，amd3100处理可以在hiv激活的pdc中恢复由组胺或cb抑制的i型ifnmrna和蛋白质以及trail的产生。这些结果在一组pdc细胞因子分泌(ifn-γ和il6)和isg(isg56)上得到证实。总之，这些结果明确证明cxcr4是胺对pdc活化的抑制活性所必需的。9.mab12g5抑制hiv-诱导的i型干扰素的产生本发明人可表明12g5单克隆抗体抑制ifn-i的产生(图8)。10.nk细胞的ifn-ii分泌被胺抑制通过流式细胞术测量在不存在或存在it1t、clobenpropit(cb)和精胺的情况下nk细胞中ifn-γ、tnf-α和cd107a的表达水平(图9)。因此，本发明人可以证明it1t、clobenpropit(cb)和精胺减少由k562细胞激活的nk细胞的ifn-γ、tnf-α和cd107a表达。11.单核细胞的ifn-ii分泌被胺抑制将单核细胞用clobenpropit(cb)、it1t或氯喹预温育，然后通过hiv和lps活化。通过rt-qpcr测量ifn-γ水平，并将其以rpl13amrna表达归一化。因此，图10显示clobenpropit(cb)、it1t和氯喹抑制hiv或lps刺激的单核细胞的ifn-γ表达。实施例ii：测试化合物在dba1/j小鼠的治疗性胶原诱导的关节炎模型中的抗关节炎功效a.材料和方法1.动物收集80只dba1/j小鼠(雄性，7-8周)并隔离放置3天，每日检查。对小鼠耳标用于个体识别。2.方案通过向160ml去离子水中加入0.1ml冰醋酸制备0.01m乙酸。通过在4-8℃下以4mg/ml溶于0.01m乙酸中并搅拌过夜来制备牛ii型胶原溶液。第-1天：通过乳化1:1体积:体积的胶原溶液和完全弗氏佐剂(cfa)(结核分枝杆菌h37ra悬浮液：4mg/ml)的组合制备免疫原。第0天：记录个体小鼠体重。通过数字卡尺记录后爪厚度。使用装有25g针头的1ml注射器向80只小鼠皮下注射胶原/cfa乳剂(0.05ml/小鼠；100μg/小鼠的cfa中的胶原蛋白)。小鼠回到笼子里。第20天：通过在4-8℃下以4mg/ml溶于0.01m乙酸中并搅拌过夜来制备ii型牛胶原。第21天：用胶原/icfa乳剂加强80只小鼠。然后记录他们的个体重量。通过乳化(匀浆)1:1体积:体积的胶原溶液和不完全弗氏佐剂(icfa)的组合来制备免疫原。使用装有25g针头的1ml注射器皮下注射免疫原(0.050ml/小鼠；100μg/小鼠的icfa中的胶原)。然后小鼠回到笼子里。第28天：选择小鼠用于分配至治疗给药的组。这种选择发生在第28天之前或之后几天，取决于动物中关节炎的发展情况。对小鼠进行关节炎迹象评分：1)每个爪子都得到一个分数；2)0＝没有关节炎的可见效果；3)1＝1个脚趾的水肿和/或红斑；4)2＝2个脚趾的水肿和/或红斑；5)3＝超过2个脚趾的水肿和/或红斑；6)4＝整个爪子和脚趾的严重关节炎；7)通过添加个体爪子得分来计算关节炎指数(ai)并记录。8)最大ai＝16选择ai评分在2-6范围内的小鼠以分配至治疗给药组，如表4所示。将选择的小鼠(来自用胶原免疫的总共100只)分配到8组(n＝8)，使得每组具有大致相同的组平均ai。根据表4，每天一次(qd)开始腹膜内(ip)给药。测试化合物clobenpropit(cb)和it1t。cb和it1t在4℃储存。在处理前通过在pbs中溶解而新鲜制备化合物(两种化合物在水中的溶解度>50mg/ml)。这些化合物以每周7天(包括周六和周日)每天给药，保持14天。组小鼠数量处理剂量(mg/kg)*18pbs1028泼尼松龙338it1t348it1t1058it1t3068clobenpropit378clobenpropit1088clobenpropit30表4：治疗组治疗*第28天至第42天单次注射。第28-42天：对小鼠称重，对体征或关节炎进行评分，并且通过数字卡尺每周三次(周一、周三和周五)测量后爪厚度。记录对治疗的任何不良反应。终止：记录每个肢体的ai分数。用数字卡尺测量后肢的爪厚度。将小鼠麻醉并在预冷的edta管中放血。1)将血液处理成血浆，将其在-80℃下储存在四个标记的eppendorf管中。2)通过elisa测定血浆中的il-1β、il-6、trail。然后，收集所有肢体。1)取出后，将肢体分别固定在10％中性缓冲福尔马林中，以进行可能的组织病理学检查。b.结果通过腹膜内注射it1t的每日治疗性处理(图11和图13)导致疾病迹象以及il-1β和il-6的血浆浓度显著的剂量依赖性减少。无论剂量如何，trail都被显著抑制。通过每日腹膜内注射clobenpropit进行治疗性处理(图12和图14)导致疾病迹象以及il-1β、il-6和trail的血浆浓度显著的剂量依赖性降低(图18)。1.疾病发展当动物出现疾病时，在开始给药方案之前，将它们分成8只小鼠的治疗组，每组的ai在2-4的范围内，平均组ai为2.6。疾病首先在后肢发展，可能是由于动物单独在站立时在后肢上花费的时间比在四肢上花费的时间长。每天一次腹膜内注射pbs(第1组)，在第42天(给药14天)产生13.1的ai。在研究结束时，患病小鼠的血浆水平为25pg/ml的il-1β，156pg/ml的il-6和328pg/ml的trail。2.泼尼松龙治疗性处理(第2组)从第28天开始每日腹膜内注射3mg/kg泼尼松龙导致疾病进展立即停止，在第42天产生82％的疾病严重程度抑制(平均ai＝2.4)。作为该研究的阳性对照，该治疗方案显著降低il-1β(62％)、il-6(79％)和trail(72％)的血浆水平(图17)。3.it1t的治疗性处理(第3-5组)每日腹膜内注射it1t导致对疾病进展的剂量依赖性抑制。在最低剂量(3mg/kg，组3)下，在研究结束时未观察到宏观疾病评分(平均ai＝13.1)的改善效果。然而，该治疗方案确实产生il-1β(49％)(图13)和trail(62％)(图17)的终末血浆浓度的显著降低。在中间剂量(10mg/kg，组4)下，疾病进展速率减弱，在研究结束时疾病严重程度显著降低40％(平均ai＝7.9)。该治疗方案还产生il-1β(53％)(图13)、il-6(30％)(图15)和trail(46％)(图18)的终末血浆浓度的显著降低。在最高剂量(30mg/kg，第5组)下，疾病进展的速度受到严重限制，使终末疾病严重程度显著降低63％(ai＝4.9)。该治疗方案还使il-1β(69％)(图13)、il-6(66％)(图15)和trail(51％)(图18)的终末血浆浓度显著降低。4.clobenpropit治疗(第6-8组)每日腹腔注射clobenpropit导致疾病进展的剂量依赖性抑制。在最低剂量(3mg/kg，组6)下，观察到疾病进展速率的逐渐降低，在研究结束时产生显著的25％的疾病严重性抑制(平均ai＝9.8)。