制备和使用基于细胞外结构域的嵌合蛋白的方法与流程

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本发明尤其涉及组合物和方法，包括可用于治疗疾病的嵌合蛋白，诸如癌症和自身免疫性疾病的免疫疗法。

背景技术：

尽管经过多年努力，还是回避了癌症的特殊治疗。部分原因是因为许多癌症已经形成了避免免疫系统的机制。因此，仍然需要开发足以使免疫系统的多个臂接合以产生抗癌免疫应答的疗法和治疗方案。

技术实现要素：

因此，在各个方面，本发明提供了可用于癌症免疫疗法的组合物和方法。例如，本发明部分涉及特异性嵌合蛋白，其在提供免疫活化或共刺激信号的同时逆转或抑制免疫抑制信号。尤其重要的是，本发明提供了改进的嵌合蛋白，其可以在不希望受理论束缚的情况下基于包括一个或多个二硫键的接头区域中的稳定化来维持稳定且可产生的多聚体状态。因此，本发明的组合物和方法克服了产生双特异性剂的各种缺陷。

在一些方面，嵌合蛋白具有以下一般结构：n末端–(a)–(b)–(c)–c末端，其中(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头(包括但不限于衍生自人igg4的铰链-ch2-ch3fc结构域)，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，其中所述接头连接第一结构域和第二结构域并任选地包含一个或多个如本文所述的连接接头。

此外，在各个方面，本发明涉及通过使用本发明的嵌合蛋白的组合来治疗癌症的方法。例如，本发明的方法实现任选地按顺序调节免疫系统的特定臂(诸如先天免疫应答和适应性免疫应答)的方案。

在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：(i)第一嵌合蛋白，其具有n末端–(a)–(b)–(c)–c末端的一般结构，其中：(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，并且第一嵌合蛋白调节先天免疫系统；和(ii)第二嵌合蛋白，其具有n末端–(a)–(b)–(c)–c末端的一般结构，其中(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，并且第二嵌合蛋白调节适应性免疫系统。

在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：第二嵌合蛋白，其具有n末端-(a)-(b)–(c)–c末端的一般结构，其中(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，并且第二嵌合蛋白调节适应性免疫系统；其中所述受试者经历或经历过使用第一嵌合蛋白的治疗，所述第一嵌合蛋白具有n末端–(a)–(b)–(c)–c末端的一般结构，其中(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，并且第一嵌合蛋白调节先天免疫系统。

在实施方案中，第一嵌合蛋白在第二嵌合蛋白之前施用。

在实施方案中，第一嵌合蛋白在第二嵌合蛋白之后施用。

在实施方案中，第一嵌合蛋白包含以下中的至少一种：tigit、csf1r、cd172a(sirp1α)、vsig8、tim3、41bbl、cd40l、siglec7、siglec9和light。

在实施方案中，第二嵌合蛋白包含以下中的至少一种：pd-1、tim3、vsig8、cd172a(sirp1α)、ox40l、gitrl、tl1a和il-2

在实施方案中，第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白独立地选自tim3-fc-ox40l、cd172a(sirp1α)-fc-cd40l和csf1r-fc-cd40l。

在实施方案中，tim3-fc-ox40l在cd172a(sirp1α)-fc-cd40l之前施用。在实施方案中，tim3-fc-ox40l在csf1r-fc-cd40l之前施用。在实施方案中，cd172a(sirp1α)-fc-cd40l在tim3-fc-ox40l之前施用。在实施方案中，csf1r-fc-cd40l在tim3-fc-ox40l之前施用。

本文描述的任何方面或实施方案都可以与如本文所公开的任何其他方面或实施方案结合。

附图说明

图1a至图1d示出了i型膜蛋白和ii型膜蛋白(图1a和图1c)如何可以进行工程化的示意图，其中跨膜结构域和细胞内结构域被去除并使用接头序列连接(图1b)以产生单一嵌合蛋白，其中i型膜蛋白和ii型膜蛋白的细胞外结构域各自在单一嵌合蛋白中面向外。图1b描绘了通过去除每种蛋白质的跨膜结构域和细胞内结构域进行的i型膜蛋白和ii型膜蛋白的连接，并且其中来自每种蛋白质的释放的细胞外结构域(ecd)已经通过接头序列连接。本描述中的ecd可以包括通常位于细胞膜外的候选i型蛋白或ii型蛋白的完整氨基酸序列，或其保留与预期受体或配体结合的任何部分。图1d描绘了线性构建体中的连接的细胞外结构域，其中i型膜蛋白的细胞外结构域面向构建体的“左”侧，并且ii型膜蛋白的细胞外结构域面向构建体的“右”侧。

图2不希望受理论束缚地示出了单体cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白(sl-172154)的计算机模拟预测的结构。

图3a不希望受理论束缚地示出了说明hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白用于刺激活性肿瘤破坏的作用机制的示意图。然后嵌合蛋白可以“悬挂”在肿瘤细胞表面，并且然后嵌合蛋白的cd40l部分可以与t细胞表面上表达的cd40结合。这将导致用共刺激cd40l信号替换抑制性hcd172a(sirpα)信号，以增强t细胞的抗肿瘤活性。图3b示出了由肿瘤细胞与t细胞之间的嵌合蛋白形成的突触。

图4示出了通过蛋白质印迹进行的人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白(sl-172154)的表征。具体地，使用抗cd172a、抗fc或抗cd40l抗体探测嵌合蛋白的每个个体结构域。将所有印迹中未处理的hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白样品(例如对照)加载到泳道2中(无β-巯基乙醇或pngase)。将泳道3中的样品用还原剂β-巯基乙醇处理，而将泳道4中的样品用pngase处理。

图5a至图5c是示出来自含有约6,000个人膜蛋白的微阵列的所鉴定的人pd1-fc-ox40l(图5a)、人csf1r-fc-cd40l(图5b)或人cd172a(sirpα)-fc-cd40l(图5c)的结合配偶体的结果的表。在每种情况下，通过筛选鉴定每种候选分子的预期结合配偶体。没有证据表明与其他人类蛋白质具有非特异性结合，并且在筛选中可以看到所有含fc的融合蛋白与半乳凝素-1的结合。

图6示出了表明人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域对其各自的结合配偶体的结合亲和力的elisa测定。第一个(最左)图示出了hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与人igg(fc的结合配偶体)的结合和检测。人ig(hig)用作标准物。左起第二个图示出了hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与cd47(cd172a的结合配偶体)的结合和检测。左起第三个图示出了hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与受体cd40(cd40l的结合配偶体)的结合和检测。最后一个图(最右)示出了双重结合功能性elisa测定，其中重组人cd40用于捕获cd40l结构域，并且重组人cd47用于检测cd172a(sirpα)结构域，其表明了cd172a(sirpα)-fc-cd40l与其结合配偶体二者的同时结合。

图7a和图7b示出了表明cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域与其各自在哺乳动物细胞膜表面上的结合配偶体(例如，受体或配体)结合的能力的离体细胞结合测定。图7a示出了人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与hcd47的结合(上部曲线是hela/hcd47，下部是hela亲本)。图7b示出了鼠cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与mcd40的结合(上部曲线是chok1/mcd40，下部曲线是chok1亲本)。

图8a至图8e示出了通过表面等离子体共振(spr)测量的人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的结合亲和力。图8a示出了hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与hcd47的结合(上部曲线是cd172a-fc-cd40l(250nm)，下部曲线是cd172a-fc-cntl(250nm))。图8b示出了hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与hfcγr1a的结合(下部曲线是cd172a-fc-cd40l(250nm)，上部曲线是cd172a-fc-cntl(250nm))。图8c示出了hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与hfcrn的结合(下部曲线是cd172a-fc-cd40l(250nm)，上部曲线是cd172a-fc-cntl(250nm))。图8d总结了图8a至图8c中的亲和力结果。图8e示出了鼠cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与mcd40的结合亲和力。

图9a至图9c示出了人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的离体功能性测定。图9a示出了表明hcd172a(sirpα)-fc-cd40l与过表达hcd47的细胞的结合的基于elisa的阻断测定。图9b示出了巨噬细胞吞噬作用测定的作用模式的示意图。图9c示出了响应于cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白以浓度依赖性方式增加的双阳性细胞(胞吞作用)水平。

图10a和图10b示出了通过蛋白质印迹分析和elisa测定进行的鼠cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的表征。图10a示出了使用抗cd172a、抗fc或抗cd40l抗体检测mcd172a(sirpα)-fc-cd40l融合构建体的每个个体结构域。将所有印迹中未处理的mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白样品(例如对照)加载到泳道2中(无β-巯基乙醇或pngase)。将泳道3中的样品用还原剂β-巯基乙醇处理，而将泳道4中的样品用pngase处理。图10b示出了表明mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域对其各自的结合配偶体的结合亲和力的elisa测定。在与cd47的结合中(图10b，左侧)，表明了mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与cd47(cd172a的结合配偶体(方形符号))的结合和检测。使用重组mcd172a-mfc产生标准曲线(圆形符号)。在与cd40的结合中(图10b，右侧)，表明了mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与受体cd40(cd40l的结合配偶体(方形符号))的结合和检测。使用重组mcd40l产生标准曲线(圆形符号)。

图11a至图11c示出了表明mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的抗肿瘤功效的体内肿瘤研究的结果。在用抗cd47、抗cd40、两种抗体的组合，用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l或用对照抗体处理之前，将ct26肿瘤植入balb/c小鼠体内。图11a示出了在肿瘤接种之后45天内每组的肿瘤大小的演变。图11b示出了在肿瘤接种之后50天内小鼠的总存活百分比(在第50天，从上到下的曲线是：cd172a-fc-cd40l(150μgx2)、cd172a-fc-cd40l(300μgx2)、αcd47/cd40、αcd40、αcd47(在第30-35天之间存活率为0％)和未处理(在第20-25天之间存活率为0％)。图11c总结了每组的组大小和处理结果。

图12a至图12f示出了mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的体内功能性测定。对用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理的荷瘤小鼠进行免疫分析。图12a示出了用嵌合蛋白处理的小鼠脾脏中cd4+和cd8+t细胞群的变化。图12b示出了用嵌合蛋白处理的小鼠脾脏中cd4+cd25-效应t细胞或cd4+cd25+调节t细胞的变化。图12c和图12d分别示出了用嵌合蛋白处理的小鼠的外周淋巴结和肿瘤中cd4+和cd8+t细胞群的变化。图12e示出了用于确定识别ct26肿瘤天然表达的ah1肿瘤抗原的脾细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)内的cd8+t细胞的分数的四聚体染色。图12f示出了上调il-15受体α(il15rα)的细胞比例的变化，所述比例是cd40活化的指标。在图12a至图12f的每一个中，从左到右的条件是：未处理的、αcd40/cd47、mcd172a(sirpα)-fc-cd40l(150μgx2)、mcd172a(sirpα)-fc-cd40l(300μgx2)。

图13示出了用人cd172a(sirpα)-fc-cd40l处理的食蟹猴(cynomolgusmacaques)的数据。用1mg/kg的单剂量hcd172a(sirpα)-fc-cd40l处理1只雄性和1只雌性食蟹猴。在从处理前到处理后14天的多个时间点收集血清以评价药代动力学和安全性。在五个时间点进行cbc/cmp，用于溶血和血小板减少症的安全性和特异性评价。用hcd172a(sirpα)-fc-cd40l处理之后，未观察到红细胞裂解或血小板消耗的证据。每天多次进行总安全性评估，并且未观察到另外的安全信号。

图14示出了使用针对检查点蛋白的抗体(作为单一疗法或组合)的处理或使用嵌合蛋白的处理在降低肿瘤体积方面的体内协同作用。从左到右的条件是：媒介物、抗ox40(ox86)、抗pd-1(rmp1-14)、抗pd-1(29f.1a12)、抗tim3(rmt3-23)、抗tim3+ox40、抗tim3+ox40+pd-1(rmp1-14)、抗tim3+ox40+pd-1(29f.1a12)、arc300ugx2(“arc”是tim3-fc-ox40l嵌合蛋白)。

图15a示出了由嵌合蛋白的连续处理(使用相同嵌合蛋白的两次连续处理或使用两种不同嵌合蛋白的处理)产生的肿瘤体积的体内降低。图15b示出了图15a中所示的小鼠的随时间的存活百分比。为清楚起见，在图15a中，x轴上点20天的条件是(从上到下)：媒介物、csf1r-fc-cd40l--tim3-fc-ox40l、tim3-fc-ox40l(150μgx2)、tim3-fc-ox40l--csf1r-fc-cd40l、tim3-fc-ox40l--cd172a-fc-cd40l和cd172a-fc-cd40l--tim3-fc-ox40l。为清楚起见，在图15b中，条件确定为：媒介物：“1”；tim3-fc-ox40l(150μgx2)：“2”；tim3-fc-ox40l--cd172a-fc-cd40l：“3”；tim3-fc-ox40l--csf1r-fc-cd40l：“4”；cd172a-fc-cd40l--tim3-fc-ox40l：“5”；以及csf1r-fc-cd40l--tim3-fc-ox40l：“6”。

图16不希望受理论束缚地示出了pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的四种潜在构型。

图17示出了在非还原条件下、在还原条件下以及在还原条件下并用肽-n-糖苷酶f(pngasef)处理的在sds-page上运行的pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的蛋白质印迹。

图18示出了在尺寸排阻色谱(sec)上运行的pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的色谱图。

图19示出了在非还原条件(“-”)或还原条件(“+”)下运行的pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的sds-page凝胶和天然(非sds)page凝胶。

图20示出了缺乏fc结构域的pd-1-nofc-ox40l嵌合蛋白的天然(非sds)page凝胶。

图21不希望受理论束缚地示出了六聚体和多联体如何由本发明的嵌合蛋白形成的模型。

图22a至图22q示出了通过蛋白质印迹分析进行的具有不同连接接头序列的pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的表征。在下文实施例部分中提供了不同连接接头的序列。具体地，使用α-pd-1、α-fc或α-ox40l抗体探测融合构建体的每个个体结构域。在每个图中，将所有印迹中未处理的pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白样品(例如对照)加载到泳道1中(无β-巯基乙醇或pngase)。将泳道2中的样品用还原剂β-巯基乙醇处理，而将泳道3中的样品用pngase处理。

图23示出了通过针对蛋白质的中心fc区的基于elisa的捕获和检测测定进行的具有不同连接接头序列的pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的表征。确定具有不同连接接头序列(#1至#17)的每种pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的蛋白质浓度。

图24a至图24p示出了通过对pd-l1或ox40的facs分析进行的具有不同连接接头序列的pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的流式细胞术曲线。计算具有不同连接接头序列(#2至#17)的每种pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的ec50值。

图25a，使用pd1-fc-ox40l嵌合蛋白作为非限制性实例，示出了肿瘤细胞可以在细胞表面表达pd-l1，其可以结合由t细胞表达的pd-1(图25b)。这种相互作用抑制了t细胞的活化。包含与ox40l的细胞外结构域连接的pd-1的细胞外结构域的嵌合蛋白可以与肿瘤细胞表面上的pd-l1结合，从而防止与t细胞表面上的pd-1结合(图25c)。然后嵌合蛋白可以“悬挂”在肿瘤细胞表面，并且然后嵌合蛋白的ox40l部分可以与t细胞表面上表达的ox40结合。这将导致用共刺激ox40l信号替换抑制性pd-l1信号，以增强t细胞的抗肿瘤活性。

图26a示出了为了过表达鼠pd-l1(chok1/mpd-l1)、pd-l2(chok1/mpd-l2)或ox40(chok1/mox40)而产生的细胞系。图26b示出了表明鼠pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与工程化的细胞系结合的能力的体外细胞结合。图26c和图26d示出了金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureas)b型肠毒素(seb)超抗原细胞因子释放测定，其表明了mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白对il-2(图26c)和tnfα(图26d)分泌的影响。在图26c和图26d中，在x轴点2.5处从上到下的曲线是：pd1-fc-ox40l、pd1-fc/ox40l、ox40l-fc、pd1-fc/ox40l-fc、pd1-fc和igg对照。

图27a示出了在图中描述的每组小鼠在ct26肿瘤接种之后体内肿瘤大小的演变。图27b和图27c示出了肿瘤接种之后40天的小鼠和肿瘤排斥的总存活百分比和统计值。在图27b中，不同的处理条件被确定为：未处理的：“a”，“e”和“h”；αpd-l1(10f.9g2)：“b”；αpd-1(rmp1-14)：“c”；αox40(ox86)：“d”；pd-l1/ox40：“f”；αpd-1(rmp1-14)/ox40：“g”；pd-1-fc-ox40l(100μgx2)：“i”；pd-1-fc-ox40l(150μgx2)：“j”；和pd-1-fc-ox40l(300μgx2)：“k”。图27d和图27e示出了在用鼠pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白或抗体(作为αpd-1、αpd-l1或αox40的单一疗法或作为αpd-l1和αox40或αpd-1和αox40的组合疗法)处理的携带ct26肿瘤的小鼠上进行的免疫分析。在图27d和图27e两者中，测试制品从左到右的顺序是：未处理的、αpd-1(rmp1-14)、αpd-l1(10f.9g2)、αox40(ox86)、αpd-1(rmp1-14)/ox40、pd-l1/ox40、pd-1-fc-ox40l(150μgx2)和pd-1-fc-ox40l(300μgx2)。图27f总结了每个实验组的处理结果。图27g和图27h示出了mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白在ct26肿瘤模型中的体内抗肿瘤活性。在图27g中，左侧两个图：未处理的是上部曲线。在图27g中，左起第三个图：从上到下的曲线是未处理的、αpd1(2x100μg)、αpd-l1(1x100μg)和αpd-l1(2x100μg)。在图27g中，最右侧图：从上到下的曲线是未处理的、αox40/αpd-l1(1x100μg)、αox40/αpd-l1(2x100μg)、αox40/αpd1(2x100μg)。在图27h中，标记为“arc融合蛋白”的图，从上到下的曲线是：未处理的、pd1-fc-ox40l(300ugx2)和pd1-fc-ox40l(150ugx2)。在图27h中，标记为“ox40激动剂”的图，从上到下的曲线是：未处理和aox86。在图27h中，标记为“pd-1/l1阻断”的图，从上到下的曲线是：未处理的、apd1、apd-l1。在图27h中，标记为“抗体组合”的图，从上到下的曲线是：未处理的、apd1/aox86、apd-l1/aox86。

