抗CXCR4抗体的制作方法

本发明涉及单特异性抗cxcr4抗体和结合片段，涉及此类抗cxcr4抗体和结合片段在治疗发明机理涉及cxcr4的活化的疾病中的用途，以及涉及包含此类抗cxcr4抗体和结合片段的药物组合物和试剂盒。
背景技术：
：g蛋白偶联受体(gpcr)，也被称为七次跨膜域受体，形成通常在多种生物和病理过程中起重要作用的蛋白超家族。趋化因子受体代表gpcr的亚家族，趋化因子受体的命名在于它们的配体(即趋化因子)在附近的响应细胞中诱导定向趋化性的能力。在这些趋化因子受体中，cxcr4(在本领域中也被称为，例如，lestr、融合素或cd184)通过介导白细胞的定向迁移和活化而在免疫和炎症反应中起到重要作用。还已经显示cxcr4在多种癌细胞系和组织中表达或过表达。cxcr4的重要配体是基质细胞衍生因子-1(sdf-1，也被称为cxcl12)。cxcr4和sdf-1相互作用似乎在肿瘤发生的多个阶段中起到重要作用，包括肿瘤生长、侵袭、血管生成和转移。泛素是cxcr4的另一种已知的配体。鉴于治疗与cxcr4活化相关的疾病，已经鉴定和/或开发了几种cxcr4拮抗剂。例如，普乐沙福(plerixafor)或amd3100，bicyclamcxcr4拮抗剂，经fda批准供与粒细胞集落刺激因子组合使用以调动造血干细胞进入血流，用于收集和随后的在多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤患者中自体移植。ly2510924，其是一种cxcr4拮抗剂肽，目前处于癌症的ii期临床试验。已知的抗cxcr4抗体的实例是12g5，其是一种通常在实验室实验中用作试剂/阳性对照的小鼠抗体。尽管存在几种可用的或正在开发的靶向cxcr4的药剂，但仍需要靶向cxcr4的有效治疗剂。发明概述本发明涉及一种单特异性抗体或其结合片段，其包含具有cdr1l、cdr2l和cdr3l的轻链可变区和具有cdr1h、cdr2h和cdr3h的重链可变区，其中所述cdr1l包含seqidno:1的氨基酸序列，所述cdr2l包含seqidno:2的氨基酸序列，所述cdr3l包含seqidno:3或4的氨基酸序列，所述cdr1h包含seqidno:5或6的氨基酸序列，所述cdr2h包含seqidno:7、8、9或10的氨基酸序列，且所述cdr3h包含seqidno:11或12的氨基酸序列。还包含seqidno:1-12的序列的变体，该变体含有一个或多个保守性修饰。该抗体或结合片段特异性结合人cxcr4。本发明还涉及一种单特异性抗体或其结合片段，其包含轻链可变区，该轻链可变区包含seqidno:13或14的氨基酸序列。还包含后者序列的变体，该变体含有保守性修饰。该单特异性抗体或结合片段进一步包含重链可变区，该重链可变区包含seqidno:15、16、17、18或19的氨基酸序列。还包含后者序列的变体，该变体含有一个或多个保守性修饰。该抗体或结合片段特异性结合人cxcr4。在具体的实施方案中，本发明的上述单特异性抗体或结合片段分别是人经工程化的抗体或结合片段。在更具体的实施方案中，本发明的上述单特异性抗体是igg同种型的。本发明进一步包含本发明的单特异性抗体和结合片段的治疗应用以及诊断应用。在发现人或其他哺乳动物受试者中表达cxcr4癌细胞的体外诊断测定中，可在采用本发明的单特异性抗体或结合片段来检测cxcr4的免疫化学或免疫组织化学测定中分析取自受试者的含有癌细胞的活组织检查或流体样品。发现人或其他哺乳动物受试者中的表达cxcr4的癌细胞和组织的体内诊断测定可利用已经被放射性标记的本发明的单特异性抗体或结合片段。在该测定中，将该放射性标记的抗体或结合片段施用(典型的是胃肠外施用)至该受试者，并且通过免疫闪烁成像术评定该抗体或结合片段的分布。本发明还涉及治疗表达cxcr4的癌症(包括伯基特氏淋巴瘤和乳腺癌)的方法，其包括施用治疗有效量的本发明的单特异性抗体或结合片段至需要此类治疗的人或其他哺乳动物受试者。本发明进一步涉及本发明的单特异性抗体或结合片段用于治疗表达cxcr4的癌症(包括伯基特氏淋巴瘤和乳腺癌)的用途。本发明还涉及预防表达cxcr4的乳腺癌或另一种癌症的转移的方法，其包含施用治疗有效量的本发明的单特异性抗体或结合片段至需要此类治疗的人或非人哺乳动物受试者。本发明进一步涉及本发明的单特异性抗体或结合片段用于预防表达cxcr4的乳腺癌或其他癌症的转移的用途。本发明还涉及药物组合物，其包含治疗有效量的本发明的单特异性抗体或结合片段和药物可接受赋形剂。典型地，此类药物组合物用于胃肠外施用至受试者，因此包含治疗有效量的本发明的单特异性抗体或结合片段、胃肠外可接受的稀释剂和任选的药物可接受赋形剂。还包含包含本发明的单特异性抗体或结合片段的诊断试剂盒。本发明还涉及编码本发明的单特异性抗体或结合片段的分离的多核苷酸。因此，它还涉及编码单特异性抗体或其结合片段的多核苷酸(或分离的多核苷酸)，该单特异性抗体或其结合片段包含具有cdr1l、cdr2l和cdr3l的轻链可变区和具有cdr1h、cdr2h和cdr3h的重链可变区，其中所述cdr1l包含seqidno:1的氨基酸序列，所述cdr2l包含seqidno:2的氨基酸序列，所述cdr3l包含seqidno:3或4的氨基酸序列，所述cdr1h包含seqidno:5或6的氨基酸序列，所述cdr2h包含seqidno:7、8、9或10的氨基酸序列，且所述cdr3h包含seqidno:11或12的氨基酸序列。还包含seqidno:1-12的序列的变体，该变体含有一个或多个保守性修饰。从后者多核苷酸表达的抗体或结合片段特异性结合人cxcr4。例如，该多核苷酸可包含seqidno:20的编码cdr1l的多核苷酸、seqidno:21的编码cdr2l的多核苷酸、seqidno:22或23的编码cdr3l的多核苷酸、seqidno:24或25的编码cdr1h的多核苷酸、seqidno:26、27、28或29的编码cdr2h的多核苷酸、和seqidno:30或31的编码cdr3h的多核苷酸。更具体地，编码单特异性抗体或其结合片段的多核苷酸(或分离的多核苷酸)可包含包含seqidno:13或14的氨基酸序列的轻链可变区。还包含后者序列的变体，该变体含有保守性修饰。该单特异性抗体或结合片段进一步包含重链可变区，该重链可变区包含氨基酸序列seqidno:15、16、17、18或19。还包含后者序列的变体，该变体含有一个或多个保守性修饰。从后者多核苷酸表达的抗体或结合片段特异性结合人cxcr4。例如，该多核苷酸可包含seqidno:32或33的编码轻链可变区的多核苷酸和seqidno:34、35、36、37或38的编码重链可变区的多核苷酸。附图简述图1代表igg1形式的本发明的抗体结合cxcr4的剂量响应曲线(如依照实施例4所述获得的)。图1a至1e分别代表v62.1、v62.1-r108h、v62.1-h-m80、v62.1-h-m43-m38和v62.1-h-m47-m38的剂量响应曲线。图2代表如在实施例12的抗转移模型中测量的小鼠的乳腺区中的体内萤光素酶活性。发明详述本发明涉及抗cxcr4抗体及其用途，而且涉及包含抗cxcr4抗体的药物组合物。为了可以更容易理解本发明，下面具体定义某些术语。除非在本文件的其他地方明确定义，否则本文使用的所有其他技术和科学术语具有相关领域的普通技术人员通常理解的含义。如本文(包括所附权利要求书中)所用的，除非上下文另有明确说明，否则诸如“一(a、an)”和“该(the)”的单数形式的词语包括其对应的复数提及。