该治疗方案还使il-1β(64％)(图14)和il-6(49％)的终末血浆浓度显著降低(图16)。该治疗方案还对trail的终末血浆浓度有影响(图18)。在中等剂量(10mg/kg，第7组)下，疾病进展的速度受到严重限制，在研究结束时，疾病严重程度显著降低66％(平均ai＝4.4)。该治疗方案还使il-1β(75％)(图14)和il-6(80％)(图16)的终末血浆浓度显著降低。该治疗方案还对trail的终末血浆浓度有影响(图18)。在最高剂量(30mg/kg，第8组)时，治疗的开始导致疾病迹象的立即逆转，使得在研究结束时，记录了疾病严重程度显著降低87％(平均ai＝1.8)。该治疗方案还使il-1β(82％)(图14)、(82％)(图16)和trail(图18)的终末血浆浓度显著降低。实施例iii：化合物clobenpropit和it1t在姥鲛烷诱导的系统性红斑狼疮(sle)模型中的抗炎功效a.材料和方法1.动物接收并隔离(sop560)70只雌性balb/c(20-25克)小鼠，并置于带有高压灭菌垫的顶部过滤笼中。在72小时隔离期间每天检查一次小鼠并记录任何临床痛苦、疾病或损伤的迹象。表现出无迹象的动物被接受用于该研究。接受的动物被转移到日常维护，且每笼饲养8只。治疗组通过笼卡识别。将动物称重，将耳标记用于个体鉴定，并随机分配到每组8只动物的8个治疗组和3只动物的两组(用于30mg/kg存活的预耐受性)。通过腹膜内注射姥鲛烷诱导sle以及用化合物的治疗方案示于表5中。2.测试化合物测试项目化合物clobenpropit(cb)和it1t在4℃下储存。通过在pbs(载体)中溶解，在治疗前新鲜制备化合物(两种化合物在pbs中的溶解度>50mg/ml)。表5：组治疗roa＝给药途径*ip＝腹膜内注射**第0天单次注射***测试化合物每周7天(包括周六和周日)每天给药；为期10周。在第0天，在注射姥鲛烷后1小时给予试验化合物的剂量****po＝口服给药3.监测/测量参数每周记录两次小鼠体重，并每日观察临床症状。血清收集：第1-8组：预剂量和第4周将收集的血清储存在-80℃，用于在第4、8和10周测量自身抗体。(预剂量将保持在-80℃以备潜在用途)。抗dsdna水平是用于在sle模型中鉴定测试化合物功效的标准筛选读数。测量：第4周，第8周，第10周：(1)通过elisa测量自身抗体(抗dsdna)、胶原和细胞因子tnfα、il-6和trail，和(2)通过ifa测量ana抗体。终止(第10周)：将所有小鼠麻醉(sop1810)并放血(sop1687)。收集血液并处理血清(sop6001)并储存在-80℃下以测量自身抗体、胶原蛋白和细胞因子。取下脾脏和肾脏：将脾脏和肾脏取下并固定在10％中性缓冲福尔马林中以备潜在用途。4.结果与剂量开始的日期相比，用cb(图19)和it1t(图20)治疗的小鼠显示研究期间没有体重减轻。结果表明测试化合物在体重减轻方面没有毒性；并且可用于长期治疗。此外，观察结果表明cb和it1t减少了治疗小鼠中姥鲛烷诱导的系统性红斑狼疮的症状。实际上，与组1(载体)相比，测试化合物(cb、it1)中的ds-dna水平受到抑制(图21)。序列表<110>国家科学研究中心巴黎笛卡尔大学<120>用于减少干扰素水平的化合物<130>b000056wo<160>35<170>patentinversion3.5<210>1<211>352<212>prt<213>人类<400>1metgluglyileseriletyrthrseraspasntyrthrgluglumet151015glyserglyasptyraspsermetlysgluprocysphearggluglu202530asnalaasnpheasnlysilepheleuprothriletyrserileile354045pheleuthrglyilevalglyasnglyleuvalileleuvalmetgly505560tyrglnlyslysleuargsermetthrasplystyrargleuhisleu65707580servalalaaspleuleuphevalilethrleuprophetrpalaval859095aspalavalalaasntrptyrpheglyasnpheleucyslysalaval100105110hisvaliletyrthrvalasnleutyrserservalleuileleuala115120125pheileserleuaspargtyrleualailevalhisalathrasnser130135140glnargproarglysleuleualaglulysvalvaltyrvalglyval145150155160trpileproalaleuleuleuthrileproasppheilephealaasn165170175valserglualaaspaspargtyrilecysaspargphetyrproasn180185190aspleutrpvalvalvalpheglnpheglnhisilemetvalglyleu195200205ileleuproglyilevalileleusercystyrcysileileileser210215220lysleuserhisserlysglyhisglnlysarglysalaleulysthr225230235240thrvalileleuileleualaphephealacystrpleuprotyrtyr245250255ileglyileserileaspserpheileleuleugluileilelysgln260265270glycysgluphegluasnthrvalhislystrpileserilethrglu275280285alaleualaphephehiscyscysleuasnproileleutyralaphe290295300leuglyalalysphelysthrseralaglnhisalaleuthrserval305310315320serargglyserserleulysileleuserlysglylysargglygly325330335hisserservalserthrglusergluserserserphehisserser340345350<210>2<211>23<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>2cctggaggagaagaggaaagaga23<210>3<211>25<