图28a至图28c示出了表明人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的不同结构域(也称为sl-279252)对其各自的结合配偶体的结合亲和力的elisa测定。在图28c中，对于每个浓度，左侧是ox40-his，并且右侧是hvem-his。

图29a示出了用于体外结合人pd-1-fc-ox40l的人细胞系的表征。图29b至图29d示出了hpd-1-fc-ox40l与分别表达pd-l1、pd-l2或ox40的细胞的结合。在每一个图中，右图示出了增加的嵌合蛋白浓度的滴定曲线。

图30示出了通过蛋白质印迹分析进行的人pd-1-fc-ox40l融合蛋白(sl-279252)的表征。分别用抗pd-1、抗fc或抗ox40l抗体探测嵌合蛋白的三个结构域中的每一个。将所有印迹中未处理的hpd-1-fc-ox40l融合蛋白样品(例如对照)加载到泳道1中(无β-巯基乙醇或肽:n-糖苷酶(pngase)。

图31a和图31b示出了功能性elisa(图31a)和细胞结合测定(图31b)，其确定了pd-1-fc-ox40l融合蛋白(sl-279252)的糖基化是否影响其功能性。

图32a至图32g示出了人pd-1-fc-ox40l融合蛋白的体外功能性测定。在图32c中，hpd-1-fc-ox40l在pc3细胞(图32c，左束)中诱导的分泌il2水平比在hcc827细胞(图32c，右束)中诱导的分泌il2水平更高。图32d是取自图32c中概述的t细胞/肿瘤细胞共培养测定的细胞的流式细胞术分析。最左侧的条表示在不存在肿瘤细胞的情况下表达ki67的cd4+或cd8+细胞的比例(作为增殖的指标)。左起第二个条表示在存在肿瘤细胞但没有arc的情况下表达ki67的cd4+或cd8+细胞的比例，而左起第三个条和最右侧的条分别表示在存在500ng或5μgarc的情况下表达ki67的cd4+或cd8+细胞的比例。图32f和图32g，插图直方图中测试制品从左到右的顺序：培养基对照、igg对照、pd1-fc、ox40l-fc、pd-1-fc/ox40l-fc和pd-1-fc-ox40l。

图33a至图33c示出了表明人pd-1-fc-ox40l融合蛋白与食蟹猴的pd-l1(图33a)和pd-l2(图33a)或与恒河猴(rhesusmacaque)的ox40(图33c)的结合亲和力和交叉反应性的elisa测定。

图34不希望受理论束缚地示出了单体tim3-fc-ox40l嵌合蛋白(sl-366252)的计算机模拟预测的结构。

图35示出了通过蛋白质印迹分析进行的鼠tim3-fc-ox40l融合蛋白(sl-366252)的表征。具体地，使用抗tim3、抗fc或抗ox40l抗体探测融合构建体的每个个体结构域。将所有印迹中未处理的mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白样品(例如对照)加载到泳道2中(无β-巯基乙醇或pngase)。将泳道3中的样品用还原剂β-巯基乙醇处理，而将泳道4中的样品用pngase处理。

图36示出了表明tim3-fc-ox40l嵌合蛋白与其在哺乳动物细胞膜表面上的结合配偶体(例如，受体或配体)结合的能力的离体细胞结合测定。具体地，所述图示出了tim3-fc-ox40l嵌合蛋白与mox40的结合(chok1-mox40是上部曲线，chok1亲本是下部曲线)。

图37a至图37c示出了鼠tim3-fc-ox40l嵌合蛋白的体内功能性测定。对用mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理的荷瘤小鼠进行免疫分析。图37a示出了用嵌合蛋白处理的小鼠中cd4+和cd8+t细胞群的变化。图37b示出了用嵌合蛋白处理的小鼠中cd4+cd25-效应t细胞或cd4+cd25+调节t细胞的变化。图37c示出了用于分析识别ct26肿瘤天然表达的ah1肿瘤抗原的脾细胞或肿瘤浸润淋巴细胞(til)内的cd8+t细胞的分数的四聚体染色。在所有图中，左侧条件是未处理的，并且右侧条件是mtim3-fc-ox40l(150μgx2)。

图38a至图38c示出了体内肿瘤研究的结果，其表明mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白在ct26小鼠模型中具有显著的抗肿瘤活性。用ct26肿瘤接种小鼠。当肿瘤达到4-5mm时，用150μg的mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白或用对照抗体处理小鼠两次。图38a示出了在肿瘤接种之后45天内每组的肿瘤大小的演变。图38b示出了在肿瘤接种之后50天内小鼠的总存活百分比(tim3-fc-ox40l是上部曲线)。图38c总结了每组的组大小和处理结果。

图39是示出可以组合成示例性模块接头的连接接头和fc接头的表。所示的示例性模块接头可以与本文所述的i型蛋白和ii型蛋白和/或本文所述的i型蛋白和ii型蛋白的细胞外结构域组合，以形成本发明的嵌合蛋白。

具体实施方式

本发明部分基于以下发现：嵌合蛋白可以利用这些蛋白质的取向(例如，i型相对于ii型的取向)的方式由免疫调节跨膜蛋白的细胞外区域或效应子区域进行工程化，因此允许递送免疫刺激信号和/或免疫抑制信号，所述递送包括例如在癌症治疗中掩蔽免疫抑制信号并用免疫刺激信号替换免疫抑制信号。

嵌合蛋白

在一些方面，嵌合蛋白具有以下一般结构：n末端–(a)–(b)–(c)–c末端，其中(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是具有至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头(包括但不限于衍生自人igg4的铰链-ch2-ch3fc结构域)，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，其中所述接头连接第一结构域和第二结构域并任选地包含一个或多个如本文所述的连接接头，其中所述第一细胞外结构域和第二细胞外结构域中的一个是免疫抑制信号，并且所述第一细胞外结构域和第二细胞外结构域中的一个是免疫刺激信号。

在实施方案中，嵌合蛋白是指重组融合蛋白，例如具有本文所述的细胞外结构域的单一多肽。例如，在实施方案中，嵌合蛋白在细胞中被翻译为单个单元。在实施方案中，嵌合蛋白是指多个多肽的重组蛋白，所述多个多肽例如是本文所述的多个细胞外结构域，其例如在体外(例如，用本文所述的一个或多个合成接头)连接以产生单个单元。在实施方案中，嵌合蛋白作为一个多肽进行化学合成，或者可以单独化学合成每个结构域，然后组合。在实施方案中，翻译嵌合蛋白的一部分，并化学合成一部分。

在实施方案中，细胞外结构域是指跨膜蛋白的一部分，其能够与细胞外环境相互作用。在实施方案中，细胞外结构域是指跨膜蛋白的一部分，其足以结合配体或受体并有效地将信号传递给细胞。在实施方案中，细胞外结构域是跨膜蛋白的完整氨基酸序列，其位于细胞或细胞膜外部。在实施方案中，细胞外结构域是跨膜蛋白的氨基酸序列的一部分，其位于细胞或细胞膜外部并且是信号转导和/或配体结合所需的，如可以使用本领域已知的方法(例如，体外配体结合和/或细胞活化测定)所测定的。

在实施方案中，免疫抑制信号是指减少或消除免疫应答的信号。例如，在肿瘤学的背景下，此类信号可以减少或消除抗肿瘤免疫。在正常生理条件下，抑制信号可用于维持自身耐受性(例如，预防自身免疫性疾病)，并且还可在免疫系统对病原性感染作出应答时保护组织免受损伤。例如但不限于，当阻断这种抑制信号时，可以通过检测细胞增殖、细胞因子产生、细胞杀伤活性或吞噬活性的增加来鉴定免疫抑制信号。

在实施方案中，免疫刺激信号是指增强免疫应答的信号。例如，在肿瘤学的背景下，此类信号可以增强抗肿瘤免疫。例如但不限于，可以通过直接刺激白细胞的增殖、细胞因子产生、杀伤活性或吞噬活性来鉴定免疫刺激信号。具体实例包括使用受体激动剂抗体或使用编码tnf超家族受体的配体(分别为ox40l、light、4-1bbl、tl1a)的嵌合蛋白直接刺激tnf超家族受体，诸如ox40、ltbr、4-1bb或tnfrsf25。来自这些受体中的任一种的刺激都可以直接刺激个体t细胞亚群的增殖和细胞因子产生。另一个实例包括通过抑制免疫抑制细胞活性的受体直接刺激这种免疫抑制细胞。这将包括，例如，用gitr激动剂抗体或含有gitrl的嵌合蛋白刺激cd4+foxp3+调节t细胞，这将降低那些调节t细胞抑制常规cd4+或cd8+t细胞增殖的能力。在另一个实例中，这将包括使用cd40激动剂抗体或含有cd40l的嵌合蛋白刺激抗原呈递细胞表面上的cd40，从而引起抗原呈递细胞的活化，包括增强这些细胞在适当的天然共刺激分子(包括b7或tnf超家族中的那些)的情况下呈递抗原的能力。在另一个实例中，这将包括使用含有light的嵌合蛋白刺激淋巴细胞或基质细胞表面上的ltbr，从而引起淋巴细胞的活化和/或产生促炎细胞因子或趋化因子以进一步刺激任选地在肿瘤内的免疫应答。

膜蛋白通常由细胞外结构域、一个或一系列跨膜结构域和细胞内结构域组成。不希望受理论束缚，膜蛋白的细胞外结构域负责与可溶性或膜结合受体或配体相互作用。不希望受理论束缚，一个或多个跨膜结构域负责将蛋白质定位于质膜。不希望受理论束缚，膜蛋白的细胞内结构域负责协调与细胞信号分子的相互作用以协调对细胞外环境的细胞内应答(或反之亦然)。存在两种类型的单通膜蛋白，即具有细胞外氨基末端和细胞内羧基末端的那些蛋白质(i型)以及具有细胞外羧基末端和细胞内氨基末端的那些蛋白质(ii型)。i型和ii型膜蛋白二者都可以是受体或配体。对于i型膜蛋白，蛋白质的氨基末端面向细胞外，因此含有负责与细胞外环境中的其他结合配偶体(配体或受体)相互作用的功能性结构域。对于ii型膜蛋白，蛋白质的羧基末端面向细胞外，因此含有负责与细胞外环境中的其他结合配偶体(配体或受体)相互作用的功能性结构域。因此，这两种类型的蛋白质具有彼此相反的取向。

因为i型和ii型膜蛋白的面向外的结构域是相反的，所以可以连接i型膜蛋白和ii型膜蛋白的细胞外结构域，使得分子的‘面向外’结构域的取向也彼此相反(图1d)。因此，所得构建体将由使用接头序列连接到分子‘右’侧的ii型膜蛋白的细胞外结构域的分子‘左’侧的i型膜蛋白的细胞外结构域组成。此构建体可以通过将这三个片段(i型蛋白的细胞外结构域，接着是接头序列，接着是ii型蛋白的细胞外结构域)克隆到载体(质粒、病毒或其他)中来产生，其中完整序列的氨基末端对应于含有i型蛋白的分子的‘左’侧，并且完整序列的羧基末端对应于含有ii型蛋白的分子的‘右’侧。因此，在实施方案中，本发明的嵌合蛋白如此进行工程化。

在实施方案中，细胞外结构域可以用于产生可溶性蛋白质，以竞争性地抑制所述受体的配体的信号传导。在实施方案中，细胞外结构域可以用于提供人工信号传导。

在实施方案中，i型跨膜蛋白的细胞外结构域是免疫抑制信号。在实施方案中，ii型跨膜蛋白的细胞外结构域是免疫刺激信号。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域或其功能性片段。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域或其功能性片段。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域或其功能性片段，以及ii型跨膜蛋白的细胞外结构域或其功能性片段。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以被工程化以靶向驻留在人白细胞上的一种或多种分子，其包括但不限于以下的细胞外结构域(如果适用的话)：slamf4、il-2rα、4-1bb/tnfrsf9、il-2rβ、alcam、btla、b7-1、il-4r、b7-h3、blame/slamfs、ceacam1、il-6r、il-7rα、il-10rα、il-10rβ、il-12rβ1、il-12rβ2、cd2、il-13rα1、il-13、cd3、cd4、ilt2/cds5j、ilt3/cds5k、ilt4/cds5d、ilt5/cds5a、lutegrinα4/cd49d、cds、整联蛋白αe/cd103、cd6、整联蛋白αm/cd11b、cds、整联蛋白αx/cd11c、整联蛋白β2/cdis、kir/cd15s、cd27/tnfrsf7、kir2dl1、cd2s、kir2dl3、cd30/tnfrsfs、kir2dl4/cd15sd、cd31/pecam-1、kir2ds4、cd40配体/tnfsf5、lag-3、cd43、lair1、cd45、lair2、cds3、白三烯b4-r1、cds4/slamf5、ncam-l1、cd94、nkg2a、cd97、nkg2c、cd229/slamf3、nkg2d、cd2f-10/slamf9、nt-4、cd69、ntb-a/slamf6、共用γ链/il-2rγ、骨桥蛋白、cracc/slamf7、pd-1、crtam、psgl-1、ctla-4、rank/tnfrsf11a、cx3cr1、cx3cl1、l-选择素、sirpβ1、slam、tccr/wsx-1、dnam-1、胸腺生成素、emmprin/cd147、tim-1、ephb6、tim-2、fas/tnfrsf6、tim-3、fas配体/tnfsf6、tim-4、fcγriii/cd16、tim-6、tnfr1/tnfrsf1a、颗粒溶解素、tnfriii/tnfrsf1b、trailri/tnfrsfioa、icam-1/cd54、trailr2/tnfrsf10b、icam-2/cd102、trailr3/tnfrsf10c、ifn-γr1、trailr4/tnfrsf10d、ifn-γr2、tslp、il-1r1、light、ltbr(tnfrsf3)和tslpr。

调节t细胞的活化受到共刺激和共抑制信号的严重影响。两种主要的共刺激分子家族包括b7和肿瘤坏死因子(tnf)家族。这些分子分别与属于cd28或tnf受体家族的t细胞上的受体结合。许多明确定义的共抑制因子及其受体属于b7和cd28家族。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以被工程化以靶向参与免疫抑制的一种或多种分子，其包括例如：csf1r、ctla-4、pd-l1、pd-l2、pd-1、btla、hvem、tim3、gal9、vista/vsig8、kir、2b4、tigit、cd160(也称为by55)、chk1和chk2激酶、a2ar、ceacam(例如ceacam-1、ceacam-3和/或ceacam-5)和各种b-7家族配体(包括但不限于b7-1、b7-2、b7-dc、b7-h1、b7-h2、b7-h3、b7-h4、b7-h5、b7-h6和b7-h7)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含免疫抑制剂的细胞外结构域，所述免疫抑制剂包括但不限于以下中的一种或多种：tim-3、btla、pd-1、csf1r、ctla-4、cd244、cd160、tigit、cd172a(sirp1α)、2b4、vista、vsig8、cd200和tmigd2。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含具有免疫抑制特性的i型膜蛋白的细胞外结构域。在实施方案中，嵌合蛋白被工程化以破坏、阻断、减少和/或抑制免疫抑制信号的传递。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含免疫刺激信号的细胞外结构域，其是以下中的一种或多种：4-1bbl、ox-40配体(ox-40l)、light(cd258)、gitr配体(gitrl)、cd70、cd30配体、cd40配体(cd40l)、cd137配体、trail和tl1a。

在实施方案中，嵌合蛋白模拟抑制信号配体与其同源受体(例如，pd-1与pd-l1或pd-l2；例如cd172a(sirp1α)与cd47；例如cd115与csf1；例如tim-3与半乳凝素-9或磷脂酰丝氨酸)的结合但抑制抑制信号传递到免疫细胞(例如，t细胞、巨噬细胞或其他白细胞)。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制受体细胞外结构域和免疫刺激配体细胞外结构域，其可以但不限于在掩蔽肿瘤细胞的免疫抑制信号的同时向t细胞递送免疫刺激。在实施方案中，嵌合蛋白递送具有t细胞活化的最终结果的信号。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制信号，其是免疫抑制信号的受体的ecd，并且免疫抑制信号作用于携带免疫抑制信号的同源配体的肿瘤细胞。在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫刺激信号，其是免疫刺激信号的配体的ecd，并且免疫刺激信号作用于携带免疫刺激信号的同源受体的t细胞。在实施方案中，嵌合蛋白包含以下两者：(i)免疫抑制信号，其是免疫抑制信号的受体，并且免疫抑制信号作用于携带免疫抑制信号的同源配体的肿瘤细胞和(ii)免疫刺激信号，其是免疫刺激信号的配体，并且免疫刺激信号作用于携带免疫刺激信号的同源受体的t细胞。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含mahoney,naturereviewsdrugdiscovery2015:14；561-585中描述的一种或多种免疫调节剂的细胞外结构域，所述文献的全部内容特此以引用的方式并入。

在实施方案中，嵌合蛋白能够结合一种或多种鼠配体/受体。

在实施方案中，嵌合蛋白能够结合一种或多种人配体/受体

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含具有免疫刺激特性的ii型膜蛋白的细胞外结构域。在实施方案中，嵌合蛋白被工程化以增强、增加和/或刺激免疫刺激信号的传递。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂pd-1的细胞外结构域，并与免疫刺激剂配对如下：pd-1/4-1bbl；pd-1/ox-40l；pd-1/light；pd-1/gitrl；pd-1/cd70；pd-1/cd30l；pd-1/cd40l；和pd-1/tl1a。在实施方案中，嵌合蛋白是pd-1-fc-light或pd-1-fc-ox40l，其中fc代表包含抗体的fc结构域的至少一部分并且包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头。

在一个实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂pd-1的细胞外结构域，并与免疫刺激剂ox-40l配对。在实施方案中，嵌合蛋白与人pd-l1或pd-l2结合，其中kd为约1nm至约5nm，例如约1nm、约1.5nm、约2nm、约2.5nm、约3nm、约3.5nm、约4nm、约4.5nm或约5nm。在实施方案中，嵌合蛋白与人pd-l1结合，其中kd为约5nm至约15nm，例如约5nm、约5.5nm、约6nm、约6.5nm、约7nm、约7.5nm、约8nm、约8.5nm、约9nm、约9.5nm、约10nm、约10.5nm、约11nm、约11.5nm、约12nm、约12.5nm、约13nm、约13.5nm、约14nm、约14.5nm或约15nm。

