以芹菜素、姜黄素及和厚朴酚为有效成分包含的肺癌预防或治疗用药学组合物的制作方法

本发明涉及芹菜素或姜黄素中的任一种及和厚朴酚混合物的治疗肺癌效果。

背景技术：

癌症(cancer)指的是由多种原因导致细胞分裂与凋亡之间的平衡、通过持续的分裂与增殖而产生的非正常细胞群，也称为恶性肿瘤。一般来说，癌症会在包括脏器、白细胞、骨头、淋巴结等在内的100种以上身体的多个部位发病，并通过浸润周边组织的现象以及向其它器官移动的转移而发展成为严重症状，最终导致死亡。其中，起源于肺的恶性肿瘤即肺癌根据其组织形态大致可分为小细胞肺癌(smallcelllungcancer)与非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer)。所述小细胞肺癌根据发病组织的位置被区分为肺癌的一部分，但是与其它肺癌在临床经过、治疗方法及预后等方面具有明确区分的特征，因此进行如上区分。另外，非小细胞肺癌根据组织型区分为腺癌、鳞状上皮细胞癌及大细胞癌。

具体地，小细胞肺癌基本上肿块大，带有灰白色，沿支气管壁增殖。小细胞肺癌大部分在诊断当时就已经发展到了很难通过手术切除的程度，恶性程度高，因此快速生长，容易地通过淋巴管或者血液循环向全身转移。但是，通过化疗或者放疗能获得显著的治疗效果。所述小细胞肺癌转移的主要脏器报告为脑、肝、骨头、肺、肾上腺、肾脏等，主要首先在气管(支气管或者细支气管)发病。

相反，如上所述，非小细胞肺癌分为腺癌(adenocarcinoma)、鳞状上皮细胞癌(squamouscellcarcinoma)及大细胞癌(large-cellcarcinoma)。首先，腺癌主要发生在肺末梢部位，还经常在女性或不吸烟者中发生，大小小但已经转移的情况较多。最近，其发病频率呈现出增加的趋势。其次，鳞状上皮细胞癌主要发现在肺中心部，多数情况下向支气管内腔生长，导致出现堵塞支气管的症状。男性发病比较常见，与吸烟有着密切关联。最后，大细胞癌主要发生在肺表面附近(肺末梢)，大约一半在大支气管发生，占全部肺癌的4～10％左右，细胞大小一般较大。其中，一部分具有快速增殖及转移的倾向，大细胞癌与其它非小细胞肺癌相比，其预后情况差。

如果上述肺癌在早期被诊断时，可以通过药物治疗及放射线治疗等得到康复，但是当病症恶化到一定程度时，就可以先通过手术清除病变，通过药物治疗及放射线治疗等进行治疗。目前为止，可用于治疗肺癌的公认药物只局限于几种，因此难以执行适合于患者的治疗，并且其副作用也是面临的大问题。大部分在第1次观察到肿瘤时就已经发现了癌的转移，手术之后的治疗成功率低。

因此，作为治疗癌症的新接近方法，一直在不断致力于利用毒性较低的天然物质研发副作用小且能够抑制癌细胞转移或者使癌细胞减少的效能显著的致癌抑制剂及癌症治疗剂。但是，这些源于天然物质的治疗剂治疗效果不佳的根本缺点尚未解决(韩国专利公开编号10-2012-0109139)。

在这种背景下，本发明人为了研发出能够更加安全且有效治疗肺癌的制剂，经过艰苦的研究，最终确认芹菜素或姜黄素；及和厚朴酚混合物能够引起肺癌细胞株的凋亡并可以抑制癌细胞的增殖，发现其可有效地用于肺癌治疗用组合物，从而完成了本发明。

技术实现要素：

所要解决的技术问题

本发明就是为解决上述问题而研发的。本发明人确认到通过单独或混合给药芹菜素、姜黄素、和厚朴酚可以获得肺癌细胞株的糖酵解速度降低、抑制ant2表达、抑制hk2表达、抑制pd-l1表达以及减少atp生产的效果。基于此，完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供一种以芹菜素和姜黄素中的任一种及和厚朴酚为有效成分包含的肺癌预防或治疗用药学组合物。