术语“人cxcr4”是指其氨基酸序列与具有genbank登录号p61073的人cxcr4的完整氨基酸序列具有至少90％、至少95％，或至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质，或是指具有与cxcr4基本上相同的生物功能但通过一个或多个氨基酸的替代、插入或缺失而不同于人cxcr4的完整氨基酸序列的蛋白质。“抗体”的一般结构在本领域中是公知的。对于igg型的抗体，存在经由链间二硫键交联的四条氨基酸链(两条“重”链和两条“轻”链)。重和轻链中的每条链具有可变n端区和恒定区。免疫球蛋白抗体的恒定区被称为fc部分，且在人中高度保守。每个轻/重链对的可变区形成包含抗体的抗原结合位点的可变域。重链可变区和轻链可变区中的每个可进一步细分为具有高可变性的区域，即互补决定区(cdr)，其间散布着更保守的区域，即框架区(fr)。每个可变区由三个cdr和四个fr组成，它们按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本文中，重链的三个cdr被称为cdr1h、cdr2h和cdr3h，且轻链的三个cdr被称为cdr1l、cdr2l和cdr3l。cdr含有大部分的与抗原形成特异性相互作用的残基。在以下中，重链可变区和轻链可变区可分别称为hcvr和lcvr。如本文所用的，术语抗体或结合片段或其部分的指定氨基酸序列的“保守性修饰”是指不显著影响或改变包含该氨基酸序列的该抗体、结合片段或其部分的结合特性的氨基酸修饰。此类保守性修饰包括氨基酸替代、添加和缺失。可通过本领域已知的标准技术将修饰引入本公开的抗体中，诸如定点突变和pcr介导的诱变。保守性氨基酸替代是氨基酸残基由具有相关化学特性的侧链的氨基酸残基取代的氨基酸替代。具有相关化学特性的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β-分支的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)的氨基酸。因此，本公开的抗体的cdr区内的一个或多个氨基酸可由来自同一侧链家族的其他氨基酸残基取代，且使用本文所述的功能测定法可以测试该改变的抗体的保留的抗原结合性质。本文所用的序列编号遵循kabat等(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda。本文所用的cdr定义遵循maccallum等(1996)j.mol.biol.626:732-745。根据本发明的抗体可以是完整的，其包含完整的或全长恒定区(包括fc区)，或此类抗体的部分或片段(“结合片段”)，该结合片段包含抗原结合部分且保留抗原结合能力。此类部分或片段可包括，例如，fab片段(“片段抗原结合”；即抗体的结合抗原的区域)，其由一对各自均含有恒定区和可变区的重链和轻链片段组成，或fab'或f(ab')2片段，其包括本文公开的抗cxcr4抗体的cdr或可变区。此外，此类部分或片段可以是单链fv片段，其可由包含编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列的多核苷酸产生，其中后者的核苷酸序列通过接头序列分开(例如，pluckthun,thepharmacologyofmonoclonalantibodies,vol.113,rosenburgandmooreeds.,springer-verlag,newyork,pp269-315,1994)。无论是否指定片段或部分，除非另有说明，否则本文所用的术语“结合片段”包括此类片段或部分以及单链形式。只要蛋白质保留特异地或优先结合cxcr4的能力并包括本文公开的一个或多个cdr序列，它分别包括在术语“抗体”和“结合片段”中。应理解，仅全长抗体可以执行某些效应器功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(adcc)。本发明的抗体可具有选自免疫球蛋白类(iga、igd、igg、igm、和ige)中的任一个的重链恒定区。优选地，本发明的抗体是igg型的，更优选的是lgg1同种型的。应理解，除非有相反的指示，否则本文中的术语“igg1”指人igg1。术语“人经工程化的抗体”是指具有与衍生自人基因组序列的框架、铰链区和恒定区相同或基本相同(基本上是人的)的人源的框架、铰链区和恒定区的抗体。全人框架、铰链区和恒定区包含在人种系中表达的序列以及含有自发体细胞突变的序列。人经工程化的抗体可包含衍生自全人框架、铰链或恒定区的其中含有一个或多个氨基酸替代、缺失或添加，和/或糖基化修饰的框架、铰链、或恒定区。“人经工程化的结合片段”是指人经工程化的抗体的部分或片段。通常，人经工程化的抗体在人体中基本上是非免疫原性的。多种不同的人框架序列可单独使用或组合使用作为本发明的人经工程化的抗体的基础。优选地，本发明的抗体的框架区是人源的或是基本上是人的(人源的至少95％、97％或99％)。人源的框架区的序列可从shire等的currenttrendsinmonoclonalantibodydevelopmentandmanufacturing，isbn978-0-387-76643-0中获得。优选地，在根据本发明的抗体中，重链的框架区对应于种系共有序列亚组iii。还优选地，在根据本发明的抗体中，轻链的框架区对应于种系κiii共有序列。如本文所用的，术语“单特异性抗体”或“单特异性抗体组合物”是指具有相同蛋白序列(离子或氧化微变体包括在内)的抗体分子的制剂。单特异性抗体组合物显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力。如本文所用的，“特异性结合人cxcr4”的抗体是指以50nm或更少的ec50(如在下文的实施例4中所述的基于荧光流式细胞术的测定中测量的)结合人cxcr4(和可能是来自一种或多种非人物种的cxcr4)但基本上不结合其他gpcr(诸如，例如cxcr7)的抗体。如本文所用的，当提及抗体时，短语“基本上不结合”非cxcr4蛋白意指该抗体根本不结合或仅表现出与非cxcr4蛋白的弱结合。此类弱结合的ec50值可以等于或大于100nm，如在实施例4中所述的基于荧光流式细胞术的测定中测量的。如本文所用的，adcc是指抗体依赖性细胞毒性，即，抗体介导的细胞死亡，其是主要由fc区引起的抗体效应器功能。igg同种型的抗体，特别是igg1，因具有良好的adcc性质而闻名。当在本文中提及sdf-1或cxcl12时，除非另有规定或例示，否则其意指任何和所有的人sdf-1变体，包括例如sdf-1α或cxcl12a和sdf-1β或cxcl12b。当提及结合性质时，半数最大有效浓度50(ec50)是诱导指定基线和抗体的最大结合之间的一半响应的浓度。其经由剂量响应曲线计算，如在本文中的实施例4中解释的。“受试者”是哺乳动物，优选是人。术语“治疗(treating)”(或“治疗(treat或treatment)”)意指减慢、停止、降低或逆转症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。术语“预防(preventing)”(或“预防(prevent或prevention)”)意指阻止、限制或抑制症状、病症、病况或疾病的发病、发生或复发。术语“治疗有效量”是指向患者单一剂量或多剂量施用后提供所需治疗的本发明的抗体的量或剂量。