在实施方案中，嵌合蛋白表现出增强的稳定性和蛋白质半衰期。在实施方案中，嵌合蛋白以高亲和力与fcrn结合。在实施方案中，嵌合蛋白可以与fcrn结合，其中kd为约1nm至约80nm。例如，嵌合蛋白可以与fcrn结合，其中kd为约1nm、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约7nm、约8nm、约9nm、约10nm、约15nm、约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约71nm、约72nm、约73nm、约74nm、约75nm、约76nm、约77nm、约78nm、约79nm或约80nm。在一个实施方案中，嵌合蛋白可以与fcrn结合，其中kd为约9nm。在实施方案中，嵌合蛋白基本上不与具有效应子功能的其他fc受体(即，除fcrn之外的受体)结合。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂pd-l1或pd-l2的细胞外结构域，并与免疫刺激受体配对如下：pd-l1/4-1bb；pd-l1/ox-40；pd-l1/hvem；pd-l1/gitr；pd-l1/cd27；pd-l1/cd28；pd-l1/cd30；pd-l1/cd40和pd-l1/cd137。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂pd-l2的细胞外结构域，并与免疫刺激受体配对如下：pd-l2/4-1bb；pd-l2/ox-40；pd-l2/hvem；pd-l2/gitr；pd-l2/cd27；pd-l2/cd28；pd-l2/cd30；pd-l2/cd40和pd-l2/cd137。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂tim-3的细胞外结构域，并与免疫刺激剂配对如下：tim-3/ox-40l；tim-3/light；tim-3/gitrl；tim-3/cd70；tim-3/cd30l；tim-3/cd40l；tim-3/cd137l；tim-3/tl1a；和tim-3/ox40l。在实施方案中，嵌合蛋白是tim3-fc-ox40l，其中fc代表包含抗体的fc结构域的至少一部分并且包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头。

在实施方案中，提供了一种通过向受试者施用tim3-fc-ox40l嵌合蛋白来治疗癌症或炎性疾病(例如，本文其他地方描述的那些疾病中的任一种)的方法，其中fc代表包含抗体的fc结构域的至少一部分并且包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头。在实施方案中，所述方法产生记忆应答，其可以例如能够预防复发。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂btla的细胞外结构域，并与免疫刺激剂配对如下：btla/ox-40l；btla/light；btla/gitrl；btla/cd70；btla/cd30l；btla/cd40l；btla/cd137l；btla/tl1a；和btla/ox40l。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂cd172a(sirp1α)的细胞外结构域，并与免疫刺激剂配对如下：cd172a(sirp1α)/ox-40l；cd172a(sirp1α)/light；cd172a(sirp1α)/cd70；cd172a(sirp1α)/cd30l；cd172a(sirp1α)/cd40l；cd172a(sirp1α)/cd137l；cd172a(sirp1α)/tl1a；和cd172a(sirp1α)/ox40l。在实施方案中，嵌合蛋白是cd172a(sirp1α)-fc-cd40l或cd172a(sirp1α)-fc-light，其中fc代表包含抗体的fc结构域的至少一部分并且包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头。

在实施方案中，提供了一种通过向受试者施用cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白来治疗癌症或炎性疾病(例如，本文其他地方描述的那些疾病中的任一种)的方法，其中fc代表包含抗体的fc结构域的至少一部分并且包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头。在实施方案中，所述方法产生记忆应答，其可以例如能够预防复发。在实施方案中，所述方法包括cd172a(sirpα)-fc-cd40l的持续治疗效果，例如，由于细胞外结构域组分以缓慢的解离速率(kd或koff)与其各自的结合配偶体的结合，以任选地提供持续的负信号掩蔽效果和/或更长的正信号效果，例如，以使效应细胞被充分刺激用于抗肿瘤效果。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂cd115的细胞外结构域，并与免疫刺激剂配对如下：cd115/ox-40l；cd115/light；cd115/cd70；cd115/cd30l；cd115/cd40l；cd115/cd137l；cd115/tl1a；和cd115/ox40l。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂tmigd2的细胞外结构域，并与免疫刺激剂配对如下：tmigd2/ox-40l；tmigd2/light；tmigd2/gitrl；tmigd2/cd70；tmigd2/cd30l；tmigd2/cd40l；tmigd2/cd137l；tmigd2/tl1a；和tmigd2/ox40l。

在实施方案中，嵌合蛋白包含免疫抑制剂cd200的细胞外结构域，并与免疫刺激剂配对如下：cd200/ox-40l；cd200/light；cd200/gitrl；cd200/cd70；cd200/cd30l；cd200/cd40l；cd200/cd137l；cd200/tl1a；和cd200/ox40l。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以包含本文所述的细胞外结构域的变体，例如，与细胞外结构域的已知氨基酸或核酸序列具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％)序列同一性的序列，所述细胞外结构域例如人细胞外结构域，例如seqidno:2、4、7、10、12、15、18、21、24、29、32、34、36、42和44中的一个或多个。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含tim3的细胞外结构域(seqidno:2)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含pd-1的细胞外结构域(seqidno:7)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含cd172a(sirp1α)的细胞外结构域(seqidno:10)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含ox40l的细胞外结构域(seqidno:4)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含cd40l的细胞外结构域(seqidno:12)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含tim3的细胞外结构域(seqidno:2)和ox40l的细胞外结构域(seqidno:4)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含pd-1的细胞外结构域(seqidno:7)和ox40l的细胞外结构域(seqidno:4)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含cd172a(sirp1α)的细胞外结构域(seqidno:10)和cd40l的细胞外结构域(seqidno:12)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含来自人igg4抗体序列的铰链-ch2-ch3结构域(seqidno:45、46或47)。

在实施方案中，嵌合蛋白包含模块接头，如图39所示。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含tim3的细胞外结构域和ox40l的细胞外结构域，使用来自人igg4抗体序列的铰链-ch2-ch3结构域作为接头(此tim3-fc-ox40l嵌合体是seqidno:5)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含pd-1的细胞外结构域(seqidno:7)和ox40l的细胞外结构域，使用来自人igg4抗体序列的铰链-ch2-ch3结构域作为接头(此pd-1-fc-ox40l嵌合体是seqidno:8)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含cd172a(sirp1α)的细胞外结构域(seqidno:10)和cd40l的细胞外结构域，使用来自人igg4抗体序列的铰链-ch2-ch3结构域作为接头(此cd172a(sirp1α)-fc-cd40l嵌合体是seqidno:13)。

在另一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含pd-1的细胞外结构域和tl1a的细胞外结构域(seqidno:15)。

另外的实例包括嵌合蛋白，其编码通过fc与ox40l连接的btla细胞外结构域(seqidno:19)。

另一个实例是嵌合蛋白，其并入通过fc接头序列与人ox40l的细胞外结构域连接的tmigd2的细胞外结构域(seqidno:22)。

另一个实例是嵌合蛋白，其并入通过fc接头序列与人ox40l的细胞外结构域连接的cd172a(sirpα)的细胞外结构域(seqidno:26)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含csf1r的细胞外结构域(seqidno:29)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含csf1r的细胞外结构域(seqidno:29)和cd40l的细胞外结构域(seqidno:12)。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含csf1r的细胞外结构域(seqidno:29)和cd40l的细胞外结构域(seqidno:12)，使用来自人igg4抗体序列的铰链-ch2-ch3结构域作为接头(此csf1r-fc-cd40l嵌合体是seqidno:30)

在实施方案中，嵌合蛋白可以包含来自本文鉴定的序列的细胞外结构域，其与来自本文鉴定的另一个序列的细胞外结构域组合。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以是本文所述的变体，例如，本发明的嵌合蛋白可以具有与本发明的嵌合蛋白的氨基酸序列(例如seqidno5、5、8、13、16、19、22、25、26、27或30中的一个或多个)具有至少约60％、或至少约61％、或至少约62％、或至少约63％、或至少约64％、或至少约65％、或至少约66％、或至少约67％、或至少约68％、或至少约69％、或至少约70％、或至少约71％、或至少约72％、或至少约73％、或至少约74％、或至少约75％、或至少约76％、或至少约77％、或至少约78％、或至少约79％、或至少约80％、或至少约81％、或至少约82％、或至少约83％、或至少约84％、或至少约85％、或至少约86％、或至少约87％、或至少约88％、或至少约89％、或至少约90％、或至少约91％、或至少约92％、或至少约93％、或至少约94％、或至少约95％、或至少约96％、或至少约97％、或至少约98％、或至少约99％)序列同一性的序列。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含如pct/us2016/054598的表1中所述的人i型跨膜蛋白的细胞外结构域或其功能性片段。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含如pct/us2016/054598的表2中所述的人ii型跨膜蛋白的细胞外结构域或其功能性片段。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含如pct/us2016/054598的表1中所述的i型跨膜蛋白的细胞外结构域或其功能性片段，以及如pct/us2016/054598的表2中所述的ii型跨膜蛋白的细胞外结构域或其功能性片段。pct/us2016/054598的全部内容特此以引用的方式并入。

在实施方案中，嵌合蛋白可以包含相对于本文所述的任何蛋白质序列具有一个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。在实施方案中，一个或多个氨基酸突变可以独立地选自取代、插入、缺失和截短。

在实施方案中，氨基酸突变是氨基酸取代，并且可以包括保守取代和/或非保守取代。

例如，“保守取代”可以基于所涉及的氨基酸残基的极性、电荷、大小、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性来完成。20种天然存在的氨基酸可以分为以下六个标准氨基酸组：(1)疏水的：met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水的：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性的：asp、glu；(4)碱性的：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；和(6)芳族的：trp、tyr、phe。

如本文所用，“保守取代”定义为氨基酸被上文所示的六个标准氨基酸组的相同组中列出的另一种氨基酸交换。例如，由glu交换asp在如此修饰的多肽中保留一个负电荷。此外，甘氨酸和脯氨酸可以基于它们破坏α-螺旋的能力而彼此取代。

如本文所用，“非保守取代”定义为氨基酸被上文所示的六个标准氨基酸组(1)至(6)的不同组中列出的另一种氨基酸交换。

在实施方案中，取代还可以包括非经典氨基酸(一般例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、n-甲酰甲硫氨酸β-丙氨酸、gaba和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(paba)、常见氨基酸的d型异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、abu、2-氨基丁酸、γ-abu、ε-ahx、6-氨基己酸、aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸(sarcosme)、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计产生氨基酸(designeraminoacids)(诸如β甲基氨基酸、cα-甲基氨基酸、nα-甲基氨基酸)以及氨基酸类似物)。

还可以通过参考遗传密码(包括考虑密码子简并性)对嵌合蛋白的核苷酸序列进行突变。

在实施方案中，嵌合蛋白包含接头。在实施方案中，接头包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。如本文其他地方所述，不希望受理论束缚，这种至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基负责维持嵌合蛋白的适当多聚体状态并允许有效生产。

在实施方案中，提供了一种制备稳定的嵌合蛋白的方法，其包括将i型跨膜蛋白和ii型跨膜蛋白细胞外结构域用包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头连接，使得所得的嵌合蛋白被适当地折叠和/或形成稳定的多聚体状态。

在实施方案中，接头可以衍生自天然存在的多结构域蛋白或者是经验接头，如例如在chichili等,(2013),proteinsci.22(2):153-167，chen等,(2013),advdrugdelivrev.65(10):1357-1369中所述，所述文献的全部内容特此以引用的方式并入。在实施方案中，接头可以使用接头设计数据库和计算机程序来设计，诸如chen等,(2013),advdrugdelivrev.65(10):1357-1369和crasto等,(2000),proteineng.13(5):309-312中所述的那些数据库和计算机程序，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文。

在实施方案中，接头是合成接头，诸如peg。

在实施方案中，接头是多肽。在实施方案中，接头长度小于约500个氨基酸、长约450个氨基酸、长约400个氨基酸、长约350个氨基酸、长约300个氨基酸、长约250个氨基酸、长约200个氨基酸、长约150个氨基酸或长约100个氨基酸。例如，接头长度可以小于约100、约95、约90、约85、约80、约75、约70、约65、约60、约55、约50、约45、约40、约35、约30、约25、约20、约19、约18、约17、约16、约15、约14、约13、约12、约11、约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3或约2个氨基酸。在实施方案中，接头是柔性的。在另一个实施方案中，接头是刚性的。

在实施方案中，接头基本上包含甘氨酸和丝氨酸残基(例如，约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％、或约98％、或约99％、或约100％的甘氨酸和丝氨酸)。

在实施方案中，接头是抗体的铰链区(例如igg、iga、igd和ige的铰链区，包括亚类(例如，igg1、igg2、igg3和igg4以及iga1和iga2))。存在于igg、iga、igd和ige类抗体中的铰链区充当柔性间隔区，从而允许fab部分在空间中自由移动。与恒定区相反，铰链结构域在结构上是多样的，在免疫球蛋白类和亚类中在序列和长度二者方面均变化。例如，铰链区的长度和柔性在igg亚类中变化。igg1的铰链区包含氨基酸216-231，并且因为它是自由柔性的，所以fab片段可以围绕它们的对称轴旋转并在以两个重链间二硫桥中的第一个为中心的球内移动。igg2具有比igg1更短的铰链，具有12个氨基酸残基和4个二硫桥。igg2的铰链区缺少甘氨酸残基，相对较短，并含有通过额外的重链间二硫桥稳定的刚性聚脯氨酸双螺旋。这些特性限制了igg2分子的柔性。igg3与其他亚类的不同之处在于其独特的延伸的铰链区(约为igg1铰链长度的4倍)，其含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，从而形成非柔性的聚脯氨酸双螺旋。在igg3中，fab片段离fc片段相对较远，从而使分子具有更大的柔性。与其他亚类相比，igg3中的细长铰链也是其较高分子量的原因。igg4的铰链区比igg1的铰链区更短，并且其柔性介于igg1与igg2之间。据报道，铰链区的柔性按igg3>igg1>igg4>igg2的顺序降低。在实施方案中，接头可以衍生自人igg4并含有一个或多个突变以增强二聚化(包括s228p)或fcrn结合。

根据晶体学研究，免疫球蛋白铰链区可以进一步在功能上细分为三个区域：上铰链区、核心区和下铰链区。参见shin等,1992immunologicalreviews130:87。上铰链区包括从ch1的羧基末端到限制运动的铰链中的第一个残基(通常是在两个重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基)的氨基酸。上铰链区的长度与抗体的节段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫键，并且下铰链区连接ch2结构域的氨基末端并包括ch2中的残基。同上。野生型人igg1的核心铰链区含有序列cys-pro-pro-cys，当通过二硫键形成二聚化时，其产生被认为充当枢轴的环状八肽，从而赋予柔性。在实施方案中，本发明的接头包含任何抗体(例如igg、iga、igd和ige，包括亚类(例如，igg1、igg2、igg3和igg4以及iga1和iga2))的上铰链区、核心区和下铰链区中的一个、两个或三个。铰链区还可以含有一个或多个糖基化位点，其包括许多结构上不同类型的碳水化合物附着位点。例如，iga1在铰链区的17个氨基酸的区段内含有五个糖基化位点，从而赋予铰链区多肽对肠蛋白酶的抗性，被认为是分泌型免疫球蛋白的有利特性。在实施方案中，本发明的接头包含一个或多个糖基化位点。

在实施方案中，接头包含抗体的fc结构域(例如igg、iga、igd和ige的铰链区，包括亚类(例如，igg1、igg2、igg3和igg4以及iga1和iga2))。在实施方案中，接头包含衍生自人igg4抗体的铰链-ch2-ch3fc结构域。在实施方案中，接头包含衍生自人igg1抗体的铰链-ch2-ch3fc结构域。在实施方案中，fc结构域表现出对新生儿fc受体(fcrn)的增加的亲和力和增强的结合。在实施方案中，fc结构域包括一个或多个突变，其增加与fcrn的亲和力并增强与fcrn的结合。不希望受理论束缚，据信与fcrn的增加的亲和力和增强的结合增加了本发明的嵌合蛋白的体内半衰期。

在实施方案中，fc结构域接头在氨基酸残基250、252、254、256、308、309、311、416、428、433或434(根据kabat编号，如在kabat,等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)中所述，其以引用的方式明确并入本文)或其等同物处含有一个或多个氨基酸取代。在一个实施方案中，氨基酸残基250处的氨基酸取代是用谷氨酰胺进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基252处的氨基酸取代是用酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或苏氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基254处的氨基酸取代是用苏氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基256处的氨基酸取代是用丝氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸或苏氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基308处的氨基酸取代是用苏氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基309处的氨基酸取代是用脯氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基311处的氨基酸取代是用丝氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基385处的氨基酸取代是用精氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、赖氨酸、丙氨酸或甘氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基386处的氨基酸取代是用苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、精氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基387处的氨基酸取代是用精氨酸、脯氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基389处的氨基酸取代是用脯氨酸、丝氨酸或天冬酰胺进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基416处的氨基酸取代是用丝氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基428处的氨基酸取代是用亮氨酸进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基433处的氨基酸取代是用精氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或谷氨酰胺进行的取代。在一个实施方案中，氨基酸残基434处的氨基酸取代是用组氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸进行的取代。

在实施方案中，fc结构域接头(例如，包含igg恒定区)包含一个或多个突变，诸如在氨基酸残基252、254、256、433、434或436(根据kabat编号，如在kabat,等,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991)中所述，其以引用的方式明确并入本文)处的取代。在一个实施方案中，igg恒定区包括三重m252y/s254t/t256e突变或yte突变。在另一个实施方案中，igg恒定区包括三重h433k/n434f/y436h突变或kfh突变。在另一实施方案中，igg恒定区包括组合的yte和kfh突变。