另外，本发明的另一目的在于，提供一种以芹菜素和姜黄素中的任一种及和厚朴酚为有效成分包含的肺癌预防或改善用健康功能食品组合物。

但是，本发明所要解决的技术问题并非仅仅局限于以上提到的课题，对于尚未提到的其它课题，本领域的技术人员通过以下记载就会有明确的了解。

解决技术问题的方法

为了实现本发明的上述目的，本发明提供一种以芹菜素和姜黄素中的任一种及和厚朴酚为有效成分包含在内的肺癌预防或治疗用药学组合物。

本发明的另一目的在于，提供一种以芹菜素和姜黄素中的任一种及和厚朴酚为有效成分包含在内的肺癌预防或改善用健康功能食品组合物。

作为本发明的一实现例，所述组合物以芹菜素及和厚朴酚为有效成分包含。

作为本发明的另一实现例，所述组合物以姜黄素及和厚朴酚为有效成分包含。

作为本发明的又一实现例，所述组合物可以使ant2(腺嘌呤核苷酸转运体2；adeninenucleotidetranslocator2)基因的表达减少。

作为本发明的又一实现例，所述组合物可以使hk2(己糖激酶2；hexokinase2)或pd-l1(程序性死亡配体1；programmeddeath-ligand1)蛋白质的表达减少。

另外，本发明提供一种包含将所述药学组合物向个体给药步骤的肺癌预防或治疗方法。

另外，本发明提供一种所述药学组合物的肺癌预防或治疗用途。

发明的效果

本发明涉及一种以芹菜素或姜黄素；及和厚朴酚为有效成分的肺癌预防或治疗用药学组合物。依据本发明的组合物，与将芹菜素、姜黄素或和厚朴酚单独处理的情况相比，如果将其混合或并用处理，可以相互上升地诱导癌细胞凋亡。本发明以芹菜素和姜黄素中的任一种及和厚朴酚混合物为有效成分的肺癌预防或治疗用药学组合物可以提高抗癌效果，诱导癌细胞凋亡，从而显示出非常良好的癌症治疗增大效果。因此，依据本发明的组合物可有效用于肺癌预防、改善或治疗。

附图说明

图1是将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时对肺癌细胞株凋亡效果进行确认的结果；

图2是将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时对肺癌细胞株的ant2表达抑制效果进行确认的结果；

图3是将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时对肺癌细胞株的atp生产减少效果进行确认的结果；

图4是将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时对肺癌细胞株的hk2表达抑制效果进行确认的结果；

图5是将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时对肺癌细胞株的糖酵解速度(glycolysisrate)降低效果进行确认的结果；

图6a是将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时对肺癌细胞株a549中pd-l1表达抑制效果进行确认的结果；

图6b是将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时对肺癌细胞株h2228中pd-l1表达抑制效果进行确认的结果。

具体实施方式

依据本发明的组合物以芹菜素或姜黄素及和厚朴酚混合物为有效成分包含，确认到降低肺癌细胞株的糖酵解速度、抑制ant2表达、抑制hk2表达、抑制pd-l1表达以及减少atp生产，从而具有肺癌预防、改善或治疗效果，基于此，完成了本发明。

下面，将对本发明进行详细说明。

本发明提供一种以芹菜素或姜黄素；及和厚朴酚为有效成分包含的肺癌预防或治疗用组合物。所述组合物包含药学及健康功能食品组合物。

本发明中使用的术语“预防”，是指通过给药依据本发明的药学组合物抑制肺癌相关疾病或者延迟发病的所有行为。

本发明中使用的术语“治疗”，是指通过给药依据本发明的药学组合物使肺癌的症状好转或者变得有利的所有行为。

本发明的组合物预防、治疗的对象疾病即“癌症(cancer)”是由于生物组织内细胞无限制地增殖而引发恶性肿瘤的疾病，更具体地，可为肺癌，但并非仅限定于此。

本发明中使用的“和厚朴酚(honokiol)”是一种多酚类化合物，可以从木兰科物种(magnoliaspecies)中分离、提纯或提取。更具体地，可以从厚朴树中分离、提纯或提取，但并非仅限定于此，通过化学方法合成的化合物或商业性销售的都可以使用。另外，可以是和厚朴酚的衍生物或类似物，但并非仅限定于此。