本发明的特定抗体起源于噬菌体展示文库，以及来自本文所述的亲和力成熟过程。噬菌体展示文库是用于选择抗体片段的常用技术，其为人工程化抗体的产生和优化提供了起点。参见，例如hoogenboom(2005)nat.biotechnol.23:1105-1116；bradbury&marks(2004)j.immunol.methods290:29-49；和fredericks等,(2004)proteineng.des.sel.17:95-106。用于产生和亲和力成熟(优化)的其他类型的展示技术，包括酵母-、mrna-和核糖体-展示文库，开始流行用于选择和优化抗体(参见hoogenboom,bradbury&marks,和fredericks等)。展示文库可展示单链可变域抗体片段(scfv)或fab片段，并含有编码dna或rna。它们具有高基因多样性或储备大小(repertoiresize)(通常为10λ9-10λ13)。这些文库中的基因多样性通常通过克隆来自幼稚(navie)或经免疫的个体的免疫球蛋白重链和轻链可变基因片段的储备而创建。可替代地，此多样性可通过随机化cdr序列来获得，其包括使用化学合成的cdr片段，或通过这两种方法的组合。然后，可以与溶液中的、固定在表面上的、在脂质体(诸如美国专利6,761,902中描述的蛋白脂质体)上的、在细胞上等的靶标(受体)进行结合步骤(用于从此类文库中选择)。在充分洗涤后，回收结合的克隆并扩增用于进一轮的选择。然后，可对初始最佳结合抗体候选物进行亲和力成熟过程，以试图获得具有改善的性质(诸如更好的稳定性和/或改善的结合等)的衍生候选物。几种亲和力成熟策略对本领域技术人员而言是可获得的，诸如，但不限于，定向全面诱变(directedcomprehensivemutagenesis)、cdr或轻/重链改组、cdr中的一个或多个点插入或缺失、或这些方法的任何组合。本发明的特定抗体包括如本文实施例1和2中公开的抗体。应理解，本发明还包括本文提供的可变区之间的每个可能的cdr交换。优选地，一个重链cdr可与另一重链可变区cdr交换，同样地，一个轻链cdr可与另一轻链可变区cdr交换。抗体合成本发明的抗体可使用本领域公知的技术产生，该技术例如重组技术、体外蛋白表达技术或此类技术的组合或本领域容易知晓的其他技术。例如，直接从fab展示文库筛选获得的或在亲和力成熟之后获得的fab片段可通过常用的技术被转变为igg，该技术诸如克隆至编码期望的恒定区的合适的表达载体中。为了直接产生igg抗体，合适的宿主细胞，诸如hek293或cho细胞，可用适于产生和分泌igg抗体的表达系统瞬时或稳定转导。该表达系统将包含：以优化的比率转导的重链表达构建体和轻链表达构建体，或包含可表达的轻链以及重链基因的单一载体系统。分泌的抗体可使用许多常用的技术中的任一种进行纯化。例如，含有抗体的培养基可方便地应用于已用相容缓冲液(例如磷酸盐缓冲的盐水(ph7.4))平衡的蛋白a或g琼脂糖ff柱。然后洗涤该柱以去除非特异性结合的组分。洗脱结合的抗体，例如，通过应用ph梯度。检测含有抗体的级分，例如，通过sds-page，并合并该级分。取决于预期用途，可以进一步纯化该抗体。抗体可使用常规技术来浓缩和/或无菌过滤。可溶性聚集物和多聚体可通过常规技术有效去除，该常规技术包括尺寸排阻、疏水相互作用、离子交换或羟磷灰石色谱分析。纯化的抗体通常可以冷藏、冷冻或冻干保存。本领域技术人员将知晓可以使用细胞类似地产生fab抗体，该细胞诸如细菌、真菌(酵母)或昆虫细胞。本发明的抗体的性质表征fab形式和/或igg形式的本发明的抗体的若干需要的生物特性。与cxcr4的结合是根据本发明的抗体的功效的第一个标准。根据本发明的抗体以低于50nm，优选低于10nm的ec50特异性结合cxcr4，如通过使用从转染的可表达的基因表达cxcr4的细胞和/或表达cxcr4的肿瘤细胞系的实验显示的。将fab片段转化为igg抗体通常提高受体结合(ec50)。这也用本发明的抗体得到了验证。优选地，当其为lgg1形式时，根据本发明的抗体以低于5nm的ec50特异性结合cxcr4。本发明的抗体抑制sdf-1与cxcr4受体的结合并阻止受体活化。sdf-1与其受体结合的结果包括例如钙通量诱导和细胞迁移，这是癌细胞侵袭的重要参数。本发明的抗体抑制钙通量诱导和/或表达cxcr4的细胞的迁移。如对于抗体诸如曲妥珠单抗和利妥昔单抗已经证实的，adcc可以是抗肿瘤的治疗性抗体的重要作用机制。显示本发明的抗体有adcc的能力。使用异种移植肿瘤模型的研究证明了本发明的抗体的抗肿瘤活性。药物组合物和其施用本发明还涉及包含本发明的抗体的药物组合物。后者组合物优选胃肠外施用，但也预想了经鼻、经肺或经皮递送。该药物组合物可含有任何常规的非毒性药物可接受的赋形剂，且在液体配制剂的情况中，可含有稀释剂。在一些情况中，该配制剂的ph可用药物可接受的酸、碱或缓冲液调整，以增强经配制的药剂或其递送形式的稳定性。本文所用的术语胃肠外包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注。本发明的抗体可作为冻干的配制剂或作为溶液储存。可注射的制剂，例如，无菌可注射水性或油性悬浮剂，可根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮液配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液。水、林格氏溶液、u.s.p.和等渗氯化钠溶液也在可采用的可接受的稀释剂的范围内。此外，无菌固定油通常用作溶剂或悬浮介质。该组合物可进一步包含本领域中代表性采用的“药物可接受”的赋形剂或稳定剂(所有的这些均被称为“赋形剂”)。赋形剂包含例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、张力剂、非离子去垢剂、抗氧化剂和其他各种添加剂。(参见remington'spharmaceuticalsciences,第16版,a.osol,ed.(1980))。这些添加剂必须在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。缓冲剂优选以约2mm至约50mm的浓度存在。合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠盐混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、延胡索酸盐缓冲液(例如，延胡索酸-延胡索酸单钠混合物等)、延胡索酸盐缓冲液(例如，延胡索酸-延胡索酸单钠混合物、延胡索酸-延胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物，草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲液(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。此外，可以有提及的磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐诸如tris。可以添加防腐剂以阻止微生物生长，且可以以0.2％-1％(w/v)的量添加。适用于本发明的防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵(例如苯扎氯铵、苯扎溴铵、苯扎碘铵)、氯化六甲双铵、对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。