在实施方案中，本发明的修饰的人源化抗体包含igg恒定区，其在氨基酸残基250、253、307、310、380、416、428、433、434和435处含有一个或多个突变。例示性突变包括t250q、m428l、t307a、e380a、i253a、h310a、r416s、m428l、h433k、n434a、n434f、n434s和h435a。在一个实施方案中，igg恒定区包含m428l/n434s突变或ls突变。在另一个实施方案中，igg恒定区包含t250q/m428l突变或ql突变。在另一个实施方案中，igg恒定区包含n434a突变。在另一个实施方案中，igg恒定区包含t307a/e380a/n434a突变或aaa突变。在另一个实施方案中，igg恒定区包含i253a/h310a/h435a突变或ihh突变。在另一个实施方案中，igg恒定区包含h433k/n434f突变。在另一个实施方案中，igg恒定区包含组合的m252y/s254t/t256e和h433k/n434f突变。

igg恒定区中的另外的例示性突变描述于以下中：例如，robbie,等,antimicrobialagentsandchemotherapy(2013),57(12):6147-6153，dall’acqua等,jbc(2006),281(33):23514-24，dall’acqua等,journalofimmunology(2002),169:5171-80，ko等,nature(2014)514:642-645，grevys等,journalofimmunology.(2015),194(11):5497-508，和美国专利号7,083,784，其全部内容特此以引用的方式并入。

在实施方案中，接头包含seqidno:45的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，对seqidno:45进行突变以增加稳定性和/或半衰期。例如，在实施方案中，接头具有seqidno:46的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。在实施方案中，接头包含seqidno:47的氨基酸序列，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。

不希望受理论束缚，在嵌合蛋白中包括包含至少一部分fc结构域的接头，有助于避免形成不可溶的并且可能是非功能性的蛋白质多联体和/或聚集体。这部分地是由于fc结构域中存在能够在嵌合蛋白之间形成二硫键的半胱氨酸。

例示性fc稳定化突变体是s228p。例示性fc半衰期延长突变体是t250q、m428l、v308t、l309p和q311s，并且本发明的接头可以包含这些突变体中的1个、或2个、或3个、或4个、或5个。

此外，可以采用一个或多个连接接头来连接接头中的fc结构域(例如，seqidno:45、seqidno:46或seqidno:47中的一个，或与其具有至少90％、或93％、或95％、或97％、或98％、或99％同一性的结构域)和细胞外结构域。例如，seqidno:48、seqidno:49、seqidno:50、seqidno:51、seqidno:52、seqidno:53中的任一个或其变体可以连接如本文所述的细胞外结构域和如本文所述的接头。任选地，seqidno:48、seqidno:49、seqidno:50、seqidno:51、seqidno:52、seqidno:53中的任一个或其变体在如本文所述的细胞外结构域与如本文所述的接头之间置换。任选地，seqidno:45至94中的任一个或其变体定位于如本文所述的细胞外结构域与如本文所述的fc结构域之间。在实施方案中，嵌合蛋白包含fc结构域之前的一个连接接头以及fc结构域之后的第二连接接头；因此，嵌合蛋白可以具有以下结构：

ecd1–连接接头1–fc结构域–连接接头2–ecd2。

在实施方案中，第一连接接头和第二连接接头可以是不同的或者它们可以是相同的。

例示性接头的氨基酸序列在以下表1中提供：

表1：例示性接头(fc结构域接头和连接接头)

另外的例示性连接接头包括但不限于具有以下序列的接头：le、ggggs(seqidno:69)、(ggggs)n(n＝1-4)(seqidno:69-72)、(gly)8(seqidno:78)、(gly)6(seqidno:79)、(eaaak)n(n＝1-3)(seqidno:80-82)、a(eaaak)na(n＝2-5)(seqidno:83-86)、aeaaakeaaaka(seqidno:83)、a(eaaak)4alea(eaaak)4a(seqidno:87)、papap(seqidno:88)、kesgsvsseqlaqfrsld(seqidno:89)、egkssgsgseskst(seqidno:56)、gsagsaagsgef(seqidno:90)和(xp)n，其中x表示任何氨基酸，例如ala、lys或glu。

在实施方案中，连接接头基本上包含甘氨酸和丝氨酸残基(例如，约30％、或约40％、或约50％、或约60％、或约70％、或约80％、或约90％、或约95％、或约97％、或约98％、或约99％、或约100％)甘氨酸和丝氨酸)。例如，在实施方案中，连接接头是(gly4ser)n，其中n为约1至约8，例如1、2、3、4、5、6、7或8(分别为seqidno:69至seqidno:76)。在实施方案中，连接接头是ggsggsggggsggggs(seqidno:77)。另外的例示性连接接头包括但不限于具有以下序列的接头：le、(gly)8(seqidno:78)、(gly)6(seqidno:79)、(eaaak)n(n＝1-3)(seqidno:80-seqidno:82)、a(eaaak)na(n＝2-5)(seqidno:83–seqidno:86)、a(eaaak)4alea(eaaak)4a(seqidno:43)、papap(seqidno:44)、kesgsvsseqlaqfrsld(seqidno:45)、gsagsaagsgef(seqidno:87)和(xp)n，其中x表示任何氨基酸，例如ala、lys或glu。在实施方案中，连接接头是ggs。

在实施方案中，连接接头是以下中的一个或多个：gggse(seqidno:91)、gsesg(seqidno:92)、gsegs(seqidno:93)、geggsgegssgegsssegggsegggsegggseggs(seqidno:94)以及每4个氨基酸间隔随机放置g、s和e的连接接头。

在实施方案中，嵌合蛋白包含模块接头，如图39所示。

在实施方案中，接头可以是柔性的，包括但不限于高度柔性的。在实施方案中，接头可以是刚性的，包括但不限于刚性α螺旋。

在实施方案中，接头可以是功能性的。例如但不限于，接头可以起到改善本发明的嵌合蛋白的折叠和/或稳定性、改善表达、改善药代动力学和/或改善其生物活性的作用。在另一个实例中，接头可以起到将嵌合蛋白靶向特定细胞类型或位置的作用。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够并且可以用于包括促进免疫活化(例如，针对肿瘤)的方法中。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够并且可以用于包括抑制免疫抑制(例如，其允许肿瘤存活)的方法中。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白由于构建体的嵌合性质提供的信号传导的近似性而提供改善的免疫活化和/或改善的对免疫抑制的抑制。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够或可以用于包括调节免疫应答的幅度的方法中，例如，调节效应子输出的水平。在实施方案中，例如，当用于治疗癌症时，与免疫抑制相比，本发明的嵌合蛋白改变免疫刺激的程度以增加t细胞应答的幅度，其包括但不限于刺激细胞因子产生、增殖或靶向杀伤潜力的水平增加。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白在实施方案中能够或可用于涉及在肿瘤细胞表面上掩蔽抑制配体以及用免疫刺激配体替换所述免疫抑制配体的方法中。因此，本发明的嵌合蛋白在实施方案中能够或可用于涉及降低或消除抑制免疫信号和/或增加或活化免疫刺激信号的方法中。例如，携带抑制信号(并因此逃避免疫应答)的肿瘤细胞可以被结合在t细胞上的正信号取代，然后t细胞可以攻击肿瘤细胞。因此，在实施方案中，本发明的构建体掩蔽抑制免疫信号并活化刺激免疫信号。通过本发明的嵌合蛋白的单一构建方法增强了此类有益特性。例如，信号替换可以几乎同时实现，并且信号替换被定制为在临床重要部位(例如，肿瘤微环境)处是局部的。另外的实施方案将相同的原理应用于其他嵌合蛋白构建体，例如像，(i)pd-1的细胞外结构域和(ii)gitrl的细胞外结构域；(i)btla的细胞外结构域和(ii)ox40l的细胞外结构域；(i)tigit的细胞外结构域和(ii)ox40l的细胞外结构域；(i)tim3的细胞外结构域和(ii)ox40l的细胞外结构域；以及(i)cd172a(sirp1α)的细胞外结构域和(ii)cd40l的细胞外结构域；以及(i)cd115的细胞外结构域和(ii)cd40l的细胞外结构域；以及(i)tim3的细胞外结构域和(ii)ox40l的细胞外结构域；以及(i)tigit的细胞外结构域和(ii)ox40l的细胞外结构域；等等。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够或可用于包括刺激或增强免疫刺激受体/配体对的结合的方法中。例示性t细胞共刺激受体及其配体包括ox-40:ox40-l、cd27:cd70、cd30:cd30-l、cd40:cd40-l、cd137:cd137-l、hvem:light、gitr:gitr-l、tnfrsf25:tl1a、dr5:trail和btla:hvem。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够或可用于包括抑制或降低免疫抑制受体/配体对的结合的方法中。例示性t细胞共抑制受体及其配体包括，例如，ctla-4:cd80/cd86、pd-1:pd-l1/pd-l2、btla:hvem、tim-3:半乳凝素-9/磷脂酰丝氨酸、tigit/cd155或cd112、vista/vsig8、cd172a(sirpα)/cd47、b7h3r/b7h3、b7h4r/b7h4、cd244/cd48、tmigd2/hhla2等等。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白阻断、降低和/或抑制pd-1以及pd-l1或pd-l2和/或pd-1与pd-l1或pd-l2的结合。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白阻断、降低和/或抑制ctla-4的活性和/或ctla-4与ap2m1、cd80、cd86、shp-2和ppp2r5a中的一种或多种的结合。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白增加和/或刺激gitr和/或gitr与一种或多种gitr配体的结合。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白增加和/或刺激ox40和/或ox40与一种或多种ox40配体的结合。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够或可用于涉及增强、恢复、促进和/或刺激免疫调节的方法中。在实施方案中，本文所述的本发明的嵌合蛋白恢复、促进和/或刺激一种或多种针对肿瘤细胞的免疫细胞的活性或活化，所述免疫细胞包括但不限于：t细胞、细胞毒性t淋巴细胞、t辅助细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、抗肿瘤巨噬细胞(例如m1巨噬细胞)、b细胞和树突细胞。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白增强、恢复、促进和/或刺激t细胞的活性和/或活化，作为非限制性实例，包括活化和/或刺激一种或多种t细胞固有信号，其包括促存活信号；自分泌或旁分泌生长信号；p38mapk-、erk-、stat-、jak-、akt-或pi3k-介导的信号；抗细胞凋亡信号；和/或促进以下中的一种或多种和/或以下中的一种或多种必需的信号：促炎细胞因子产生、或t细胞迁移、或t细胞肿瘤浸润。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够或可用于涉及引起进入肿瘤或肿瘤微环境内的一种或多种t细胞(包括但不限于细胞毒性t淋巴细胞、t辅助细胞、自然杀伤t(nkt)细胞)、b细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞(例如，m1和m2中的一种或多种)增加的方法中。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够或可用于涉及抑制和/或致使降低免疫抑制细胞(例如，髓样抑制细胞(mdsc)、调节t细胞(treg)、肿瘤相关嗜中性粒细胞(tan)、m2巨噬细胞和肿瘤相关巨噬细胞(tam))到肿瘤和/或肿瘤微环境(tme)中的募集的方法中。在实施方案中，本发明的疗法可以改变肿瘤部位和/或tme中m1巨噬细胞相对于m2巨噬细胞的比例，以有利于m1巨噬细胞。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够并且可以用于包括抑制和/或降低t细胞失活和/或对肿瘤的免疫耐受性的方法中，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的嵌合蛋白。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增加各种细胞因子的血清水平，所述细胞因子包括但不限于ifnγ、tnfα、il-2、il-4、il-5、il-6、il-9、il-10、il-13、il-17a、il-17f和il-22中的一种或多种。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够增强治疗的受试者血清中的il-2、il-4、il-5、il-10、il-13、il-17a、il-22、tnfα或ifnγ。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白的施用能够增强tnfα分泌。在一个具体实施方案中，本发明的嵌合蛋白的施用能够增强白细胞的超抗原介导的tnfα分泌。检测这种细胞因子应答可以提供确定所指示的嵌合蛋白的最佳给药方案的方法。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白抑制、阻断和/或减少抗肿瘤cd8+和/或cd4+t细胞的细胞死亡；或者刺激、诱导和/或增加促肿瘤t细胞的细胞死亡。t细胞耗竭是t细胞功能障碍的一种状态，其特征在于增殖和效应子功能的进行性丧失，从而最终导致克隆缺失。因此，促肿瘤t细胞是指在许多慢性感染和癌症期间出现的t细胞功能障碍的一种状态。这种功能障碍被定义为较差的增殖和/或效应子功能、抑制受体的持续表达以及与功能效应t细胞或记忆t细胞的转录状态不同的转录状态。耗竭防止感染和肿瘤的最佳控制。此外，抗肿瘤cd8+和/或cd4+t细胞是指可以对肿瘤产生免疫应答的t细胞。例示性促肿瘤t细胞包括但不限于treg、表达一种或多种检查点抑制受体的cd4+和/或cd8+t细胞、th2细胞和th17细胞。检查点抑制受体是指在免疫细胞上表达的受体(例如，ctla-4、b7-h3、b7-h4、tim-3)，其预防或抑制不受控制的免疫应答。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够并且可以用于包括增加效应t细胞与调节t细胞的比例的方法中。例示性效应t细胞包括icos⁺效应t细胞；细胞毒性t细胞(例如，αβtcr、cd3⁺、cd8⁺、cd45ro⁺)；cd4⁺效应t细胞(例如，αβtcr、cd3⁺、cd4⁺、ccr7⁺、cd62lhi、il^-7r/cd127⁺)；cd8⁺效应t细胞(例如，αβtcr、cd3⁺、cd8⁺、ccr7⁺、cd62lhi、il^-7r/cd127⁺)；效应记忆t细胞(例如，cd62l低、cd44⁺、tcr、cd3⁺、il^-7r/cd127⁺、il-15r⁺、ccr7低)；中枢记忆t细胞(例如，ccr7⁺、cd62l⁺、cd27⁺；或ccr7hi、cd44⁺、cd62lhi、tcr、cd3⁺、il-7r/cd127⁺、il-15r⁺)；cd62l⁺效应t细胞；cd8⁺效应记忆t细胞(tem)，包括早期效应记忆t细胞(cd27⁺cd62l^-)和晚期效应记忆t细胞(cd27^-cd62l^-)(分别为teme和teml)；cd127(⁺)cd25(低/-)效应t细胞；cd127(^-)cd25(^-)效应t细胞；cd8⁺干细胞记忆效应细胞(tscm)(例如，cd44(低)cd62l(高)cd122(高)sca(⁺))；th1效应t细胞(例如，cxcr3⁺、cxcr6⁺和ccr5⁺；或αβtcr、cd3⁺、cd4⁺、il-12r⁺、ifnγr⁺、cxcr3⁺)；th2效应t细胞(例如，ccr3⁺、ccr4⁺和ccr8⁺；或αβtcr、cd3⁺、cd4⁺、il-4r⁺、il-33r⁺、ccr4⁺、il-17rb⁺、crth2⁺)；th9效应t细胞(例如，αβtcr、cd3⁺、cd4⁺)；th17效应t细胞(例如，αβtcr、cd3⁺、cd4⁺、il-23r⁺、ccr6⁺、il-1r⁺)；cd4⁺cd45ro⁺ccr7⁺效应t细胞，cd4⁺cd45ro⁺ccr7(^-)效应t细胞；以及分泌il-2、il-4和/或ifn-γ的效应t细胞。例示性调节t细胞包括icos⁺调节t细胞、cd4⁺cd25⁺foxp3⁺调节t细胞、cd4⁺cd25⁺调节t细胞、cd4⁺cd25^-调节t细胞、cd4⁺cd25高调节t细胞、tim-3⁺pd-1⁺调节t细胞、淋巴细胞活化基因-3(lag-3)⁺调节t细胞、ctla-4/cd152⁺调节t细胞、神经纤毛蛋白-1(nrp-1)⁺调节t细胞、ccr4⁺ccr8⁺调节t细胞、cd62l(l-选择素)⁺调节t细胞、cd45rb低调节t细胞、cd127低调节t细胞、lrrc32/garp⁺调节t细胞、cd39⁺调节t细胞、gitr⁺调节t细胞、lap⁺调节t细胞、1b11⁺调节t细胞、btla⁺调节t细胞、1型调节t细胞(tr1细胞)、t辅助3型(th3)细胞、自然杀伤t细胞表型的调节细胞(nktreg)、cd8⁺调节t细胞、cd8⁺cd28^-调节t细胞和/或分泌il-10、il-35、tgf-β、tnf-α、半乳凝素-1、ifn-γ和/或mcp1的调节t细胞。

在实施方案中，嵌合蛋白产生记忆应答，其可以例如能够预防复发，或保护动物免于复发，和/或预防或降低转移的可能性。因此，用嵌合蛋白处理的动物稍后能够在用嵌合蛋白初始处理之后暴露于相关抗原时攻击肿瘤细胞和/或预防肿瘤发展。因此，本发明的嵌合蛋白刺激活性肿瘤破坏，也刺激肿瘤抗原的免疫识别，这对于设计能够预防复发的记忆应答是必需的。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够并且可以用于包括瞬时刺激效应t细胞不超过约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或约96小时或者约1周或约2周的方法中。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白能够并且可以用于包括瞬时消耗或抑制调节t细胞不超过约12小时、约24小时、约48小时、约72小时或约96小时或者约1周或约2周的方法中。在实施方案中，效应t细胞的瞬时刺激和/或调节t细胞的瞬时消耗或抑制基本上发生在患者的血液中或特定组织/位置(包括淋巴组织，例如像骨髓、淋巴结、脾脏、胸腺、粘膜相关淋巴组织(malt)，非淋巴组织)中或肿瘤微环境中。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白质提供包括但不限于易于施用和易于生产的优点。这是因为将两种不同的免疫治疗剂组合成了单一产品，这允许单一制造过程代替两个独立的制造过程。此外，施用单一剂代替两种单独的剂允许更容易的施用和更大的患者依从性。此外，与例如单克隆抗体相比，所述单克隆抗体是含有许多二硫键和翻译后修饰(诸如糖基化)的大型多聚体蛋白质，本发明的嵌合蛋白更容易制造并且更具成本效益。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白可作为可分泌的和完全功能的单一多肽链在哺乳动物宿主细胞中产生。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白意外地提供细胞外结构域组分以缓慢的解离速率(kd或koff)与其各自的结合配偶体的结合。在实施方案中，这提供了受体与配体(并且反之亦然)的意外长的相互作用。这种效果允许持续的负信号掩蔽效果。此外，在实施方案中，这提供了更长的正信号效果，例如，以允许效应细胞被充分刺激用于抗肿瘤效果。例如，本发明的嵌合蛋白，例如通过长解离速率结合，允许足够的信号传递以提供t细胞增殖并允许抗肿瘤攻击。作为另一实例，本发明的嵌合蛋白，例如通过长解离速率结合，允许足够的信号传递以提供刺激信号(例如像细胞因子)的释放。