本发明中使用的“芹菜素(apigenin,5,7,4'-三羟基黄酮；5,7,4'-trihydroxyflavone)”是一种类黄酮系列的化合物，不仅能够在刺槐树提取物中发现，而且还大量存在于橙子、苹果、樱桃、葡萄等水果与洋葱、香菜、芹菜、大麦、西红柿等蔬菜或者茶水、葡萄酒等饮料中，可以从中进行分离、提纯或提取，但并非仅限定于此，通过化学方法合成的化合物或商业性销售的都可以使用。另外，可以是芹菜素的衍生物或类似物，但并非仅限定于此。

本发明中使用的“姜黄素(curcumin)”是一种生物碱类化合物，可以从姜黄或郁金中分离、提纯或提取，但并非仅限定于此，通过化学方法合成的化合物或商业性销售的都可以使用。另外，可以是姜黄素的衍生物或类似物，但并非仅限定于此。

另外，依据本发明的组合物可以是以芹菜素及和厚朴酚为有效成分包含的肺癌预防、改善或治疗用组合物，但并非仅限定于此。

另外，依据本发明的组合物可以是以姜黄素及和厚朴酚为有效成分包含的肺癌预防、改善或治疗用组合物，但并非仅限定于此。

另外，依据本发明的组合物，其特征在于，使ant2(adeninenucleotidetranslocator2)基因的表达减少。

本发明的“ant2(adeninenucleotidetranslocator2)”是一种在癌细胞的生存、增殖及转移过程中具有重要功能的基因。腺嘌呤核苷酸转运酶/转运体(ant)2蛋白质是一种在线粒体内膜中最多的蛋白质，形成为六个跨膜螺旋。ant促进线粒体atp转化为细胞质adp，在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。由此，会对线粒体氧化磷酸化产生影响。所有的哺乳动物都带有ant1～ant3的同种型(isoform)，作为所述同种型家族的ant2转换为线粒体内adp的过程中会增加通过糖酵解过程产生的细胞质atp吸收，由此能够保持线粒体膜电位，ant2的缺失(knockdown)会减小癌细胞中的膜电位差。

另外，依据本发明的组合物，其特征在于，使hk2(hexokinase2)或pd-l1(programmeddeath-ligand1)蛋白质的表达减少。

本发明的“hk2(hexokinase2)”是一种将带有6个碳的己糖通过磷酸化处理使其转换为己糖磷酸的酶，虽然hk2在正常细胞中的表达量少，但是在大部分癌细胞中的表达量却非常高，其具有使葡萄糖磷酸化的功能，同时与线粒体的vdac蛋白质结合并阻碍细胞凋亡机制(apoptosis)，具有增强癌细胞生存力的功能。因此，可有效用于以hk2为目标的癌症治疗。

另外，本发明的“pd-l1(programmeddeath-ligand1)”蛋白质是一种存在于癌细胞表面的蛋白质，当具有癌细胞杀灭效果的t细胞与存在于癌细胞表面的蛋白质即pd-l1结合时，t细胞就无法攻击癌细胞，从而失去杀灭癌细胞的效果。免疫抗癌剂会阻止抗体与pd-l1蛋白质结合，从而让t细胞主动攻击癌细胞。所述抗癌剂增强人体免疫系统，不存在现有抗癌剂产生的副作用或者耐性。因此，作为癌细胞的免疫回避策略之一，通过调节pd-l1的表达，并利用免疫检查点(immunecheckpoint)功能的变化，就可以抑制肿瘤特异t淋巴细胞的功能。