药物组合物的渗透压可以用张力剂调节至与组合物的预期用途相容的值。例如，可注射溶液的渗透压可调节至近似血液的渗透压，其相当于水中约0.9w/v％的氯化钠。合适的张力剂的实例包括钠、钾、钙和镁的氯化物盐，右旋糖，甘油，丙二醇，甘露醇，山梨糖醇，赤藓糖醇，阿拉伯糖醇，木糖醇等，以及它们的混合物。张力剂典型地以约0.001至约1％w/v的量使用。已发现这些量可用于提供生理学上可接受的张力。优选地，一种或多种张力剂将以为组合物提供150至450mosm/kg，更优选约220和约350mosm/kg之间，且最优选约270和约300mosm/kg之间的最终渗透值的量使用。该组合物可进一步包含稳定剂。典型的稳定剂可以是多元糖醇(以上列举)；氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、l-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇，甘油和类似物，包括环多醇诸如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含有硫的还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10个残基)；蛋白质诸如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖诸如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖诸如乳糖、麦芽糖、蔗糖，和三糖诸如棉子糖；多糖诸如葡聚糖。稳定剂可以以本发明抗体重量的0.1至10,000倍的重量存在。可添加润湿剂以帮助溶解本发明的抗体以及保护其免受搅动诱导的聚集。合适的润湿剂包括非离子表面活性剂诸如聚山梨醇酯(20、80等)、polyoxamer(184、188等)、pluronic.rtm、多元醇、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单醚(吐温.rtm.-20、吐温.rtm.-80等)。非离子表面活性剂可以以约0.05mg/ml至约1.0mg/ml，优选约0.07mg/ml至约0.2mg/ml存在。该药物组合物还可含有对于所治疗的特定适应症所必需的额外的活性化合物，优选不会不利地影响本发明的抗体的活性的具有活性的化合物。例如，当正在治疗癌症时，可能需要进一步提供一种或多种化学治疗剂。此类化合物适合以对预期目的有效的量组合存在。该药物组合物可以例如通过穿过无菌过滤膜过滤而灭菌。本发明的抗体还可包埋在微胶囊中(例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的，分别例如羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或粗乳液中。此类技术在remington'spharmaceuticalsciences,16thedition,a.osal,ed.(1980)中公开。可制备缓释制剂。可适于递送本发明抗体的缓释制剂的合适实例包括含有该抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成型制品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇))，聚交酯(美国专利号3,773,919)，l-谷氨酸和l-谷氨酸乙酯(ethyl-l-glutamate)的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯(ethylene-vinylacetate)，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物和聚-d-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子持续超过100天，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当包封的抗体长时间保留在体内时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物活性的丧失和可能的免疫原性变化。可以根据所涉及的机制设计合理的策略以实现稳定。例如，如果发现聚集机制是通过巯基-二硫化物互换形成分子间s-s键，则可以通过修饰含巯基的残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。考虑到受试者的年龄和症状，可以适当选择施用方法。本发明的抗体或结合片段的药物组合物中的剂量可以是，例如，每次施用约0.0005至约100mg/kg。更优选地，该剂量可以是每次施用约0.1至约20mg/kg。施用可以是每日几次、每日一次、每隔一天、半周一次或一周一次。然而，本发明不受上述数值的限制。剂量和施用方法根据受试者的体重、年龄、症状等变化。本领域技术人员可考虑到上述因素来设定适当的剂量和施用方法。本发明的抗体的诊断用途本发明的抗体和结合片段可在诊断测定中有用，该诊断测定例如用于检测特定细胞、组织或血清上的cxcr4的表达的测定。为了诊断应用，该抗体典型地将被可检测的部分标记。许多标记是可用的。酶标记的实例包括萤光素酶(例如，萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4,737,456)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶诸如辣根过氧化物酶(hrpo)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合至抗体的技术记载于o'sullivan等,methodsforthepreparationofenzyme-antibodyconjugatesforuseinenzymeimmunoassay,inmethodsinenzym.(ed.langone&vanvunakis),academicpress,newyork,73:147-166(1981)。有时，标记与抗体间接缀合。本领域技术人员知晓多种用于实现间接缀合的技术。例如，抗体可与生物素缀合，且上述标记中的任一种可与亲和素缀合，反之亦然。生物素选择性结合亲和素，因此，标记可以此间接的方式与抗体变体缀合。可替代地，为了实现标记与抗体的间接缀合，抗体与小的半抗原(例如地高辛)缀合，且上述不同类型的标记之一与抗半抗原抗体(例如抗地高辛抗体)缀合。由此可以实现标记与抗体的间接缀合。在本发明的另一个实施方案中，本发明的抗体不需要标记，且本发明的抗体的存在可使用结合该抗体的标记的抗体来检测。本发明的抗体或结合片段可用于任何已知的免疫化学测定方法，诸如竞争结合测定法、直接和间接夹心测定法、和免疫沉淀测定法。zola,monoclonalantibodies:amanualoftechniques,pp.147-158(crcpress,inc.1987)。它们还可用于细胞和组织上的cxcr4的免疫组织化学检测。对于免疫组织化学，组织样品，例如肿瘤组织样品，可以是新鲜的或冷冻的，或可以包埋在石蜡中并用防腐剂例如福尔马林固定。抗体还可用于体内诊断测定。