由本发明的剂促进的细胞的稳定突触(例如，具有负信号的肿瘤细胞和可以攻击肿瘤的t细胞)提供空间取向以有利于肿瘤减少-诸如定位t细胞以攻击肿瘤细胞和/或在空间上防止肿瘤细胞递送负信号，其包括超出本发明的嵌合蛋白掩蔽的那些信号的负信号。

在实施方案中，与嵌合蛋白的血清t1/2相比，这提供了更长的靶上(例如，肿瘤内)半衰期(t1/2)。此类特性可以具有降低脱靶毒性的组合优点，这可能与嵌合蛋白的全身分布有关。

此外，在实施方案中，本发明的嵌合蛋白提供协同治疗效果，因为它允许改善两种免疫治疗剂的位点特异性相互作用。

在实施方案中，本发明的嵌合蛋白提供用于降低位点外毒性和/或全身毒性的潜力。

在实施方案中，相对于目前的免疫疗法，例如如本文所述的针对检查点分子的抗体，本发明的嵌合蛋白提供减少的副作用，例如gi并发症。例示性gi并发症包括腹痛、食欲减退、自身免疫效应、便秘、痉挛、脱水、腹泻、进食问题、疲劳、胃肠胀气、腹腔积液或腹水、胃肠道(gi)生态失调、gi粘膜炎、炎性肠病、肠易激综合征(ibs-d和ibs-c)、恶心、疼痛、粪便或尿液变化、溃疡性结肠炎、呕吐、保留液重量增加和/或虚弱

疾病；治疗方法和患者选择

在实施方案中，本发明涉及癌症和/或肿瘤；例如，癌症和/或肿瘤的治疗或预防。如本文其他地方所述，在实施方案中，癌症的治疗可以涉及用本发明的嵌合蛋白调节免疫系统以相对于免疫抑制有利于免疫刺激。

癌症或肿瘤是指不受控制的细胞生长和/或异常增加的细胞存活和/或细胞凋亡的抑制，这干扰身体器官和系统的正常功能。包括良性和恶性癌症、息肉、增生、以及休眠肿瘤或微转移。还包括具有不受免疫系统阻碍的异常增殖的细胞(例如，病毒感染的细胞)。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。原发性癌症可以是在临床上可检测的起源部位的癌细胞区域，并且可以是原发性肿瘤。相比之下，转移性癌症可以是疾病从一个器官或部分到另一个非相邻器官或部分的扩散。转移性癌症可能由癌细胞引起，所述癌细胞获得穿透并浸润局部区域中的周围正常组织的能力，从而形成新肿瘤，其可以是局部转移。癌症还可能由癌细胞引起，所述癌细胞获得穿透淋巴管和/或血管壁的能力，之后癌细胞能够通过血液(由此成为循环肿瘤细胞)循环到身体的其他部位和组织。癌症可以是由于诸如淋巴或血液扩散等的过程。癌症还可能由肿瘤细胞引起，所述肿瘤细胞到达以停留在另一个部位，再次穿透血管或壁，继续繁殖，并最终形成另一个临床上可检测的肿瘤。癌症可以是这种新的肿瘤，其可以是转移性(或继发性)肿瘤。

癌症还可能由已经转移的肿瘤细胞引起，其可以是继发性或转移性肿瘤。肿瘤细胞可以与原始肿瘤中的细胞相似。例如，如果乳腺癌或结肠癌转移到肝脏，则存在于肝脏中的继发性肿瘤由异常的乳腺细胞或结肠细胞组成，而不是由异常的肝细胞组成。因此，肝脏中的肿瘤可以是转移性乳腺癌或转移性结肠癌，而不是肝癌。

癌症可能来源于任何组织。癌症可能来源于黑色素瘤、结肠、乳腺或前列腺，并因此可能分别由最初是皮肤、结肠、乳腺或前列腺的细胞组成。癌症也可以是血液恶性肿瘤，其可以是白血病或淋巴瘤。癌症可能侵入诸如肝脏、肺、膀胱或肠道等组织。

本发明的代表性癌症和/或肿瘤包括但不限于基底细胞癌，胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结直肠癌；结缔组织癌；消化系统的癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝细胞癌；上皮内肿瘤；肾癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；子宫或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤以及b细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)、小淋巴细胞(sl)nhl；中级/滤泡性nhl；中级弥漫性nhl；高级免疫母细胞nhl；高级淋巴细胞nhl；高级小非裂解细胞nhl；巨大肿块nhl；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(cll)；急性淋巴细胞白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞白血病；以及其他癌和肉瘤；和移植后淋巴组织增生性障碍(ptld)以及与瘢痣病、水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿)和麦格综合征相关的异常血管增生。

在实施方案中，嵌合蛋白用于治疗患有治疗难治性癌症的受试者。在实施方案中，嵌合蛋白用于治疗用一种或多种免疫调节剂难以治疗的受试者。例如，在实施方案中，嵌合蛋白用于治疗在治疗12周左右之后对治疗没有应答或甚至进展的受试者。例如，在实施方案中，受试者用pd-1和/或pd-l1和/或pd-l2剂难以治疗，包括例如纳武单抗(ono-4538/bms-936558、mdx1106、opdivo，bristolmyerssquibb)、派姆单抗(keytruda，merck)、pidilizumab(ct-011，curetech)、mk-3475(merck)、bms936559(bristolmyerssquibb)、依鲁替尼(pharmacyclics/abbvie)、阿特珠单抗(tecentriq，genentech)和/或mpdl328oa(roche)难治性患者。例如，在实施方案中，受试者用抗ctla-4剂难以治疗，例如易普利姆玛(yervoy)难治性患者(例如，黑色素瘤患者)。因此，在实施方案中，本发明提供了癌症治疗方法，其拯救对各种疗法(包括一种或多种免疫调节剂的单一疗法)无应答的患者。

在实施方案中，本发明提供了靶向肿瘤微环境内的细胞或组织的嵌合蛋白。在实施方案中，肿瘤微环境内的细胞或组织表达嵌合蛋白的一种或多种靶标或者结合配偶体。肿瘤微环境是指细胞环境，包括细胞、分泌蛋白、生理小分子和肿瘤存在的血管。在实施方案中，肿瘤微环境内的细胞或组织是以下中的一种或多种：肿瘤脉管系统；肿瘤浸润淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(epc)；癌症相关成纤维细胞；周细胞；其他基质细胞；细胞外基质(ecm)的组分；树突细胞；抗原呈递细胞；t细胞；调节t细胞；巨噬细胞；嗜中性粒细胞；和位于肿瘤附近的其他免疫细胞。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白靶向癌细胞。在实施方案中，癌细胞表达嵌合蛋白的靶标或者结合配偶体中的一种或多种。

在例示性实施方案中，本发明的嵌合蛋白可以靶向表达pd-l1和/或pd-l2的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达ox-40的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达gitr的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达4-1bb的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达cd40的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达vista的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达csf1的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达il-34的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达cd47的细胞(例如，癌细胞或免疫细胞)。在例示性实施方案中，嵌合蛋白可以靶向表达半乳凝素-9和/或磷脂酰丝氨酸的细胞(例如，癌细胞、基质细胞或免疫细胞)。

在实施方案中，本发明的方法提供了在另外的剂难以治疗的患者中使用嵌合蛋白的治疗，此类在本文其他地方描述的“另外的剂”包括但不限于本文所述的各种化学治疗剂。

在实施方案中，嵌合蛋白用于治疗、控制或预防一种或多种炎性疾病或病状。炎性疾病的非限制性实例包括寻常痤疮、急性炎症、过敏性鼻炎、哮喘、动脉粥样硬化、特应性皮炎、自身免疫性疾病、自身炎症性疾病、常染色体隐性痉挛性共济失调、支气管扩张、乳糜泻、慢性胆囊炎、慢性炎症、慢性前列腺炎、结肠炎、憩室炎、家族性嗜酸性粒细胞增多症(fe)、肾小球肾炎、甘油激酶缺乏症、化脓性汗腺炎、过敏、炎症、炎性肠病、炎性盆腔疾病、间质性膀胱炎、喉炎性疾病、leigh综合征、扁平苔癣、肥大细胞活化综合征、肥大细胞增多症、眼部炎性疾病、中耳炎、疼痛、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、呼吸系统疾病、再狭窄、风湿热、类风湿性关节炎、鼻炎、结节病、感染性休克、矽肺病和其他尘肺病、移植排斥、肺结核和血管炎。

在实施方案中，炎性疾病是自身免疫性疾病或病状，诸如多发性硬化、糖尿病、狼疮、乳糜泻、克罗恩病、溃疡性结肠炎、格林-巴利综合征、硬皮病、古德帕斯彻氏综合症、韦格纳肉芽肿病、自身免疫性癫痫、拉斯穆森脑炎、原发性胆汁硬化、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、艾迪生病、桥本氏甲状腺炎、纤维肌痛、梅尼尔综合征、移植排斥(例如，预防同种异体移植物排斥)、恶性贫血、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、赖特氏综合症、格雷夫氏病和其他自身免疫性疾病。

在一些方面，本发明的嵌合剂用于消除细胞内病原体。在一些方面，本发明的嵌合剂用于治疗一种或多种感染。在实施方案中，本发明的嵌合蛋白用于治疗病毒感染(包括例如hiv和hcv)、寄生虫感染(包括例如疟疾)和细菌感染的方法中。在实施方案中，感染诱导免疫抑制。例如，hiv感染经常在受感染的受试者中导致免疫抑制。因此，如本文其他地方所述，在实施方案中，此类感染的治疗可以涉及用本发明的嵌合蛋白调节免疫系统以相对于免疫抑制有利于免疫刺激。或者，本发明提供了用于治疗诱导免疫活化的感染的方法。例如，肠蠕虫感染与慢性免疫活化相关。在这些实施方案中，此类感染的治疗可以涉及用本发明的嵌合蛋白调节免疫系统以相对于免疫刺激有利于免疫抑制。

在实施方案中，本发明提供了治疗病毒感染的方法，所述病毒感染包括但不限于急性或慢性病毒感染，例如呼吸道感染、乳头瘤病毒感染、单纯疱疹病毒(hsv)感染、人免疫缺陷病毒(hiv)感染以及内脏器官的病毒感染，诸如肝炎病毒感染。在实施方案中，病毒感染由黄病毒科(flaviviridae)的病毒引起。在实施方案中，黄病毒科的病毒选自黄热病病毒、西尼罗河病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒和丙型肝炎病毒。在实施方案中，病毒感染由小核糖核酸病毒科(picornaviridae)的病毒(例如，脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、柯萨奇病毒)引起。在实施方案中，病毒感染由正粘病毒科(orthomyxoviridae)的成员(例如，流感病毒)引起。在实施方案中，病毒感染由逆转录病毒科(retroviridae)的成员(例如，慢病毒)引起。在实施方案中，病毒感染是由副粘病毒科(paramyxoviridae)的成员(例如呼吸道合胞病毒、人副流感病毒、腮腺炎病毒属(例如腮腺炎病毒)、麻疹病毒和人偏肺病毒)引起。在实施方案中，病毒感染由本扬病毒科(bunyaviridae)的成员(例如，汉坦病毒)引起。在实施方案中，病毒感染由呼肠孤病毒科(reoviridae)的成员(例如，轮状病毒)引起。

在实施方案中，本发明提供了治疗寄生虫感染(诸如原生动物或蠕虫感染)的方法。在实施方案中，寄生虫感染由原生动物寄生虫引起。在实施方案中，oritiziab寄生虫选自肠原生动物、组织原生动物或血液原生动物。例示性原生动物寄生虫包括但不限于溶组织内阿米巴(entamoebahystolytica)、蓝氏贾第鞭毛虫(giardialamblia)、小鼠隐孢子虫(cryptosporidiummuris)、trypanosomatidagambiense、trypanosomatidarhodesiense、克氏锥虫(trypanosomatidacrusi)、墨西哥利什曼虫(leishmaniamexicana)、巴西利什曼原虫(leishmaniabraziliensis)、热带利什曼虫(leishmaniatropica)、杜氏利什曼虫(leishmaniadonovani)、刚地弓形虫(toxoplasmagondii)、间日疟原虫(plasmodiumvivax)、卵形疟原虫(plasmodiumovale)、三日疟原虫(plasmodiummalariae)、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、阴道毛滴虫(trichomonasvaginalis)和黑头组织滴虫(histomonasmeleagridis)。在实施方案中，寄生虫感染是通过蠕虫寄生虫，诸如线虫(例如，有腺纲(adenophorea))。在实施方案中，寄生虫选自侧尾腺口纲(例如，毛首鞭形线虫(trichuristrichiura)、似蚓蛔线虫(ascarislumbricoides)、蠕形住肠线虫(enterobiusvermicularis)、十二指肠钩虫(ancylostomaduodenale)、美洲板口线虫(necatoramericanus)、粪类圆线虫(strongyloidesstercoralis)、班氏吴策线虫(wuchereriabancrofti)、麦地那龙线虫(dracunculusmedinensis))。在实施方案中，寄生虫选自吸虫(例如，血吸虫、肝吸虫、肠吸虫和肺吸虫)。在实施方案中，寄生虫选自：曼氏血吸虫(schistosomamansoni)、埃及血吸虫(schistosomahaematobium)、日本血吸虫(schistosomajaponicum)、牛羊肝吸虫(fasciolahepatica)、巨片吸虫(fasciolagigantica)、异形吸虫(heterophyesheterophyes)、卫氏肺吸虫(paragonimuswestermani)。在实施方案中，寄生虫选自绦虫(例如，猪肉绦虫(taeniasolium)、牛肉绦虫(taeniasaginata)、短膜壳绦虫(hymenolepisnana)、细粒棘球绦虫(echinococcusgranulosus))。

在实施方案中，本发明提供了治疗细菌感染的方法。在实施方案中，细菌感染是通过革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、好氧细菌和/或厌氧细菌。在实施方案中，细菌选自但不限于葡萄球菌属(staphylococcus)、乳杆菌(lactobacillus)、链球菌(streptococcus)、八联球菌属(sarcina)、埃希氏菌属(escherichia)、肠杆菌属(enterobacter)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、假单胞菌属(pseudomonas)、不动杆菌属(acinetobacter)、分枝杆菌(mycobacterium)、变形杆菌属(proteus)、弯曲杆菌(campylobacter)、柠檬酸杆菌属(citrobacter)、奈瑟氏菌属(nisseria)、芽孢杆菌属(bacillus)、拟杆菌属(bacteroides)、消化球菌属(peptococcus)、梭菌属(clostridium)、沙门氏菌属(salmonella)、志贺氏菌属(shigella)、沙雷氏菌属(serratia)、嗜血杆菌属(haemophilus)、布鲁氏菌属(brucella)以及其他生物体。在实施方案中，细菌选自但不限于铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)、食酸假单胞菌(pseudomonasacidovorans)、产碱假单胞菌(pseudomonasalcaligenes)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonasmaltophilia)、洋葱伯克霍尔德菌(burkholderiacepacia)、嗜水气单胞菌(aeromonashydrophilia)、大肠杆菌(escherichiacoli)、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、甲型副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphi)、肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidis)、痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)、福氏志贺氏菌(shigellaflexneri)、宋内氏志贺菌(shigellasonnei)、阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)、产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)、土拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)、摩氏摩根菌(morganellamorganii)、奇异变形杆菌(proteusmirabilis)、普通变形杆菌(proteusvulgaris)、产碱普罗威登斯菌(providenciaalcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(providenciarettgeri)、斯氏普罗威登斯菌(providenciastuartii)、鲍曼不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、醋酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)、溶血不动杆菌(acinetobacterhaemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森菌(yersiniaenterocolitica)、鼠疫耶尔森菌(yersiniapestis)、假结核耶尔森菌(yersiniapseudotuberculosis)、中间耶尔森菌(yersiniaintermedia)、百日咳博代氏杆菌(bordetellapertussis)、副百日咳博代氏杆菌(bordetellaparapertussis)、支气管炎博代氏杆菌(bordetellabronchiseptica)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、副流感嗜血杆菌(haemophilusparainfluenzae)、溶血嗜血杆菌(haemophilushaemolyticus)、副溶血嗜血杆菌(haemophilusparahaemolyticus)、杜克嗜血杆菌(haemophilusducreyi)、多杀巴斯德菌(pasteurellamultocida)、溶血巴斯德菌(pasteurellahaemolytica)、粘膜炎布兰汉菌(branhamellacatarrhalis)、幽门螺杆菌(helicobacterpylori)、胎儿弯曲杆菌(campylobacterfetus)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、大肠弯曲杆菌(campylobactercoli)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、霍乱弧菌(vibriocholerae)、副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)、嗜肺军团菌(legionellapneumophila)、单核细胞增生李斯特菌(listeriamonocytogenes)、淋病奈瑟菌(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(neisseriameningitidis)、金氏菌属(kingella)、莫拉氏菌属(moraxella)、阴道加德菌(gardnerellavaginalis)、脆弱拟杆菌(bacteroidesfragilis)、狄氏拟杆菌(bacteroidesdistasonis)、拟杆菌属3452a同源组、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)、卵形拟杆菌(bacteroidesovalus)、多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、单形拟杆菌(bacteroidesuniformis)、埃氏拟杆菌(bacteroideseggerthii)、内脏拟杆菌(bacteroidessplanchnicus)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、鸟分枝杆菌(mycobacteriumavium)、胞内分枝杆菌(mycobacteriumintracellulare)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、溃疡棒状杆菌(corynebacteriumulcerans)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)、酿脓链球菌(streptococcuspyogenes)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)、中间葡萄球菌(staphylococcusintermedius)、猪葡萄球菌亚种hyicus(staphylococcushyicussubsp.hyicus)、溶血葡萄球菌(staphylococcushaemolyticus)、人葡萄球菌(staphylococcushominis)或解糖葡萄球菌(staphylococcussaccharolyticus)。