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>3ttgaggacctctgtgtatttgtcaa25<210>4<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>4gctgaagcagatgcaggacaa21<210>5<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>5tgacggagttgccacttgact21<210>6<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>6ccagttccagaaggctccag20<210>7<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>7tcctcctgcatcacacaggc20<210>8<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>8cccacagcctgggtaatagga21<210>9<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>9cagcagatgagtcctctgtgc21<210>10<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>10tgcattacctgaaggccaagg21<210>11<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>11agcaattgtccagtcccagtg21<210>12<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>12ggacgccttggaagagtcac20<210>13<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>13ctggtctaggacgtcctcca20<210>14<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>14gggcctgtatccagcctcag20<210>15<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>15gaggaggcggaagaggttga20<210>16<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>16ggcagccaacctaagcaagat21<210>17<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>17cagggtcacctgacacattca21<210>18<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>18taaccacccctgacccaacc20<210>19<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>19atttgccgaagagccctcag20<210>20<211>22<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>20aagggccaagagaatatccgaa22<210>21<211>22<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>21actagggttgccagatttaaca22<210>22<211>22<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>22aagggccaagagaatatccgaa22<210>23<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>23gctggccacagctttcaaga20<210>24<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>24aagaagagctggctatggca20<210>25<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>25tcatgttccatgctgctgac20<210>26<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>26aggacaggaagctgaaggag20<210>27<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>27agtgggtgtttcctgcaagg20<210>28<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>28cgctgtacctgcatcagcat20<210>29<211>22<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>29gcaatgatctcaacacgtggac22<210>30<211>19<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>30cagcgggatgactttccaa19<210>31<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>31aggcaagatttggacctgca20<210>32<211>22<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>32gcatgacggacaagtacaggct22<210>33<211>21<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>33aaagtaccagtttgccacggc21<210>34<211>20<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>34acacgctgttcgaatgggat20<210>35<211>23<212>dna<213>人工<220><223>pcr引物<400>35tcgatcatagctgatgaggacaa23当前第1页12