通常，抗体或结合片段用放射性核苷酸(诸如111in、"tc、14c、131i、3h、32p或35s)标记，使得过表达cxcr4的细胞可使用免疫闪烁成像术来定位。本发明的抗体或结合片段可以提供在试剂盒中，即预定量的试剂与用于进行诊断测定的说明书一起的包装组合。当抗体用酶标记时，该试剂盒可包括该酶所需的底物和辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。此外，可包括其他添加剂诸如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。多种试剂的相对量可以广泛变化，以提供基本上使测定的灵敏度最优的试剂在溶液中的浓度。特别地，试剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适当浓度的试剂溶液。本发明的抗体和结合片段的人治疗用途本发明的抗体可用于干细胞和再生医学。cxcr4与sdf-1α的相互作用对于在骨髓中保持造血干细胞是重要的。抗cxcr4抗体可用作拮抗剂，其能够将造血干细胞作为外周血干细胞调动到血流中。外周血干细胞调动在造血干细胞移植(作为移植手术收获的骨髓的替代方案)中可以是重要的，且目前使用诸如g-csf的药物进行。本发明的抗体和结合片段还可用于阻止晚期hiv(x4病毒)与cxcr4受体相互作用并进入t细胞。本发明的抗体和结合片段还可用于治疗多种不同的表达cxcr4的癌症。cxcr4可以是在人和实验鼠癌症中的肿瘤细胞上最常见的趋化因子受体。已经在至少下列肿瘤类型上发现了该受体：b-cll、aml、b种系all(包括伯基特氏淋巴瘤)、滤泡性中枢骨髓瘤、cml、多发性骨髓瘤、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌、宫颈癌、神经母细胞瘤、肾癌、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌肉瘤、小肺癌和黑色素瘤。balkwill(2004)seminarsincancerbiology14:171-9。治疗将涉及向癌症患者施用包含本发明的抗体或结合片段的药物组合物。该组合物可通过任何适合的方式施用，包括胃肠外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和病灶内施用。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，该抗体或结合片段适合通过脉冲输注施用，特别是用递减剂量的抗体或结合片段施用。优选地，通过注射最优选静脉内或皮下注射给药，这部分地取决于施用是短暂的还是慢性的。根据疾病的类型和严重性，约0.1mg/kg至约20mg/kg的抗体或结合片段是用于施用至受试者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，还是通过连续输注。典型的日剂量可以为约1mg/kg至100mg/kg或更高。将以符合良好医学实践的方式配制、给药和施用包含本发明的抗体或结合片段的药物组合物。在此上下文中考虑的因素包括癌症的类型和阶段、个体受试者的临床状况、药剂的递送位点、施用的方法、施用的时序安排以及医师已知的其他因素。待施用的抗体的“治疗有效量”将取决于此类考虑，且是治疗该疾病所需的最小量。抗体不必，但任选地与一种或多种目前用于治疗该疾病的药剂(例如一种或多种化学治疗剂)一起配制。此类其他药剂的有效量取决于配制剂中存在的抗体或结合片段的量、癌症的类型和阶段、和以上讨论的其他因素。它们通常以与目前使用(不含本发明的抗体)的相同剂量和施用途径或约1至99％的目前采用的剂量使用。实施例实施例1：fab噬菌体文库的制备和噬菌体抗体的筛选本发明的抗体最初衍生自大小为10^11的fab文库，该fab文库包含携带fab大肠杆菌密码子优化的合成基因的psf1噬菌粒，该合成基因编码具有随机化的cdr的人fab重链和人fab轻链。对于重链，采用框架dp47，对于轻链，采用框架dpk22。采用如knappik等(2000)j.mol.biol.296:57-86；lee等(2004)j.mol.biol.340:1073-93；hoet等(2005)23:344-8中描述的流程和cdr随机化方案生成噬菌体文库。更具体地，在fab文库中，对重链cdr1、cdr2和cdr3和轻链cdr3进行随机化。对于重链cdr3的随机化，如knappik等中描述的采用基于三核苷酸的寡核苷酸，而对于其他cdr，采用标准核苷酸混合物以生成cdr寡核苷酸。fab文库的常见轻链cdr如下(maccallum等(1996)j.mol.biol.626:732-745)：cdr1l-ssylawy-(seqidno.1)cdr2l-lliygassra-(seqidno.2)为了fab文库的筛选，使用magneticproteoliposome技术以便在脂质体膜内以与其天然构象非常相似的构象展示cxcr4。参见mirzabekov等(2000)natbiotechnol.18:649-54和美国专利号6,761,902。使用由mirzabekov等描述的方法进行fab文库的筛选，并产生以下fab候选物：实施例2:亲和力成熟然后对如上所述的初始候选物进行亲和力成熟。分别通过cdr2h或cdr3l随机化生成两个亲和力成熟文库。对这些文库中的每一个进行两轮高严格性选择。选择的fab单独表达，并保留具有改善的结合性质的克隆。将最好的克隆重构成igg，该igg的特征在于最佳cxcr4结合亲和力和选择性以及防止配体诱导ca-通量的最佳能力。作为最后的步骤，重组最有前景的重链和轻链，且如前所述再次表征所得的igg。此外，cdr3h通过引入点突变而成熟。对所得的突变的fab片段进行表征以鉴定最佳cxcr4结合物。进一步获得以下成熟的抗体候选物：*r108h是指cdr3h中的点突变(对比seqidno:11和12)，且m38、m43、m47和m80分别指特定选择的cdr2h或cdr3l序列。如先前提及的，本发明的所有抗体共享相同的cdr1l(seqidno.1)和cdr2l(seqidno.2)。实施例3：igg抗体的合成根据nrc-bri提供的流程使用来自加拿大国家研究委员会生物技术研究所(nrc-bri)的cho/ptt瞬时转染系统。参见国际专利申请公开wo2009/137911a1。更具体地，每个感兴趣的igg在使用聚乙烯亚胺(pei)作为转染试剂用分别表达该igg的轻链和重链的ptt载体共转染的cho-3e7细胞中产生。收集含有igg的细胞培养基，并在蛋白a加琼脂糖(pierce)上使用标准方法学纯化igg。使用无菌、无内毒素的溶液进行所有纯化过程。在以下实施例中，视情况地将感兴趣的fab片段或感兴趣的igg抗体称为“测试fab”、“测试抗体”或“测试igg”。实施例4：与表达cxcr4的细胞的结合fab或igg与表达cxcr4的细胞的结合通过基于荧光流式细胞术的测定法测量。该细胞用以下染色：(a)对于fab——抗c-myc小鼠抗体9e10mab，其结合在测试fab中存在的标签，之后用第二抗小鼠igg藻红蛋白(pe)缀合的抗体染色，或(b)对于igg——用抗人fcpe缀合的抗体染色。作为对照，使用不表达cxcr4的细胞或表达其他gpcr的细胞。基于荧光流式细胞术的测定法的典型流程如下。将10微升的经纯化的测试igg溶液或作为对照的缓冲液添加至含有大约30,000个经转染以表达人cxcr4的cf2-th细胞的10微升的悬液中。