在一些方面，本发明的嵌合剂用于治疗一种或多种自身免疫性疾病或病症。在实施方案中，自身免疫性疾病或病症的治疗可以涉及用本发明的嵌合蛋白调节免疫系统以相对于免疫刺激有利于免疫抑制。可用本发明的嵌合蛋白治疗的例示性自身免疫性疾病或病症包括身体自身抗原成为免疫应答的靶标的那些疾病或病症，例如像类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、糖尿病、强直性脊柱炎、干燥综合征、炎性肠病(例如溃疡性结肠炎、克罗恩病)、多发性硬化症、结节病、牛皮癣、格雷夫氏病、桥本氏甲状腺炎、牛皮癣、过敏反应(例如过敏、花粉症、哮喘和急性水肿引起i型过敏反应)和血管炎。

在再一其他方面，本发明涉及治疗和预防t细胞介导的疾病和病症的方法，所述疾病和病症诸如但不限于本文其他地方描述的疾病或病症以及炎性疾病或病症、移植物抗宿主病(gvhd)、移植排斥和t细胞增殖性障碍。在此使用方法中具有实用性的i型ecd结构域的具体实例包括但不限于：tnfrsf1b、btnl2、pd-l1、pd-l2、ctla-4、b7-h3、b7-h4、cd40、ox40、cd137等等。

在一些方面，本发明的嵌合剂用于例如通过具有免疫刺激信号的细胞外结构域活化t细胞的方法中。

在一些方面，本发明的嵌合剂用于防止免疫抑制信号的细胞传递的方法中。

组合疗法和缀合

在实施方案中，本发明提供了嵌合蛋白和方法，所述方法还包括向受试者施用另外的剂。在实施方案中，本发明涉及共同施用和/或共制剂。本文所述的任何组合物可以共同配制和/或共同施用。

在实施方案中，本文所述的任何嵌合蛋白在与另一种剂共同施用时以协同方式起作用，并且以低于在此类剂用作单一疗法时通常采用的剂量进行施用。在实施方案中，本文提及的任何剂都可以与本文所述的任何嵌合蛋白组合使用。

在实施方案中，本文公开的任何嵌合蛋白都可以与本文公开的另一种嵌合蛋白共同施用。不希望受理论束缚，据信涉及施用一种或多种诱导先天免疫应答的嵌合蛋白和一种或多种诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白的组合方案可以提供协同效应(例如，协同抗肿瘤效应)。

在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：(i)第一嵌合蛋白，其具有n末端–(a)–(b)–(c)–c末端的一般结构，其中：(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，并且第一嵌合蛋白调节先天免疫系统；和(ii)第二嵌合蛋白，其具有n末端–(a)–(b)–(c)–c末端的一般结构，其中(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，并且第二嵌合蛋白调节适应性免疫系统。

在一些方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用：第二嵌合蛋白，其具有n末端-(a)-(b)–(c)–c末端的一般结构，其中(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，并且第二嵌合蛋白调节适应性免疫系统；其中所述受试者经历或经历过使用第一嵌合蛋白的治疗，所述第一嵌合蛋白具有n末端–(a)–(b)–(c)–c末端的一般结构，其中(a)是包含i型跨膜蛋白的细胞外结构域的第一结构域，(b)是包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基的接头，并且(c)是包含ii型跨膜蛋白的细胞外结构域的第二结构域，并且第一嵌合蛋白调节先天免疫系统。

在实施方案中，第一嵌合蛋白在第二嵌合蛋白之前施用。

在实施方案中，第一嵌合蛋白在第二嵌合蛋白之后施用。

在实施方案中，第一嵌合蛋白包含以下中的至少一种：tigit、csf1r、cd172a(sirp1α)、vsig8、tim3、41bbl、cd40l、siglec7、siglec9、light。

在实施方案中，第二嵌合蛋白包含以下中的至少一种：pd-1、tim3、vsig8、cd172a(sirp1α)、ox40l、gitrl、tl1a、il-2

在实施方案中，第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白独立地选自tim3-fc-ox40l、cd172a(sirp1α)-fc-cd40l和csf1r-fc-cd40l。

在实施方案中，tim3-fc-ox40l在cd172a(sirp1α)-fc-cd40l之前施用。在实施方案中，tim3-fc-ox40l在csf1r-fc-cd40l之前施用。在实施方案中，cd172a(sirp1α)-fc-cd40l在tim3-fc-ox40l之前施用。在实施方案中，csf1r-fc-cd40l在tim3-fc-ox40l之前施用。

在实施方案中，第一嵌合蛋白和/或第二嵌合蛋白引起抗原呈递细胞的活化。

在实施方案中，第一嵌合蛋白和/或第二嵌合蛋白增强抗原呈递细胞呈递抗原的能力。

在实施方案中，第一嵌合蛋白和/或第二嵌合蛋白提供持续的免疫调节效果。

在实施方案中，第一嵌合蛋白和/或第二嵌合蛋白防止肿瘤细胞传递免疫抑制信号。

在实施方案中，第二嵌合蛋白增强t细胞的肿瘤杀伤活性。

在实施方案中，任何诱导先天免疫应答的嵌合蛋白都可以用于本发明。在实施方案中，任何诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白都可以用于本发明。在例示性实施方案中，诱导先天免疫应答的嵌合蛋白是在n-末端包含csf1r的细胞外结构域并且在c-末端包含cd40l的细胞外结构域的嵌合蛋白。在另一个实施方案中，诱导先天免疫应答的嵌合蛋白是在n-末端包含sirpα的细胞外结构域并且在c-末端包含cd40l的细胞外结构域的嵌合蛋白。在例示性实施方案中，诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白是在n-末端包含pd-1的细胞外结构域并且在c-末端包含ox40l的细胞外结构域的嵌合蛋白。在另一个实施方案中，诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白是在n-末端包含vsig8的细胞外结构域并且在c-末端包含ox40l的细胞外结构域的嵌合蛋白。

在实施方案中，本发明涉及第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白的共同施用，所述第一嵌合蛋白例如诱导先天免疫应答，所述第二嵌合蛋白例如诱导适应性免疫应答。在此类实施方案中，第一嵌合蛋白可以在施用第二嵌合蛋白之前、同时或之后施用。例如，嵌合蛋白的施用可以间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔小于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周、或间隔4周。在例示性实施方案中，第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白间隔1周施用，或者在隔周施用(即，施用第一嵌合蛋白1周后施用第二嵌合蛋白，等等)。

本文公开的任何嵌合蛋白都可以是如本文所述的第一嵌合蛋白；本文公开的任何嵌合蛋白都可以是如本文所述的第二嵌合蛋白。

在实施方案中，包含tim3的细胞外结构域和ox40l的细胞外结构域的嵌合蛋白与包含cd172a(sirpα)的细胞外结构域和cd40l的细胞外结构域的嵌合蛋白共同施用。在实施方案中，包含tim3的细胞外结构域和ox40l的细胞外结构域的嵌合蛋白在包含cd172a(sirpα)的细胞外结构域和cd40l的细胞外结构域的嵌合蛋白之前施用。在实施方案中，包含tim3的细胞外结构域和ox40l的细胞外结构域的嵌合蛋白在包含cd172a(sirpα)的细胞外结构域和cd40l的细胞外结构域的嵌合蛋白之后施用。

在实施方案中，包含tim3的细胞外结构域和ox40l的细胞外结构域的嵌合蛋白与包含csf1r的细胞外结构域和cd40l的细胞外结构域的嵌合蛋白共同施用。在实施方案中，包含tim3的细胞外结构域和ox40l的细胞外结构域的嵌合蛋白在包含csf1r的细胞外结构域和cd40l的细胞外结构域的嵌合蛋白之前施用。在实施方案中，包含tim3的细胞外结构域和ox40l的细胞外结构域的嵌合蛋白在包含csf1r的细胞外结构域和cd40l的细胞外结构域的嵌合蛋白之后施用。在实施方案中，共同施用包括两次施用相同的嵌合蛋白，其中第一次施用和第二次施用在时间上分开。例如第一次施用和第二次施用可以间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔小于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周、或间隔4周。

在包括但不限于癌症应用的实施方案中，本发明涉及化学治疗剂作为另外的剂。化学治疗剂的实例包括但不限于烷化剂，诸如噻替哌和cytoxan环磷酰胺；烷基磺酸盐，诸如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三羟甲基三聚氰胺；多聚乙酰(例如，布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；卡莉他汀(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；念珠藻素(例如，念珠藻素1和念珠藻素8)；尾海兔素；多卡霉素(duocarmycin)(包括合成类似物kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、盐酸氮芥(mechlorethamine)、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥、三芥环磷酰胺、乌拉莫司汀；亚硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素，特别是加利车霉素γ和加利车霉素ω(参见例如，agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186(1994))；达内霉素，包括达内霉素a；二膦酸盐，诸如氯膦酸盐；拉霉素；以及新制癌菌素生色团和有关色蛋白烯二炔抗生素生色团)、阿克拉霉素、放射菌素、氨茴霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-l-正亮氨酸、adriamycin阿霉素(包括吗啉-阿霉素、氰基吗啉-阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)、表阿霉素、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素(诸如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、甲氨喋呤、蝶罗呤、曲美沙特；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他宾、氟尿苷；雄激素，诸如卡鲁睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内脂；抗肾上腺素，诸如氨鲁米特(minoglutethimide)、米托担、曲洛司坦；叶酸补充物，诸如亚叶酸(frolinicacid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；倍思塔布(bestrabucil)；比山群；依达曲沙(edatraxate)；地美可辛；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类化合物，诸如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝胺；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；psk多糖复合物(jhsnaturalproducts,eugene,oreg.)；雷佐生；根霉菌素；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢霉烯(例如，t-2毒素、疣孢菌素a(verracurina)、漆斑菌素a和蛇形毒素(anguidine))；尿烷；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托新(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如taxol紫杉醇(bristol-myerssquibboncology,princeton,n.j.)、无氢化蓖麻油的abraxane、紫杉醇的白蛋白工程化的纳米颗粒制剂(americanpharmaceuticalpartners,schaumberg,111.)和taxotere多烯紫杉醇(rhone-poulencrorer,antony,france)；苯丁酸氮芥；gemzar吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；navelbine长春瑞滨；盐酸米托恩醌；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(camptosar，cpt-11)(包括伊立替康与5-fu和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂rfs2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类维生素a，诸如视黄酸；卡培他滨；康普瑞汀；甲酰四氢叶酸(lv)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(folfox)；拉帕替尼(tykerb)；降低细胞增殖的pkc-α、raf、h-ras、egfr(例如厄洛替尼(tarceva))和vegf-a的抑制剂以及以上任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此外，治疗方法还可以包括使用放射。此外，治疗方法还可以包括使用光动力治疗。

在包括但不限于癌症应用的实施方案中，本发明的另外的剂是一种或多种免疫调节剂，其选自阻断、降低和/或抑制pd-1和pd-l1或pd-l2和/或pd-1与pd-l1或pd-l2的结合的剂(非限制性地例如以下中的一种或多种：纳武单抗(ono-4538/bms-936558、mdx1106、opdivo，bristolmyerssquibb)、派姆单抗(keytruda，merck)、mk-3475(merck)、bms936559(bristolmyerssquibb)、阿特珠单抗(tecentriq，genentech)、mpdl328oa(roche))，增加和/或刺激cd137(4-1bb)和/或cd137(4-1bb)与一种或多种4-1bb配体的结合的剂(非限制性地例如，urelumab(bms-663513和抗4-1bb抗体)，以及阻断、降低和/或抑制ctla-4的活性和/或ctla-4与ap2m1、cd80、cd86、shp-2和ppp2r5a中的一种或多种的结合和/或ox40与ox40l的结合的剂(非限制性地例如，gbr830(glenmark)、medi6469(medimmune))。

在包括但不限于感染性疾病应用的实施方案中，本发明涉及抗感染药物作为另外的剂。在实施方案中，抗感染药物是抗病毒剂，包括但不限于阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、安普那韦、阿扎那韦、西多福韦、地瑞那韦、地拉夫定、地达诺新、二十二烷醇、依法韦仑、埃替格韦、恩曲他滨、恩夫韦肽、依曲韦林、泛昔洛韦和膦甲酸。在实施方案中，抗感染药物是抗菌剂，包括但不限于，头孢菌素类抗生素(头孢氨苄、头孢呋辛、头孢羟氨苄、头孢唑啉、头孢噻吩、头孢克罗、头孢孟多、头孢西丁、头孢丙烯和头孢托罗)；氟喹诺酮类抗生素(环丙沙星、左氟沙星、氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星和诺氟沙星)；四环素类抗生素(四环素、米诺环素、土霉素和多西环素)；青霉素类抗生素(阿莫西林、氨苄西林、青霉素v、双氯青霉素、羧苄西林、万古霉素和甲氧西林)；单环类抗生素(氨曲南)；和碳青霉烯抗生素(厄他培南、多利培南、亚胺培南/西司他丁和美罗培南)。在实施方案中，抗感染药物包括抗疟疾剂(例如氯喹、奎宁、甲氟喹、伯氨喹、多西环素、蒿甲醚/苯芴醇、阿托夸酮/氯胍和磺胺多辛/乙胺嘧啶)、甲硝唑、替硝唑、伊维菌素、双羟萘酸噻嘧啶和阿苯达唑。

在包括但不限于自身免疫性疾病应用的实施方案中，另外的剂是免疫抑制剂。在实施方案中，免疫抑制剂是抗炎剂，诸如甾体抗炎剂或非甾体抗炎剂(nsaid)。类固醇，特别是肾上腺皮质类固醇及其合成类似物，是本领域熟知的。可用于本发明的皮质类固醇的实例包括但不限于羟基曲安西龙、α-甲基地塞米松、β-甲基倍他米松、二丙酸倍氯米松、苯甲酸倍他米松、二丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、戊酸氯倍他索、羟泼尼缩松、去羟米松、地塞米松、双乙酸双氟拉松、戊酸双氟可龙、氟雄诺龙(fluadrenolone)、氟氯缩松、特戊酸氟米松、氟轻松缩丙酮(fluosinoloneacetonide)、氟轻松乙酸酯、氟可丁酯(flucortinebutylesters)、氟可龙(fluocortolone)、乙酸氟泼尼定(fluprednidene/fluprednylidene)、氟氢缩松(flurandrenolone)、哈西奈德、乙酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、甲基泼尼松龙、曲安奈德、可的松、可托多松、肤轻松(flucetonide)、氟氢可的松、双乙酸双氟若松(difluorosonediacetate)、氟若卓龙缩丙酮(fluradrenoloneacetonide)、甲羟松、安西那飞、安西非特、倍他米松以及其平衡酯、氯泼尼松、可洛替龙(clocortelone)、可洛西龙(clescinolone)、双氯松、二氟泼尼酯、氟氯奈德(flucloronide)、氟尼缩松、氟米龙、氟培龙、氟泼尼龙、氢化可的松、甲泼尼松、帕拉米松、波尼松龙、泼尼松、二丙酸倍氯米松。可用于本发明的(nsaids)包括但不限于水杨酸、乙酰水杨酸、水杨酸甲酯、水杨酸乙二醇酯、水杨酰胺、苄基-2,5-二乙酰氧基苯甲酸、布洛芬、富林酸、萘普生、酮洛芬、依托芬那酯、保泰松和吲哚美辛。在实施方案中，免疫抑制剂可以是细胞抑制剂，诸如烷化剂、抗代谢物(例如，咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤)、细胞毒性抗生素、抗体(例如巴利昔单抗、达克珠单抗和莫罗单抗(muromonab))、抗免疫亲和素(例如环孢菌素、他克莫司、西罗莫司)、干扰素、阿片类药物、tnf结合蛋白、霉酚酸酯和小生物剂(例如，芬戈莫德、多球壳菌素(myriocin))。

在实施方案中，本文所述的嵌合蛋白(和/或另外的剂)包括经修饰的衍生物，即通过任何类型的分子与组合物的共价连接，使得共价连接不会妨碍组合物的活性。例如但不限于，衍生物包括通过尤其是糖基化、脂化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解性裂解、与细胞配体或其他蛋白质的连接等进行修饰的组合物。可以通过已知技术进行许多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于特定的化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素(turicamycin)的代谢合成等。另外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。在再其他实施方案中，本文所述的嵌合蛋白(和/或另外的剂)还包括细胞毒性剂，在例示性实施方案中，其包括毒素、化学治疗剂、放射性同位素以及引起细胞凋亡或细胞死亡的剂。此类剂可以与本文所述的组合物缀合。

因此本文所述的嵌合蛋白(和/或另外的剂)可以经翻译后修饰以添加效应子部分(诸如化学接头)、可检测部分(例如像荧光染料、酶、底物、生物发光物质、放射性物质和化学发光部分)、或功能性部分(例如像抗生蛋白链菌素、抗生物素蛋白、生物素、细胞毒素、细胞毒性剂和放射性物质)。

制剂

本文所述的嵌合蛋白(和/或另外的剂)可以具有足够的可以与无机酸或有机酸反应以形成药学上可接受的盐的碱性官能团，或者可以与无机碱或有机碱反应以形成药学上可接受的盐的羧基基团。药学上可接受的酸加成盐由药学上可接受的酸形成，如本领域已熟知的。此类盐包括例如以下中列出的药学上可接受的盐：journalofpharmaceuticalscience,66,2-19(1977)和thehandbookofpharmaceuticalsalts；properties,selection,anduse.p.h.stahl和c.g.wermuth(编),verlag,zurich(switzerland)2002，其特此以引用的方式整体并入。

在实施方案中，本文所述的组合物呈药学上可接受的盐的形式。

此外，本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)可以作为包含药学上可接受的载体或媒介物的组合物的组分向受试者施用。此类组合物可以任选地包含合适量的药学上可接受的赋形剂以便提供用于适当施用的形式。药物赋形剂可以是液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或者合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。药物赋形剂可以是例如盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、硅胶、尿素等等。此外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂以及着色剂。在一个实施方案中，当向受试者施用时，药学上可接受的赋形剂是无菌的。当静脉内施用本文所述的任何剂时，水是可用的赋形剂。盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可以用作液体赋形剂，特别是对于可注射的溶液而言。合适的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，本文所述的任何剂还可以包含少量的润湿剂或乳化剂或ph缓冲剂。

在实施方案中，将本文所述的组合物重悬于盐水缓冲液中(包括但不限于tbs、pbs等等)。

在实施方案中，嵌合蛋白可以通过与另一种剂缀合和/或融合来延长半衰期或以其他方式改善药效动力学和药代动力学特性。在实施方案中，嵌合蛋白可以与peg、xten(例如，作为rpeg)、聚唾液酸(polyxen)、白蛋白(例如，人血清白蛋白或has)、弹性蛋白样蛋白(elp)、pas、hap、glk、ctp、转铁蛋白等等中的一种或多种融合或缀合。在实施方案中，每种个体嵌合蛋白与biodrugs(2015)29:215–239中描述的一种或多种剂融合，所述文献的全部内容特此以引用的方式并入。