在本发明的一个实施例中，通过将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合对肺癌细胞株进行处理，确认了癌细胞的凋亡效果(参照实施例1)。同时，确认了在将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时肺癌细胞株的ant2表达抑制效果(参照实施例2)、atp生产减少效果(参照实施例3)、hk2表达抑制效果(参照实施例4)、糖酵解速度降低效果(参照实施例5)、以及pd-l1表达抑制效果(参照实施例6)。

因此，依据本发明的以芹菜素和姜黄素中的任一种及和厚朴酚为有效成分包含的药学组合物能够降低肺癌细胞株的糖酵解速度，抑制ant2表达，抑制hk2表达，抑制pd-l1表达以及使atp生产减少，也可以用作肺癌预防、改善或治疗用组合物的有效成分。

依据本发明的药学组合物除了有效成分之外，还可包括药剂学上允许使用的载体。在这种情况下，药剂学上允许使用的载体是一种在调配制剂时常用的物质，包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、刺槐胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但并非仅限定于此。另外，除了上述成分之外，还可进一步包括润滑剂、湿润剂、甜味剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂等。

本发明的药剂学组合物根据作为目的的方法可以采用经口给药或者非经口给药(例如：用于静脉内、皮下、腹腔内或局部)，给药量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形态、给药途径及时间而不同，但本领域的技术人员可以适当选择。

本发明的药剂学组合物按药学上有效的量给药。在本发明中，“药学上有效的量”是指按照可用于医学治疗的合理受益/危险比例治疗疾病所需的充足量，有效用量标准可以根据包含患者的疾病种类、严重程度、药物的活性、对药物的敏感度、给药时间、给药途径及排出比例、治疗期间、同时使用的药物在内的因素以及其它医学领域众所周知的因素决定。依据本发明的药学组合物既可以作为单个治疗剂给药或者与其它治疗剂并用给药，可以与现有治疗剂按顺序或同时给药，可以单一或多重给药。重要的是，将上述因素全部考虑在内且不产生副作用的前提下，要按照用最少的量能够获得最大效果的用量标准进行给药，这一点本领域的技术人员能够很容易地决定。

具体地，本发明药剂学组合物的有效量根据患者的年龄、性别、状态、体重、体内活性成分的吸收率、惰性率及排泄速度、疾病种类、并用的药物而不同。一般来说，按照每1kg体重0.001～150mg的标准给药，优选为0.01～100mg，每日或隔日给药，或者1日分为1～3次进行给药。但是，可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而进行增减。因此，所述给药量不会以何种方法限定本发明的范围。

另外，本发明的组合物可以肺癌相关疾病的预防或改善目的添加到健康功能食品中。如果将本发明具有肺癌预防或改善效果的化合物作为食品添加物使用，可以将所述化合物直接添加或者与其它食品或食品成分一起使用，可以根据常规方法适当使用。有效成分的混合量可以根据使用目的(预防、健康或治疗性处置)而适当地确定。一般来说，在生产食品或饮料时，本发明的化合物相对于原料按照15重量％以下，优选地，按照10重量％以下的量进行添加。但是，当以健康及卫生为目的或以健康调节为目的进行长期摄取时，所述量就可以为所述范围以下。从安全性方面来看，没有任何问题，因此有效成分的用量也可以在所述范围以上。

所述食品的种类没有特别限制。作为能够添加所述物质的食品的例子有，肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类、点心类、饼干类、比萨、方便面、其它面类、口香糖类、包含冰淇淋类在内的乳制品、各种汤、饮用水、茶、饮品、含酒精饮料及维生素复合剂等，通常意义上的健康功能食品全都包括在内。

本发明的健康饮料组合物与普通的饮料一样，也可以附加成分含有多种增香剂或天然碳水化合物等。上述天然碳水化合物为葡萄糖及果糖等单糖、麦芽糖及蔗糖等二糖、糊精及环糊精等多糖、以及木糖醇、山梨糖醇与赤藓糖醇等糖醇。甜味剂可以使用索马甜、甜叶菊提取物等天然甜味剂或者糖精、阿斯巴甜等合成甜味剂等。一般来说，所述天然碳水化合物的比例为每100ml本发明的组合物其用量约为0.01-0.20g，优选地，其用量为0.04-0.10g。