在冰上孵育40分钟后，用facs缓冲液(磷酸盐缓冲的盐水(pbs)，ph7.4；2％胎牛血清，0.1％叠氮化钠)洗涤细胞以去除未结合的抗体。然后，将10微升的藻红蛋白(pe)缀合的小鼠抗人fc单克隆抗体(1/20稀释；登录号12-4998-82，ebioscienceinc.，sandiego，ca)的溶液添加至该细胞，并在冰上孵育30分钟后，洗涤细胞两次，然后福尔马林固定(固定缓冲液：pbs，ph7.4；0.5％甲醛)。通过荧光流式细胞术使用guava-pca96仪器(emdmilliporechemicals，merckkgaa，darmstadt，germany)分析固定的样品。为了测定ec50值，在不同浓度的测试抗体下测量与表达cxcr4的细胞的结合。对于每个浓度，分析一式两份或一式三份样品。基于由使用softmaxpro5程序(moleculardevicescorp.，sunnyvale，ca)的仪器提供的平均荧光强度(mfi)值构建滴定曲线。在一些实验中，非转染的cf2-th亲本细胞(crl-1430tm)用作阴性对照，由此建立cxcr4的抗体特异性。在一些其它实验中，平行地测试几批相同的抗体候选物。用igg1形式的测试抗体获得的剂量响应曲线和ec50结果在图1a-e中呈现。所有测试igg1抗体显示出远低于10nm的ec50。实施例5：与表达cxcr4的人淋巴瘤细胞的结合测试igg与表达cxcr4的人淋巴瘤细胞(ramos；ra1,crl-1596tm)的结合通过基于荧光流式细胞术的测定法测量。肿瘤细胞染色如下进行：通过在4℃在含有2％人血清和0.5mmedta的pbs中孵育30分钟而使ra1细胞的人fcγ受体饱和。然后将细胞与测试igg或人同种型igg1κ对照(cogersari,paris,france)(两种抗体类型均为10μg/ml)在4℃温育1小时。将该细胞用pbs洗涤并进一步与山羊f(ab')2片段抗人igg(h+l)-pe(beckmancoulter)在4℃孵育1小时。将该细胞用pbs洗涤两次并用pbs中0.5％甲醛固定用于流式细胞术分析。使用十一色流式细胞术(lsrii，bdbiosciences)获取数据，并使用flowjo流式细胞术分析软件(treestarinc.，ashland，or)进行分析。使用侧向散射(ssc)和前向散射(fsc)选择活细胞；每次分析获得10,000个事件。使用pe通道记录mfi值。mfi值远高于同种型对照的mfi值指示ra1细胞的阳性染色，对于所有测试igg都观察到了这种结果。实施例6：对cxcr4的特异性比较过表达除了cxcr4之外的不同gpcr的细胞和几个经转染以过表达cxcr4的系(r1610-hcxcr4、cf2th-hcxcr4和cho-hcxcr4)。培养物与100nm的测试igg在facs缓冲液中在4℃孵育40分钟。其后，细胞洗涤两次，用抗人-fc抗体-pe缀合物(jacksonimmunoresearchlaboratoriesinc.，westgrove，pa)染色，在facs缓冲液中洗涤两次，然后转移至固定缓冲液中。荧光强度通过guavapca-96在425v测量(一式三份)。使用可商购的抗体(阳性对照)确认除了cxcr4之外的gpcr的表达。例如，商业抗cxcr1抗体用作阳性对照，用于确认在转染cxcr1的cho细胞上的cxcr1的表达。获得的mfi数据的总结显示在下表中。实施例7：配体结合cxcr4的抑制借助荧光流式细胞术使用细菌表达的含有n-端flag标签的sdf-1α测定sdf-1α配体结合的抑制。经转染以表达cxcr4的cf2-th细胞与测试igg抗体(100nm)在冰上孵育30分钟。其后，添加flag-标记的配体至终浓度为100nm，且该细胞再次孵育20分钟。随后，细胞经洗涤，用适当的抗flag标签的pe缀合的抗体染色，并用固定缓冲液固定。在对照中，未添加抗体。然后，记录荧光。相较于未暴露于igg测试抗体的细胞的mfi(mfi无ab)，暴露于测试抗体的细胞的降低的mfi值(mfi具有ab)，指示抗体和配体之间存在竞争。抑制百分比定义为(mfi具有ab/mfi无ab)x100％。相似的mfi具有ab和mfi无ab值指示预结合的测试抗体未能阻止标记的配体与细胞表面上的cxcr4结合。测试的抗体，即v62.1和v62.1r108h，能够抑制配体结合高达96％。实施例8：sdf-1诱导的钙通量的抑制基于在cxcr4转染的chem-1细胞(目录号hts004c，emdmilliporechemicals)上从flipr钙测定(calcium-5试剂盒，moleculardevicesllc，sunnyvale，ca)获得的数据评估ic50值。细胞在37℃和5％co2下生长过夜。在ca通量测量之前，将细胞在无血清培养基中在37℃和5％co2下饥饿3小时。将染料添加至细胞，然后将细胞在不同浓度的测试igg1抗体的存在下于37℃和5％co2孵育30分钟。类似地制备对照样品，但不添加抗体。其后，将tbs中的sdf-1α(r&dsystems)添加至加载染料的细胞至终浓度为30nm。如下计算趋化因子诱导的细胞内钙浓度(ca通量)增加的抑制：其中[i]-意指抑制的样品(n＝4)中的峰值染料荧光。[c]-意指对照样品(n＝18)中的峰值染料荧光。绘制剂量响应曲线并计算ic50值。ic50代表观察到sdf-1α诱导的钙通量的50％抑制时的测试igg的浓度。针对不同测试igg测定的ic50值的总结显示在下表中：测试抗体ic50(nm)：v62.17.4v62.1-r108h6.8v62.1-r108h-m43-m383.8v62.1-r108h-m47-m385v62.1-r108h-m80-wt7.5所有测试抗体显著抑制表达cxcr4的细胞中sdf-1α诱导的钙通量。实施例9：趋化性/细胞迁移的抑制人u937细胞在具有10％fcs的rpmi-1640培养基中生长，然后洗涤两次，并在无血清的rpmi-1640中在37℃孵育3小时(5％co2)。将饥饿的u937细胞以每毫升3*10∧5个细胞重悬于用于趋化性的培养基(具有0.3％bsa的rpmi-1640)中，并且a)在室温下孵育30分钟(用于测定的未预处理的阳性对照)；b)在室温下用1μm浓度的amd3100(趋化性抑制的阳性对照)预处理30分钟；或c)在室温下用100nm浓度的测试igg预处理30分钟。然后将未预处理或预处理的u937细胞分别置于微趋化室的顶部孔中(每孔15,000个细胞)。如下表中示意性地呈现了补充底部孔。具有8μm孔径的聚碳酸酯过滤器将顶室和底室分开。在37℃(5％co2)孵育1小时后，从顶部孔中去除细胞悬浮液，用pbs洗涤该孔一次。然后，将室以500rpm离心4分钟，并将来自底部孔的迁移细胞转移到含有50μlpbs的v形96孔板的孔中。使用guavapca-96细胞计数器测定每个孔中迁移细胞的数量。所有测量均一式三份进行。最大sdf-1诱导的迁移计算为上面表中条件(a1)和(a)之间迁移细胞数的差异。然后通过参考该最大迁移计算测试抗体的迁移抑制百分比。不同测试igg抑制sdf-1α诱导的趋化性的结果呈现于下表中。所有测试抗体均将sdf-1α诱导的趋化性抑制了至少约70％。实施例10：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)用ra1细胞作为靶细胞(t)并使用非放射性细胞毒性测定法(promegacorp.