施用、给药和治疗方案

本发明包括呈各种制剂形式的所述嵌合蛋白(和/或另外的剂)。本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)可以采取以下形式：溶液、悬浮剂、乳剂、滴剂、片剂、丸剂、微丸剂、胶囊、含有液体的胶囊、散剂、缓释制剂、栓剂、乳剂、气雾剂、喷雾剂、悬浮剂或适合使用的任何其他形式。也可以使用编码蛋白质序列的dna或rna构建体。在一个实施方案中，所述组合物呈胶囊的形式(参见例如，美国专利号5,698,155)。合适的药物赋形剂的其他实例描述于以引用的方式并入本文的remington’spharmaceuticalsciences1447-1676(alfonsor.gennaro编,第19版.1995)中。

必要时，包含嵌合蛋白(和/或另外的剂)的制剂还可以包含增溶剂。另外，可以用本领域已知的合适的媒介物或递送装置来递送所述剂。本文概述的组合疗法可以在单个递送媒介物或递送装置中共同递送。用于施用的组合物可以任选地包含局部麻醉剂，例如像利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。

包含本发明的嵌合蛋白(和/或另外的剂)的制剂可以方便地以单位剂量的形式提供并且可以通过制药领域所熟知的任何方法进行制备。此类方法一般包括使治疗剂与由一种或多种附加成分所构成的载体缔合的步骤。通常，通过将治疗剂均一且紧密地与液态载体、细化的固态载体或两者缔合，然后在必要时将产品成型为所需制剂的剂量形式(例如，湿法或干法制粒、粉末共混等，然后使用本领域已知的常规方法压片)，来制备所述制剂。

在一个实施方案中，本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)根据常规程序作为适合于本文所述的施用模式的组合物进行配制。

施用路径包括例如：皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、口服、舌下、鼻内、脑内、阴道内、经皮、直肠、通过吸入、或局部，特别是施用到耳、鼻、眼、或皮肤。在实施方案中，所述施用通过口服或通过肠胃外注射实现。在大多数情况下，施用导致本文所述的任何剂释放到血液中。

本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)可以通过口服施用。此类嵌合蛋白(和/或另外的剂)也可以通过任何其他常规途径施用，例如通过静脉内输注或推注、通过经上皮或粘膜皮肤衬层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与另一种生物活性剂一起施用。施用可为全身性或局部的。不同递送系统为已知的，例如脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中的包囊化，并且可以用于施用。

在具体实施方案中，可能希望向需要治疗的区域局部施用。在一个实施方案中，例如在癌症的治疗中，嵌合蛋白(和/或另外的剂)在肿瘤微环境(例如，围绕肿瘤细胞和/或为肿瘤细胞提供营养的细胞、分子、细胞外基质和/或血管，其包括例如肿瘤脉管系统；肿瘤浸润淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(epc)；癌症相关成纤维细胞；周细胞；其他基质细胞；细胞外基质(ecm)的组分；树突细胞；抗原呈递细胞；t细胞；调节t细胞；巨噬细胞；嗜中性粒细胞；和位于肿瘤附近的其他免疫细胞)或淋巴结中进行施用并且/或者靶向肿瘤微环境或淋巴结。在实施方案中，例如在癌症的治疗中，嵌合蛋白(和/或另外的剂)在肿瘤内施用。

在各种实施方案中，本发明的嵌合蛋白允许双重效果，其提供的副作用比常规免疫疗法(例如，使用opdivo、keytruda、yervoy和tecentriq中的一种或多种的治疗)中所见的更少。例如，本发明的嵌合蛋白降低或预防通常观察到的影响各种组织和器官的免疫相关不良事件，所述组织和器官包括皮肤、胃肠道、肾脏、外周和中枢神经系统、肝脏、淋巴结、眼睛、胰腺和内分泌系统；所述免疫相关不良事件诸如垂体炎、结肠炎、肝炎、肺炎、皮疹和风湿性疾病。此外，本发明的局部施用，例如肿瘤内施用，避免了与常规免疫疗法(例如，使用opdivo、keytruda、yervoy和tecentriq中的一种或多种的治疗)一起使用时标准全身施用(例如静脉内输注)中所见的不良事件。

适用于肠胃外施用(例如，静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注)的剂型包括例如溶液、悬浮剂、分散体、乳剂等。它们也可以制造成无菌固体组合物(例如，冻干组合物)的形式，其可以在即将使用前溶解或悬浮在无菌可注射介质中。它们可以含有例如本领域已知的悬浮剂或分散剂。

本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)的剂量以及给药方案可以取决于各种参数，其包括但不限于所治疗的疾病、受试者的一般健康状况和施用医师的判断。可以在向有需要的受试者施用另外的剂之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时、或之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)施用本文所述的任何嵌合蛋白。在实施方案中，本文所述的任何嵌合蛋白和另外的剂的施用间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔小于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周、或间隔4周。

在实施方案中，本发明涉及诱导先天免疫应答的嵌合蛋白以及诱导适应性免疫应答的另一种嵌合蛋白的共同施用。在此类实施方案中，诱导先天免疫应答的嵌合蛋白可以在施用诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白之前、同时或之后施用。例如，嵌合蛋白的施用可以间隔1分钟、间隔10分钟、间隔30分钟、间隔小于1小时、间隔1小时、间隔1小时至2小时、间隔2小时至3小时、间隔3小时至4小时、间隔4小时至5小时、间隔5小时至6小时、间隔6小时至7小时、间隔7小时至8小时、间隔8小时至9小时、间隔9小时至10小时、间隔10小时至11小时、间隔11小时至12小时、间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔1周、间隔2周、间隔3周、或间隔4周。在例示性实施方案中，诱导先天免疫应答的嵌合蛋白和诱导适应性应答的嵌合蛋白间隔1周施用，或者在隔周施用(即，施用诱导先天免疫应答的嵌合蛋白1周后施用诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白，等等)。

本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)的剂量可以取决于若干种因素，其包括病状的严重性，病状是否被治疗或预防以及待治疗的受试者的年龄、体重和健康。另外，关于具体受试者的药物基因组(基因型对治疗剂的药代动力学、药效动力学或功效的曲线的作用)信息可以影响所使用的剂量。此外，精确的个体剂量可以根据多种因素稍微调整，所述因素包括正在施用的剂的特定组合、施用的时间、施用的路径、制剂的性质、排泄的速率、所治疗的特定疾病、病症的严重性以及病症的解剖学位置。可以预期一些剂量的变化。

对于通过肠胃外注射施用本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)，剂量可以是每天约0.1mg至约250mg、每天约1mg至约20mg、或每天约3mg至约5mg。一般来讲，当通过口服或肠胃外施用时，本文所述的任何剂的剂量可以是每天约0.1mg至约1500mg、或每天约0.5mg至约10mg、或每天约0.5mg至约5mg、或每天约200至约1,200mg(例如，每天约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1,000mg、约1,100mg、约1,200mg)。

在实施方案中，本文所述的嵌合蛋白(和/或另外的剂)的施用是通过肠胃外注射，其剂量为每次治疗约0.1mg至约1500mg、或每次治疗约0.5mg至约10mg、或每次治疗约0.5mg至约5mg、或每次治疗约200至约1,200mg(例如，每次治疗约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1,000mg、约1,100mg、约1,200mg)。

在实施方案中，嵌合蛋白(和/或另外的剂)的合适剂量在约0.01mg/kg至约100mg/kg体重、或约0.01mg/kg至约10mg/kg受试者体重的范围内，例如，约0.01mg/kg、约0.02mg/kg、约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.08mg/kg、约0.09mg/kg、约0.1mg/kg、约0.2mg/kg、约0.3mg/kg、约0.4mg/kg、约0.5mg/kg、约0.6mg/kg、约0.7mg/kg、约0.8mg/kg、约0.9mg/kg、约1mg/kg、约1.1mg/kg、约1.2mg/kg、约1.3mg/kg、约1.4mg/kg、约1.5mg/kg、约1.6mg/kg、约1.7mg/kg、约1.8mg/kg、1.9mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg体重，包括它们之间的所有值和范围。

在另一个实施方案中，递送可以是在囊泡中，具体地是在脂质体中(参见，langer,1990,science249:1527-1533；treat等,inliposomesintherapyofinfectiousdiseaseandcancer,lopez-berestein和fidler(编),liss,newyork,第353-365页(1989)。

本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)可以通过控释或缓释方式或者通过本领域普通技术人员熟知的递送装置进行施用。实例包括但不限于美国专利号：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556；和5,733,556中所述的那些；所述专利中各自以引用的方式并入本文。此类剂型可以适用于使用例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、凝胶、可渗透性膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球体或其组合来提供一种或多种活性成分的控释或缓释，从而以不同比例提供所需的释放曲线。活性成分的控释或缓释可以通过各种条件来刺激，所述条件包括但不限于ph的变化、温度的变化、通过适当波长的光的刺激、酶的浓度或利用度、水的浓度或利用度或者其他生理学条件或化合物。

在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参见medicalapplicationsofcontrolledrelease,langer和wise(编),crcpres.,bocaraton,florida(1974)；controlleddrugbioavailability,drugproductdesignandperformance,smolen和ball(编),wiley,newyork(1984)；ranger和peppas,1983,j.macromol.sci.rev.macromol.chem.23:61；还参见levy等,1985,science228:190；during等,1989,ann.neurol.25:351；howard等,1989,j.neurosurg.71:105)。

在另一个实施方案中，控释系统可以放置在待治疗的靶标区域附近，由此仅需要全身剂量的一部分(参见例如，goodson,在medicalapplicationsofcontrolledrelease中,同上,第2卷,第115-138页(1984))。可以使用在综述langer,1990,science249:1527-1533)中讨论的其他控释系统。

本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)的施用可以独立地为每天一至四次，或每月一至四次，或每年一至六次，或者每两年、三年、四年或五年一次。施用可以持续一天或一个月、两个月、三个月、六个月、一年、两年、三年的持续时间，并且可以甚至持续受试者的一生。

利用本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)的给药方案可以根据多种因素进行选择，所述因素包括受试者的类型、种族、年龄、体重、性别以及医学病状；待治疗的病状的严重性；施用的路径；受试者的肾功能或肝功能；个体的药物基因组组成；以及所采用的本发明的特定化合物。本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)可以单一日剂量进行施用，或者总日剂量可以每日两次、三次或四次的分剂量进行施用。此外，本文所述的任何嵌合蛋白(和/或另外的剂)可以贯穿剂量方案连续地而不是间歇地进行施用。

细胞和核酸

在实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码本文所述的嵌合蛋白的核酸。在实施方案中，表达载体包含dna或rna。在实施方案中，表达载体是哺乳动物表达载体。

原核载体和真核载体均可以用于表达嵌合蛋白。原核载体包括基于大肠杆菌序列的构建体(参见例如，makrides,microbiolrev1996,60:512-538)。可以用于在大肠杆菌中表达的调节区的非限制性实例包括lac、trp、lpp、phoa、reca、tac、t3、t7和λpl。原核表达载体的非限制性实例可以包括λgt载体系列诸如如λgt11(huynh等,在“dnacloningtechniques,vol.i:apracticalapproach,”中1984,(d.glover编),第49-78页,irlpress,oxford)，以及pet载体系列(studier等,methodsenzymol1990,185:60-89)。然而，原核宿主-载体体系不能对哺乳动物细胞进行大量的翻译后加工。因此，真核宿主-载体体系可能特别有用。多种调节区可以用于在哺乳动物宿主细胞中表达嵌合蛋白。例如，可以使用sv40早期和晚期启动子、巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子和劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(rsv-ltr)启动子。可以用于哺乳动物细胞的诱导型启动子包括但不限于与金属硫蛋白ii基因、小鼠乳腺肿瘤病毒糖皮质激素反应性长末端重复序列(mmtv-ltr)、β-干扰素基因和hsp70基因相关的启动子(参见，williams等,cancerres1989,49:2735-42；和taylor等,molcellbiol1990,10:165-75)。热休克启动子或应激启动子也可能有利于驱动重组宿主细胞中嵌合蛋白的表达。

在实施方案中，本发明的表达载体包含编码嵌合蛋白(和/或另外的剂)的核酸或其互补物，其可操作地连接到在哺乳动物细胞中是功能性的表达控制区或其互补物。表达控制区能够驱动可操作地连接的阻断剂和/或刺激剂编码核酸的表达，使得在经所述表达载体转化的人细胞中产生所述阻断剂和/或刺激剂。

表达控制区是影响可操作地连接的核酸的表达的调节聚核苷酸(在本文中有时称为元件)，诸如启动子和增强子。本发明的表达载体的表达控制区能够使可操作地连接的编码核酸在人细胞中表达。在一个实施方案中，细胞是肿瘤细胞。在另一个实施方案中，细胞是非肿瘤细胞。在一个实施方案中，表达控制区使得可操作地连接的核酸的表达可调节。信号(有时称为刺激物)可以增加或减少可操作地连接到这种表达控制区的核酸的表达。响应于信号而增加表达的此类表达控制区通常称为诱导性。响应于信号而减少表达的此类表达控制区通常称为阻遏性。通常，由此类元件所赋予的增加或减少的量与所存在信号的量成比例；信号量越大，表达的增加或减少越大。

在一个实施方案中，本发明考虑使用能够响应于提示瞬时实现高水平表达的诱导型启动子。例如，当与肿瘤细胞接近时，通过将转化细胞暴露于适当的提示，诱导经包含这种表达控制序列的嵌合蛋白(和/或另外的剂)的表达载体转化的细胞，以瞬时产生高水平的剂。例示性诱导型表达控制区包括包含用提示(诸如小分子化合物)刺激的诱导型启动子的诱导型表达控制区。具体的实例可以见于，例如，美国专利号5,989,910、5,935,934、6,015,709和6,004,941中，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。

表达控制区和基因座控制区包括全长启动子序列(诸如天然启动子和增强子元件)，以及保留全部或部分全长或非变异型功能的子序列或聚核苷酸变体。如本文所用，术语“功能性”和其语法变体当在提及核酸序列、子序列或片段的情况下使用时，意指所述序列具有天然核酸序列(例如非变异型或未修饰序列)的一种或多种功能。

如本文所用，“可操作的连接”是指所述组分的实体并置关系允许其以预定方式起作用。在表达控制元件与核酸可操作地连接的实例中，所述关系使得控制元件调节所述核酸的表达。通常，调节转录的表达控制区并置于所转录核酸的5'端附近(即“上游”)。表达控制区还可以位于所转录序列的3'端(即“下游”)或在转录物内(例如在内含子中)。表达控制元件可以位于离所转录序列一定距离处(例如离所述核酸100至500、500至1000、2000至5000或更多个核苷酸)。表达控制元件的特定实例是启动子，其通常位于所转录序列的5'。表达控制元件的另一个实例是增强子，其可以位于所转录序列的5'或3'，或在所转录序列的内部。

在人细胞中具功能性的表达体系在本领域中是熟知的，并且包括病毒体系。一般来讲，在人细胞中具功能性的启动子是能够结合哺乳动物rna聚合酶并起始下游(3')编码序列转录成mrna的任何dna序列。启动子将具有转录起始区，其通常置于编码序列5'端附近，并且tata盒通常位于转录起始位点上游25-30个碱基对处。认为tata盒引导rna聚合酶ii在正确位点开始rna合成。启动子通常还含有上游启动子元件(增强子元件)，其通常位于tata盒上游100至200个碱基对内。上游启动子元件决定转录起始速率并且可以任何取向起作用。来自哺乳动物病毒基因的启动子特别适合用作启动子，因为病毒基因通常是高表达的并且具有广泛的宿主范围。实例包括sv40早期启动子、小鼠哺乳动物肿瘤病毒ltr启动子、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病毒启动子和cmv启动子。

通常，由哺乳动物细胞识别的转录终止和聚腺苷酸化序列是位于转录终止密码子3'的调节区，并且因此连同启动子元件一起侧接编码序列。成熟mrna的3'末端由位点特异性翻译后裂解和聚腺苷酸化形成。转录终止子和聚腺苷酸化信号的实例包括来源于sv40的那些。表达构建体中还可以包括内含子。

存在多种可用于将核酸引入活细胞中的技术。适用于在体外将核酸转移至哺乳动物细胞中的技术包括使用脂质体、电穿孔、微注射、细胞融合、基于聚合物的体系、deae-葡聚糖、病毒转导、磷酸钙沉淀法等。对于体内基因转移，也可以使用多种技术和试剂，包括脂质体；基于天然聚合物的递送媒介物，诸如壳聚糖和明胶；病毒载体也适用于体内转导。在一些情况下，希望提供靶向剂，诸如对于肿瘤细胞表面膜蛋白具有特异性的抗体或配体。在采用脂质体的情况下，结合与内吞作用相关联的细胞表面膜蛋白的蛋白质可以用于靶向和/或促进摄取，例如亲近特定细胞类型的衣壳蛋白或其片段、在循环中进行内化的蛋白质的抗体、靶向细胞内定位并增强细胞内半衰期的蛋白质。例如，受体介导的内吞作用的技术描述于，例如，wu等,j.biol.chem.262,4429-4432(1987)；和wagner等,proc.natl.acad.sci.usa87,3410-3414(1990)。

适当时，还可以采用基因递送剂，例如像整合序列。许多整合序列在本领域中是已知的(参见例如，nunes-duby等,nucleicacidsres.26:391-406,1998；sadwoski,j.bacteriol.,165:341-357,1986；bestor,cell,122(3):322-325,2005；plasterk等,tig15:326-332,1999；kootstra等,ann.rev.pharm.toxicol.,43:413-439,2003)。这些包括重组酶和转座酶。实例包括cre(sternberg和hamilton,j.mol.biol.,150:467-486,1981)、λ(lambda)(nash,nature,247,543-545,1974)、flp(broach,等,cell,29:227-234,1982)、r(matsuzaki,等,j.bacteriology,172:610-618,1990)、cpc31(参见例如，groth等,j.mol.biol.335:667-678,2004)、mariner家族的转座子睡美人(sleepingbeauty)(plasterk等,同上)以及用于整合病毒(诸如aav、逆转录病毒和抗病毒)的部件，其具有提供病毒整合的部件，诸如逆转录病毒或慢病毒的ltr序列和aav的itr序列(kootstra等,ann.rev.pharm.toxicol.,43:413-439,2003)。此外，可以使用直接和靶向遗传整合策略来插入编码嵌合融合蛋白的核酸序列，所述策略包括crispr/cas9、锌指、talen和大范围核酸酶基因编辑技术。