除了上述成分之外，本发明的组合物可以含有多种营养剂、维生素、电解质、风味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、用于碳酸饮料的碳酸化剂等。另外，本发明的组合物可以含有用于生产天然果汁、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这些成分可以独立或组合使用。虽然这些添加剂的比例不太重要，但是每100重量份的本发明组合物其用量一般在0.01-0.20重量份的范围内选择。

作为本发明的另一种形态，本发明提供一种包含将所述药学组合物向个体给药步骤的肺癌治疗方法。在本发明中，所谓“个体”是指需要实施疾病治疗的对象，更具体地，是指人或非人类的灵长类、大鼠(mouse)、狗、猫、马及牛等哺乳类。

下面，为了有助于对本发明进行理解，将列举一些优选的实施例。但是，列举以下实施例的目的是为了能够更加容易地理解本发明，而不是通过以下实施例限定本发明的内容。

[实施例]

实施例1.将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时肺癌细胞株凋亡效果

为了确认和厚朴酚、芹菜素、姜黄素导致肺癌细胞株凋亡的效果，以人肺癌细胞株a549(adenocarcinomichumanalveolarbasalepithelialcells)为对象，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素(sigma-aldrich)进行单独或混合处理。将人肺癌细胞株用和厚朴酚、芹菜素、姜黄素处理的浓度通过给药浓度曲线(dose-concentrationcurve)确定为单独给药时诱导细胞凋亡达到20％的浓度(ic20:inhibitoryconcentration20)即10μm，进行了单独与混合处理。处理24小时之后，利用cck8assay(cellcountingkit-8,dojindomoleculartechnologies,inc)对肺癌细胞株的凋亡效果进行了分析。

其结果如图1所示，与将和厚朴酚、芹菜素或姜黄素单独处理的情况相比，混合处理时细胞凋亡效果显著增加。具体地，和厚朴酚单独处理导致的细胞凋亡为19％，芹菜素单独处理导致的细胞凋亡为22％，姜黄素单独处理导致的细胞凋亡为20％，与上述结果相比较，和厚朴酚+芹菜素混合物导致的细胞凋亡为79％，和厚朴酚+姜黄素混合物导致的细胞凋亡为83％。由此可以确认，所述混合物导致的细胞凋亡效果并非单纯的累加效应(additiveeffect)，而是一种协同效应(synergisticeffect)。由此可以看出，对肺癌患者进行治疗时，与将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独给药的情况相比，和厚朴酚+芹菜素或和厚朴酚+姜黄素混合给药可以增强肺癌治疗功效。

实施例2.将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时肺癌细胞株的ant2表达抑制效果

为了确认和厚朴酚、芹菜素、姜黄素的ant2表达的抑制效果，以人肺癌细胞株a549为对象，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素进行了单独或混合处理。然后，为了确认肺癌细胞株的ant2mrna表达被抑制的情况，执行了qrt-pcr分析。更具体地，将人肺癌细胞株a549用10μm的和厚朴酚、芹菜素、姜黄素进行了单独或混合处理。24小时后，提取rnas(trizolrnaisolationreagents,thermosientific)，通过逆转录反应(rt:reversetranscription)将cdna合成(primescript1ststrandcdnasynthesiskit,takara)之后，再利用sybr(sybrpremixextaq,takara)实施了实时聚合酶链反应(real-timepolymerasechainreaction:qpcr)。作为分析对象的ant2(adeninenucleotidetranslocase2)是一种公知为对癌细胞的生存、增殖及转移发挥非常重要作用的基因。

qrt-pcr实验结果的分析利用了以下公式。

[foldchange＝2-δδct,whereδδct＝(ctofgeneofinterest,treated-ctofhkgene,treated)-(ctofgeneofinterest,control-ctofhkgene,control),ctwasthethresholdcyclenumberandhkwasthehouse-keepinggene.]