，fitchburg，wi)测量adcc，该测定法测量乳酸脱氢酶(ldh)释放。用以下对照和实验孔(100微升终体积)建立圆底96孔培养板：a.ra1细胞(用于靶细胞自发ldh释放对照)b.ra1细胞(用于靶细胞最大ldh释放对照)c.用于体积校正对照的培养基(不含酚红的rpmi1640培养基(1x))d.培养基(用于培养基背景对照)e.ra1加效应细胞(e)(用于靶细胞加效应细胞自发ldh释放对照)f.具有每个测试igg的连续稀释物或不含测试igg的具有效应细胞和靶细胞(105)的实验孔。将板以1600rpm离心2分钟，并在37℃孵育4小时。在上清液收获前1小时，将20微升裂解液(10x)添加至条件b)和c)中。将板以1600rpm离心2分钟，并将来自测定板的每个孔的50微升上清液转移至平底96孔酶测定板的相应孔中。将底物混合物(50微升)添加至后者板的每个孔中，并将板(避光)在室温下孵育30分钟。最后，向每个孔中添加50微升终止溶液，并在490nm处测量吸光度(od值)。每个条件一式三份进行测试。已经进行了预备实验以确定最佳e：t比率。以下所示的数据是以20：1的e：t比率在105个ra1靶细胞情况下获得的。此研究中使用的效应细胞如下制备：使用淋巴细胞分离培养基(ref.j15-004,invitrogencorp.,carlsbad,ca)通过密度梯度离心分离从健康供体获得的人外周血单核细胞(pbmc)。将2x106/ml的pbmc在含有10％fcs、青霉素/链霉素和100单位/ml人重组il-2(从roussel-uclaf获得)的rpmi1640中在37℃湿润培养箱中(5％co2)培养2天。在不同浓度的测试igg下获得的adcc百分比用公式％adcc＝(f-e)/(b-a)x100，即％adcc＝(靶细胞+效应细胞+/-测试mab的od–靶细胞+效应细胞的自发释放的od)/(od最大释放靶细胞–od靶细胞的自发释放)x100计算。下表中显示的数据证明所有测试抗体均诱导显著的细胞介导的细胞毒性。实施例11：scid/ra1异种移植模型中的抗肿瘤活性在伯基特氏淋巴瘤的动物模型中评估测试抗体的治疗效果。在使用的模型中，scid小鼠的全身性癌症导致后肢无力并浸润所有主要器官。在肿瘤细胞注射前48小时，用γ-源(1.8gy，60co)照射雌性scid小鼠(7-9周龄，体重17-22g)。在d0时，将悬浮于200μl的rpmi1640中的一百万个ra1细胞(从患有美洲型伯基特氏淋巴瘤的患者建立的b淋巴细胞型细胞系)静脉内注射到小鼠的尾静脉中。在d4，使用软件(biosystemes，dijon，france)基于体重将携带肿瘤的小鼠分配到10个组，每组10只小鼠。平均体重在一组与另一组之间没有统计学差异(平均体重：19.3±1.4g)。治疗开始于d4：在第4、8、12、16、20和24天，对小鼠静脉内施用5mg/kg或10mg/kg剂量的测试抗体。注射用媒介物是10mm柠檬酸钠、150mmnacl、50mm精氨酸(ph5.5)。测量体重并每周记录两次。将每组的平均存活时间计算为死亡日的平均值，并将每组的中值存活时间计算为死亡日的中值数。通过增加的寿命值(ils)判断每种测试抗体的功效。ils％表达如下：ils％＝[(t-c)/c]×100。t是用每种测试抗体处理的动物的存活时间的中值，c是用媒介物处理的对照动物的中值存活时间。肿瘤注射后81天终止实验。用媒介物或(同种型对照)处理的所有对照小鼠死于转移性疾病(disseminateddisease)伴有严重体重减轻，或因肿瘤细胞接种后4周内垂死而终止生命。与对照小鼠相比，用抗体v62.1或v62.1-r108h重复治疗导致存活率2倍增加(p<0.001)。此外，用作为阳性对照的cd20抗体处理的小鼠，比对照小鼠生存得显著更长(p<0.001)。这些数据表明，在这种高度侵袭性的异种移植模型中，测试抗体v62.1和v62.1-r108h可以有效地靶向和抑制ra1细胞增殖。详细结果如下表所示：实施例12：人乳腺癌异种移植模型中的抗转移活性此实验的目的是评估四种测试抗体在乳腺癌转移模型中的功效，在该乳腺癌模型中mda-mb-231/luc细胞(目录号akr-231，cellbiolabs，inc，sandiego，ca)经静脉内植入balb/c裸鼠中。mda-mb-231/luc细胞系是衍生自mda-mb-231人乳腺癌细胞系的表达萤光素酶的亚系。mda-mb-231/luc细胞在肺中产生实验性转移。已知跨内皮mda-mb-231癌细胞迁移以及血管渗透性依赖于sdf1/cxcr4信号传导(lee等(2004)mol.cancerres.2:327)。该研究由7个实验组组成，每组含有12只雌性balb/c裸鼠。在第-1天，基于体重随机分配动物。通过方差分析，每组的平均体重与其他组的平均体重没有统计学差异。在第0天，将100μl0.9％nacl中的2×106个mda-mb-231/luc细胞静脉内植入所有参与的动物中。使用体内生物发光成像在第2天、第9天、第15天、第24天、第28天、第31天、第35天和第38天评估转移性生长。每隔一天(周一、周三和周五)测量动物重量。第2-5组动物在第-1、3、7、11、15和19天(q4d×6)静脉内施用10mg/kg测试抗体，第1组接受媒介物(10mm柠檬酸钠、150mmnacl、50mm精氨酸，ph5.5)。基于最新的体重测量值，计算抗体剂量。在研究结束时(第38天)胸部区的总萤光素酶活性显示在图2中。所有测试抗体显著抑制胸部区中的肿瘤细胞生长。除非本文另有指示，否则本文中对数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个独立值的简写方法，且每个独立值并入本说明书中，如同其在本文中单独引用一样。除非另有说明，否则本文提供的所有精确值均代表相应的近似值(例如，关于特定因素或测量提供的所有精确示例性值可被视为还提供相应的近似测量，其在适当的情况下由“约”修饰)。除非另有指示，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而不是对本发明的范围进行限制。本文中引用和并入专利文献仅是为了方便而进行，并不反映对这些专利文件的有效性、可专利性和/或可执行性的任何观点。使用诸如对一个或多个元素的参考之类的术语的本发明的任何方面或实施方案的本文描述旨在为“由特定一个或多个元素组成”，“基本上由特定一个或多个元素组成”或“基本上包括特定一个或多个元素”的本发明的类似方面或实施方案提供支持，除非另有指示或明确地与上下文相矛盾(例如，本文描述为包含特定元素的组合物，应理解为还描述由该元素组成的组合物，除非另有说明或明确地与上下文相矛盾)。此发明包括在适用法律允许的最大范围内在此呈现的方面或权利要求中所述主题的所有修改和等同物。此说明书中引用的所有出版物和专利申请均通过提述以其整体并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出以通过提述并入。尽管为了清楚理解的目的已经通过示例性说明和实施例详细地描述了前述发明，但本领域普通技术人员将容易明白，根据本发明的教导，可以在不脱离所附权利要求书的本质或范围的情况下进行某些变化和修改。序列表<110>msm蛋白质技术公司<120>抗cxcr4抗体<130>msm-001wo01<160>38<170>patentin版本3.5<210>1<211>7<212>prt<213>人工序列<220><223>轻链cdr1l<400>1sersertyrleualatrptyr15<210>2<211>10<212>prt<213>人工序列<220><223>轻链cdr2l<400>2leuleuiletyrglyalaserserargala1510<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列<220><223>轻链cdr3l，变体1<400>3glnglnserasptyrsertyrprophe15<210>4<211>8<212>prt<213>人工序列<220><223>轻链cdr3l，变体2<400>4glnglntrpserseraspserval15<210>5<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>重链cdr1h，变体1<400>5sersertyralametser15<210>6<211>6<212>prt<213>人工序列<220><223>重链cdr1h，变体2<400>6serprotyrserilethr15<210>7<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>重链cdr2h，变体1<400>7trpvalseralaileserglyserglyglyserthrtyr1510<210>8<211>14<212>prt<213>人工序列<220><223>重链cdr2h，变体2<400>8trpvalseralaileserglyserglyglyglyserthrarg1510<210>9<211>12<212>prt<213>人工序列<220><223>重链cdr2h，变体3<400>9trpvalseralaileserglyserglyglythrarg1510<210>10<211>13<212>prt<213>人工序列<220><223>重链cdr2h，变体4<400>10trpvalserglnileasnsertyrasnglylysthrtyr1510<210>11<211>23<212>prt<213>人工序列<220><223>重链cdr3h，变体1<400>11alaargglnglylysthrargvaltyrglytyrargtrphisglytyr151015glyserthrhisalaleuasp20<210>12<211>23<212>prt<213>人工序列<220><223>重链cdr3h，变体2<400>12alaargglnglylysthrargvaltyrglytyrhistrphisglytyr151015glyserthrhisalaleuasp20<210>13<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>轻链可变区lcvr，变体1<400>13gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserasptyrsertyr859095prophethrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargthr100105110<210>14<211>110<212>prt<213>人工序列<220><223>轻链可变区lcvr，变体2<400>14gluilevalleuthrglnserproglythrleuserleuserprogly151015gluargalathrleusercysargalaserglnservalserserser202530tyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalaproargleuleu354045iletyrglyalaserserargalathrglyileproaspargpheser505560glyserglyserglythraspphethrleuthrileserargleuglu65707580progluaspphealavaltyrtyrcysglnglntrpserseraspser859095valthrpheglyglnglythrlysvalgluilelysargthr100105110<210>15<211>131<212>prt<213>人工序列<220><223>重链可变区hcvr，变体1<400>15gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileserglyserglyglyserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglnglylysthrargvaltyrglytyrargtrphisglytyr100105110glyserthrhisalaleuasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr115120125valserser130<210>16<211>131<212>prt<213>人工序列<220><223>重链可变区hcvr，变体2<400>16gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileserglyserglyglyserthrtyrtyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargglnglylysthrargvaltyrglytyrhistrphisglytyr100105110glyserthrhisalaleuasptyrtrpglyglnglythrleuvalthr115120125valserser130<210>17<211>132<212>prt<213>人工序列<220><223>重链可变区hcvr，变体3<400>17gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr202530alametsertrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045seralaileserglyserglyglyglyserthrargtyralaaspser505560vallysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleu65707580tyrleuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyr859095cysalaargglnglylysthrargvaltyrglytyrhistrphisgly100105110tyrglyserthrhisalaleuasptyrtrpglyglnglythrleuval115120125thrvalserser130<210>18<211>130<212>prt<213>人工序列<220><223>重链可变区hcvr，变体4<400>18gluvalglnleuleugluserglyglyglyleuval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