另外，用于qpcr的引物碱基序列如下述表1所示。

【表1】

其结果如图2所示，可以确认，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理会导致ant2表达减少。与将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独处理的情况相比，按照和厚朴酚+芹菜素或和厚朴酚+姜黄素进行处理时，ant2的表达抑制效果相对更高。

由此可以判断，将和厚朴酚+芹菜素或和厚朴酚+姜黄素混合给药，能够获得与ant2小干扰rna即shrna(shorthairpinrna)或sirna(shortinterferingrna)产生的癌症治疗效果相似的疗效。另外，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理导致的ant2减少效果利用小干扰rna使ant2减少，从而能够解决对癌症实施治疗时存在的问题，即与sirna或shrna向体内运输(deliverysystem)相关的问题。

实施例3.将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时肺癌细胞株的atp生产减少效果

通过所述实施例2中的结果可以确认，将人肺癌细胞株利用和厚朴酚、芹菜素、姜黄素进行单独或混合处理时，能够有效抑制ant2表达。因此，缘于ant2的功能对癌细胞的atp生产起决定性的作用，预计和厚朴酚、芹菜素、姜黄素的单独或混合处理将会导致癌细胞的atp生产减少。

因此，为了确认ant2表达抑制导致肺癌细胞株的atp生产减少效果，将人肺癌细胞株a549利用和厚朴酚、芹菜素、姜黄素进行了单独或混合处理。然后，利用celltiter-glo^tmluminescentcellviabilityassaykits(promega)进行了分析。

其结果如图3所示，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素进行单独或混合处理时，确认了将人肺癌细胞株的atp生产有效减少的结果。特别是，将和厚朴酚+芹菜素、和厚朴酚+姜黄素混合给药时，与单独给药的情况相比，atp生产减少效果相对增强。

由此可以判断，生存的必需能源即atp的减少会抑制癌细胞的生长，最终诱导癌细胞凋亡，因此，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合给药会抑制ant2的表达，从而诱导atp生产减少。因此，可以通过癌细胞内atp生产抑制效果提高癌症治疗效果。

实施例4.将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时肺癌细胞株的hk2表达抑制效果

为了确认将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理导致的ant2表达抑制是否对干预糖酵解的酶即己糖激酶2(hk2)的表达进行调节，以人肺癌细胞株a549为对象，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理。然后，利用qrt-pcr进行了分析。

qrt-pcr实验结果的分析利用了以下公式。

[foldchange＝2-δδct,whereδδct＝(ctofgeneofinterest,treated-ctofhkgene,treated)-(ctofgeneofinterest,control-ctofhkgene,control),ctwasthethresholdcyclenumberandhkwasthehouse-keepinggene.]

另外，用于qpcr的引物碱基序列如下述表2所示。

【表2】

其结果如图4所示，可以确认到，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时，hk2的表达明显减少，与将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独处理的情况相比，将和厚朴酚+芹菜素或和厚朴酚+姜黄素混合处理时，hk2的表达抑制效果相对更高。

所述hk2酶在正常细胞内其表达量少，但是在大部分癌细胞内hk2的表达量却非常高。另外，所述hk2酶不仅使葡萄糖磷酸化，而且与线粒体的vdac蛋白质结合阻碍细胞凋亡机制(apoptosis)。由此，可以发挥增强癌细胞生存力的功能。因此，将和厚朴酚+芹菜素混合物或和厚朴酚+姜黄素混合物处理导致hk2表达被显著抑制，从而可以在以hk2为目标的癌症治疗过程中，增强其治疗效果。

实施例5.将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时肺癌细胞株的糖酵解速度(glycolysisrate)降低效果

通过所述实施例4的结果可以确认，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理具有抑制hk2表达的效果。因此，为了确认将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理是否能够降低肺癌细胞株的糖酵解速度，以人肺癌细胞株a549为对象，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理。然后，利用lactateassaykit(biovision)进行了分析。

其结果如图5所示，可以确认到，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理，具有导致人肺癌细胞株的糖酵解减少的效果。特别是，与将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独给药的情况相比，将和厚朴酚+芹菜素或和厚朴酚+姜黄素混合给药时，糖酵解减少效果增强。

另外，在癌细胞的葡萄糖代谢过程中，由于线粒体的氧化磷酸化途径存在缺陷，因此在假定主要仅通过糖酵解过程生产atp的前提下，通过糖酵解过程的atp生产效率比氧化磷酸化效率更低。因此，癌细胞为了生产充足的atp，就必须以非常高的标准执行糖酵解过程。因此，据评估，通过与癌症代谢相关酶的抑制产生的代谢抑制作为癌症治疗的目标，其价值非常高。由此期待，将和厚朴酚+芹菜素或和厚朴酚+姜黄素混合处理导致的糖酵解减少效果将能够有效应用于肺癌治疗。

实施例6.将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时肺癌细胞株的pd-l1表达抑制效果

为了确认将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理导致的人肺癌细胞株的pd-l1表达抑制效果，以人肺癌细胞株a549及h2228为对象，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素进行单独或混合处理。然后，将pd-l1蛋白质标准内的表达程度利用蛋白质印迹(western-blot)进行了分析(pd-l1antibody；cell-signaling,actinantibody:santacruze)。

如图6a所示，在所述实施例1～实施例5中使用的肺癌细胞株a549内pd-l1的表达非常低(pd-l1^low)，因此判断为很难确认和厚朴酚、芹菜素、姜黄素是否导致pd-l1的表达减少，所以使用了pd-l1的表达较高的肺癌细胞株h2228(pd-l1^high)。

其结果如图6b所示，可以观察到，将和厚朴酚、芹菜素、姜黄素单独或混合处理时，能够有效抑制pd-l1的表达。特别是，将和厚朴酚、芹菜素或姜黄素单独处理时，可以微弱地观察到pd-l1的表达减少，但将和厚朴酚+芹菜素或和厚朴酚+姜黄素混合处理时，可以观察到pd-l1的表达非常强地被抑制。

如果具有杀灭癌细胞效果的t细胞与存在于癌细胞表面的蛋白质即pd-l1结合，t细胞则无法攻击癌细胞，从而失去杀灭癌细胞的效果。免疫抗癌剂会阻止抗体与pd-l1蛋白质结合，从而让t细胞主动攻击癌细胞。所述抗癌剂增强人体免疫系统，因此不存在现有抗癌剂产生的副作用或者耐性。因此，作为癌细胞的免疫逃避策略之一，通过pd-l1的表达调节，并利用免疫检查点(immunecheckpoint)功能的变化，就可以抑制肿瘤特异t淋巴细胞的功能。即，在肿瘤细胞内激活这种抑制免疫检查点，从而可以逃避肿瘤特异t-淋巴细胞的攻击。最近公知的是，利用pd-l1的单克隆抗体对其功能进行抑制，增强了肿瘤特异t-淋巴细胞活性及效果，由此可以获得抗肿瘤效果。以pd-l1为目标的治疗方法对多种癌细胞取得了此前从未有过的非常有效的临床疗效。

由此可以确认，将和厚朴酚+芹菜素或和厚朴酚+姜黄素混合给药导致的ant2或hk2表达抑制不仅能够直接诱导细胞凋亡，而且通过pd-l1抑制还可以克服肺癌细胞的免疫逃避机制。因此最终将会增强癌症治疗的效果。

上述本发明的说明是示例性的，应当理解具有本发明所属技术领域一般知识的技术人员在不改变本发明的技术思想或者必备特性的前提下，能够容易地变更为其它具体的形态。因此，以上列举的实施例在所有层面都是示例性的，其并不限定本发明的范围。

工业上的可利用性

依据本发明的组合物，与将芹菜素、姜黄素或和厚朴酚单独处理的情况相比，混合或并用处理时能够诱导相互上升地癌细胞凋亡。依据本发明以芹菜素或姜黄素中的任一种及和厚朴酚混合物为有效成分包含的肺癌预防或治疗用药物组合物提高了抗癌效果，可以诱导癌细胞凋亡，表现出了非常优异的癌症治疗增强效果。因此，依据本发明的组合物可以有效应用于肺癌预防、改善或治疗。

<110>百奥医福股份有限公司

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