在一方面，本发明提供用于表达嵌合蛋白(和/或另外的剂)的表达载体，其为病毒载体。许多可用于基因疗法的病毒载体是已知的(参见例如，lundstrom,trendsbiotechnol.,21:117,122,2003。例示性病毒载体包括选自抗病毒(lv)、逆转录病毒(rv)、腺病毒(av)、腺相关病毒(aav)和α病毒的载体，但是也可以使用其他病毒载体。对于体内用途，适合使用不整合到宿主基因组中的病毒载体，诸如α病毒和腺病毒。α病毒的例示性类型包括辛德毕斯病毒(sindbisvirus)、委内瑞拉马脑炎(venezuelanequineencephalitis；vee)病毒和塞姆利基森林病毒(semlikiforestvirus；sfv)。对于体外使用，整合到宿主基因组中的病毒载体是合适的，诸如逆转录病毒、aav和抗病毒。在一个实施方案中，本发明提供体内转导人细胞的方法，其包括在体内使实体肿瘤与本发明的病毒载体接触。

在实施方案中，本发明提供一种宿主细胞，其包含表达载体，所述表达载体包含本文所述的嵌合蛋白。

可以将表达载体引入宿主细胞中，用于产生本发明的嵌合蛋白。例如，可以在体外培养细胞或对细胞进行遗传工程化。可用的哺乳动物宿主细胞包括但不限于衍生自人、猴和啮齿动物的细胞(参见例如，kriegler在“genetransferandexpression:alaboratorymanual,”中1990,newyork,freeman&co.)。这些包括由sv40转化的猴肾细胞系(例如，cos-7、atcccrl1651)；人胚胎肾细胞系(例如，293、293-ebna或用于悬浮培养生长的亚克隆的293细胞，graham等,jgenvirol1977,36:59)；幼仓鼠肾细胞(例如，bhk、atccccl10)；中国仓鼠卵巢细胞-dhfr(例如，cho，urlaub和chasin,procnatlacadsciusa1980,77:4216)；dg44cho细胞、cho-k1细胞、小鼠塞托利细胞(mather,biolreprod1980,23:243-251)；小鼠成纤维细胞(例如，nih-3t3)、猴肾细胞(例如，cv1atccccl70)；非洲绿猴肾细胞(例如，vero-76、atcccrl-1587)；人宫颈癌细胞(例如，hela、atccccl2)；犬肾细胞(例如，mdck、atccccl34)；布法罗大鼠肝细胞(例如，brl3a、atcccrl1442)；人肺细胞(例如，w138、atccccl75)；人肝细胞(例如，hepg2、hb8065)；和小鼠乳腺肿瘤细胞(例如，mmt060562、atccccl51)。用于表达本文所述的嵌合蛋白的例示性癌细胞类型包括小鼠成纤维细胞系nih3t3、小鼠lewis肺癌细胞系llc、小鼠肥大细胞瘤细胞系p815、小鼠淋巴瘤细胞系el4及其卵清蛋白转染子e.g7、小鼠黑色素瘤细胞系b16f10、小鼠纤维肉瘤细胞系mc57以及人小细胞肺癌细胞系sclc#2和sclc#7。

宿主细胞可以从正常受试者或受影响的受试者(包括健康人、癌症患者以及患有感染性疾病的患者)、私人实验室存储物、诸如美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的公共培养物收集物、或商业供应商获得。

可以用于体外、离体和/或体内产生本发明的嵌合蛋白的细胞包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞诸如t淋巴细胞、b淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞(例如，从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得)。细胞类型的选择取决于所治疗或预防的肿瘤或感染性疾病的类型，并且可以由本领域技术人员确定。

含fc的大分子(诸如单克隆抗体)的产生和纯化已成为标准化过程，其中产物之间具有微小修改。例如，许多含fc的大分子由人胚胎肾(hek)细胞(或其变体)或者中国仓鼠卵巢(cho)细胞(或其变体)产生，或者在某些情况下通过细菌或合成方法产生。产生之后，由hek或cho细胞分泌的含fc的大分子通过与蛋白a柱结合进行纯化，并且随后使用各种方法‘抛光’。一般来讲，纯化的含fc的大分子以液体形式储存一段时间、冷冻较长时间或在一些情况下冻干。在实施方案中，与传统的含fc的大分子相比，本文考虑的嵌合蛋白的产生可以具有独特的特征。在某些实例中，可以使用特定的色谱树脂或使用不依赖于蛋白a捕获的色谱方法来纯化嵌合蛋白。在实施方案中，嵌合蛋白可以寡聚状态或多种寡聚状态进行纯化，并使用特定方法富集特定的寡聚状态。不受理论束缚，这些方法可以包括用特定缓冲液处理，其包括指定的盐浓度、ph和添加剂组成。在其他实例中，此类方法可以包括相对于一种寡聚状态有利于另一种寡聚状态的处理。可以使用本领域指定的方法另外‘抛光'本文获得的嵌合蛋白。在实施方案中，嵌合蛋白是高度稳定的并且能够耐受广泛的ph暴露(在ph3-12之间)，能够耐受大量的冻/融应力(大于3个冷冻/解冻循环)并且能够耐受在高温下的延长温育(在40摄氏度下长于2周)。在实施方案中，示出嵌合蛋白在此类应力条件下保持完整，没有降解、脱酰胺等迹象。

受试者和/或动物

在实施方案中，受试者和/或动物是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、绵羊或非人灵长类动物，诸如猴、黑猩猩或狒狒。在实施方案中，受试者和/或动物是非哺乳动物，例如像斑马鱼。在实施方案中，受试者和/或动物可以包含荧光标记的细胞(例如用gfp)。在实施方案中，受试者和/或动物是包含荧光细胞的转基因动物。

在实施方案中，受试者和/或动物是人。在实施方案中，人是幼儿。在实施方案中，人是成人。在实施方案中，人是老年人。在实施方案中，人可以称为患者。

在某些实施方案中，人的年龄范围为约0个月至约6个月、约6至约12个月、约6至约18个月、约18至约36个月、约1至约5岁、约5至约10岁、约10至约15岁、约15至约20岁、约20至约25岁、约25至约30岁、约30至约35岁、约35至约40岁、约40至约45岁、约45至约50岁、约50至约55岁、约55至约60岁、约60至约65岁、约65至约70岁、约70至约75岁、约75至约80岁、约80至约85岁、约85至约90岁、约90至约95岁或约95至约100岁。

在实施方案中，受试者是非人动物，并且因此本发明涉及兽医用途。在一个具体实施方案中，非人动物是家庭宠物。在另一个具体实施方案中，非人动物是家畜动物。

试剂盒

本发明提供了可以简化本文所述的任何剂的施用的试剂盒。本发明的例示性试剂盒包含单位剂型的本文所述的任何组合物。在一个实施方案中，单位剂型是容器，诸如预填充注射器，其可以是无菌的，含有本文所述的任何剂和药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或媒介物。试剂盒可以进一步包含指示本文所述的任何剂的使用的标签或印刷说明书。试剂盒还可以包含开睑器、局部麻醉剂和用于施用位置的清洁剂。试剂盒还可以进一步包含一种或多种本文所述的另外的剂。在一个实施方案中，试剂盒包含容器，其含有有效量的本发明的组合物和有效量的另一种组合物，诸如本文所述的那些组合物。

本文所述的任何方面或实施方案都可以与如本文所公开的任何其他方面或实施方案结合。

本发明将在以下实施例中进一步描述，这些实施例不限制权利要求书中所述的本发明范围。

实施例

实施例1：单体人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的计算机模拟预测结构

产生具有792个氨基酸残基的单体人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白(sl-172154)的计算机模拟结构预测，其p值为1.14x10^-21。预测单体蛋白质的分子量为88.1kda。嵌合蛋白的结构在图2中提供。

具体地，结构预测显示48个位置(6％)可能是无序的。嵌合蛋白的整个序列的二级结构预测显示所述蛋白质具有2％α-螺旋(h)、50％β-折叠(e)和47％卷曲(c)的组成。还计算了嵌合蛋白的绝对全局质量的gdt(全局距离测试)和ugdt(未标准化的gdt)，以得到429(54)的总ugdt(gdt)。蛋白质残基的溶剂可及性的三态预测是33％暴露(e)、48％中间(m)和17％埋入(b)。

图3示出了hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白刺激活性肿瘤破坏的作用机制的示意图。然后嵌合蛋白可以“悬挂”在肿瘤细胞表面，并且然后嵌合蛋白的cd40l部分可以与t细胞表面上表达的cd40结合。这将导致用共刺激cd40l信号替换抑制性hcd172a(sirpα)信号，以增强t细胞的抗肿瘤活性。

许多肿瘤类型表达高水平的膜结合cd47，其可以结合巨噬细胞表面上的cd172a(sirpα)，由此诱导抑制肿瘤细胞的巨噬细胞吞噬作用或胞吞作用的‘不要吃我’信号。不希望受理论束缚，据信cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白(sl-172154)结合表达cd47的肿瘤，从而阻断其与巨噬细胞的相互作用，由此允许巨噬细胞成熟和胞吞作用介导的肿瘤细胞的破坏。这继而导致增强的肿瘤-抗原释放和交叉呈递回到其他巨噬细胞。有趣的是，抗原的交叉呈递同时发生，并且发生在和巨噬细胞/apc结合的cd40与来自嵌合蛋白的cd40l之间的共刺激相同的肿瘤微环境中。因此，cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白不仅刺激活性肿瘤破坏，还刺激肿瘤抗原的免疫识别，这对于设计能够预防复发的记忆应答是必需的(图3)。

实施例2：人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的表征

构建人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白。通过针对嵌合蛋白的每个个体结构域(即通过抗cd172a(sirpα)、抗fc和抗cd40l抗体)进行蛋白质印迹分析，来表征嵌合蛋白。

蛋白质印迹指示在非还原泳道中存在占优势的二聚体条带(图4，每个印迹中的泳道2)，其在还原剂β-巯基乙醇的存在下被还原为糖基化的单体条带(图4，每个印迹中的泳道3)。如图4每个印迹中的泳道4所示，在还原剂(β-巯基乙醇)和内切糖苷酶(pngase)两者的存在下，嵌合蛋白作为预测分子量为88.1kda的单体分离。

实施例3：使用elisa表征cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域的结合亲和力

开发功能性elisa(酶联免疫吸附测定)测定以表明人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域与其各自的结合配偶体的结合亲和力。通过捕获到平板结合的重组人cd47蛋白并通过hrp缀合的抗人igg抗体检测来检测hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的cd172a(sirpα)结构域。使用重组hcd172a(sirpα)-fc蛋白产生标准曲线。通过捕获到平板结合的人igg并通过hrp缀合的抗人igg抗体(hig)检测来检测hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的fc部分。使用重组hig蛋白产生标准曲线。通过捕获到平板结合的重组人cd40蛋白并通过cd40l特异性抗体检测来检测hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的cd40l结构域。使用重组hcd40l蛋白产生标准曲线。

如图6所示，hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域以浓度依赖性方式和高亲和力有效地与它们各自的结合配偶体相互作用。此外，如图6的右图所示，hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白能够同时与cd40和cd47两者结合。然而，观察到在elisa测定中，使用中心fc区检测嵌合蛋白倾向于低估样品中的实际蛋白质含量。因此，与此测定中的标准物相比，检测到低水平的hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白。基于此数据，hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白计算的cd47的ec50值为1.39nm，mcd172a(sirpα)的ec50值为1.12nm，并且同期的cd47和cd40的ec50值为18.1nm。

还利用离体细胞结合测定来评估cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域与其各自的结合配偶体结合的能力。此处，将细胞系工程化以过表达人cd47(即hela/hcd47)，并将细胞系工程化以过表达鼠cd40(即chok1/mcd40)。

将人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白或鼠cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与亲本和过表达细胞系一起温育2小时。将细胞收集，洗涤并用抗体染色，用于通过流式细胞术检测嵌合蛋白结合。如图7a和图7b所示)，并且如所预期的，嵌合蛋白不显著结合亲本细胞系。然而，hcd172a(sirpα)-fc-cd40l以浓度依赖性方式结合hela/hcd47工程化细胞系；基于此数据，计算的ec50值为21.51nm(图7a)。类似地，mcd172a(sirpα)-fc-cd40l以浓度依赖性方式结合chok1/mcd40工程化细胞系；基于此数据，计算的ec50值为20.2nm。

实施例4：通过表面等离子体共振(spr)表征cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的结合亲和力

使用bioradproteonxpr360系统通过表面等离子体共振(spr)测量hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域的结合亲和力。具体地，确定嵌合蛋白对于cd47、fcγr1a和fcrn的亲和力，并与重组对照蛋白进行比较，并且结果分别在图8a至图8c中示出。采集的动力学数据总结在图8d所示的表中。

如图8a所示，cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与cd47结合并具有高亲和力。cd172a(sirpα)-fc-ox40l与人cd47的‘结合速率’很快，然而‘解离速率’低得多，实际上比重组cd47-fc的‘解离速率’低～40倍，这指示cd172a(sirpα)-fc-ox40l以长靶上停留时间快速且稳定地结合。cd172a(sirpα)-fc-ox40l与人cd47结合的kd计算为3.59nm。亲和力测量表明与嵌合蛋白的高亲和力结合，除了针对具有效应子功能的fc受体之外(图8b和图8c)。重要的是，嵌合蛋白的解离速率比基准对照蛋白的解离速率慢得多；嵌合蛋白与cd47的解离为cd172a(sirpα)-fc的2.78倍长。

另外，通过spr评估鼠cd172a(sirpα)-fc-cd40l与mcd40的结合亲和力。确定嵌合蛋白以0.756nm的kd紧密结合mcd40，如图8e所示。

实施例5：cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的功能性测定

进行功能性测定、基于elisa的阻断测定和巨噬细胞吞噬作用测定，来表明人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的功能活性。进行基于elisa的阻断测定以表明，hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白与过表达人cd47的细胞(hela/hcd47和jurkat/内源-cd47)的结合可以通过将细胞与人cd47阻断抗体一起预温育来破坏。用表达人cd47的质粒稳定转染的hela细胞与单独的增加浓度的人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白一起温育，或者在hela/hcd47细胞与人cd47阻断抗体一起预温育之后与增加浓度的人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白一起温育(图9a，中图)。hela/hcd47以浓度依赖性方式结合hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白(图9a，中图，上部曲线)。当用cd47阻断抗体预处理hela/hcd47细胞时，所述结合被阻断(图9a，中图，下部曲线)。

内源性表达高水平人cd47的jurkat细胞以浓度依赖性方式结合hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白(图9a，右图，上部曲线)。类似地，当用相同的cd47阻断抗体预处理jurkat细胞时，此结合被阻断(图9a，右图，下部曲线)。

总之，这些数据指示，hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的cd172a(sirpα)组分的结合对过表达和内源性cd47两者都具有高度特异性，因为在cd47通路被阻断时，阻碍了hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的结合。

在巨噬细胞吞噬作用测定中，在存在或不存在hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的情况下，将原代衍生的人巨噬细胞与表达cd47的细胞一起温育，以便评估对在巨噬细胞结合的cd172a(sirpα)能够自由地与cd47相互作用时产生的‘不要吃我’信号的抑制。示出巨噬细胞吞噬作用测定的基本原理的示意图在图9b中示出。分离原代人单核细胞并在体外分化成巨噬细胞。作为cd47的供体，悬浮细胞系jurkat被鉴定为表达高水平的膜结合cd47。在存在或不存在cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的情况下，将巨噬细胞和jurkat细胞与不同的细胞追踪染料一起温育，并共培养(图9b)。在不存在嵌合蛋白的情况下，jurkat-cd47与巨噬细胞-cd172a(sirpα)相互作用，从而阻断胞吞作用，导致细胞的基线水平对于两种细胞追踪染料是双阳性的(图9c，左条)。在将嵌合蛋白加入jurkat/巨噬细胞共培养物中时，检测到双阳性细胞水平增加，其以浓度依赖性方式增加(图9c，右侧三条)。巨噬细胞吞噬作用测定的结果指示cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白能够促进cd47+细胞的巨噬细胞胞吞作用。

实施例6：鼠cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的表征

通过针对嵌合蛋白的每个个体结构域(即通过抗cd172a(sirpα)、抗fc和抗cd40l抗体)进行蛋白质印迹分析，来表征鼠cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白。如图10a所示，mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的所有三个结构域在非还原(泳道2)、还原(泳道3)和还原+pngase处理(泳道4)下检测。嵌合蛋白的还原的糖基化形式以大约110kda的预期分子量迁移。任何抗体都未检测到还原的去糖基化形式，这可能是由于其对于被糖基化的蛋白质的依赖性。

进行elisa测定以表明mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域与其预测的结合配偶体(即，cd47或cd40)相互作用的结合亲和力。具体地，通过捕获到平板结合的重组cd47蛋白并通过hrp缀合的抗fc抗体检测来检测mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的cd172a(sirpα)结构域(图10b，左图，方形符号)。使用重组mcd172a(sirpα)-mfc产生标准曲线(图10b，左图，圆形符号)。具体地，通过捕获到平板结合的重组鼠cd40蛋白并通过cd40l特异性抗体检测来检测嵌合蛋白的cd40l结构域(图10b，右图，方形符号)。使用重组mcd40l产生标准曲线(图10b，右图，圆形符号)。如图10b所示，mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的不同结构域以高亲和力有效地与它们各自的结合配偶体相互作用。

使用ct26小鼠结肠直肠肿瘤模型分析mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的体内抗肿瘤活性。在一组实验中，使balb/c小鼠在第0天接种ct26肿瘤细胞，并且/或者在第30天第二次接种ct26肿瘤细胞进行再次攻击。肿瘤生长4天之后，当肿瘤直径达到4-5mm时，用抗cd47、抗cd40、两种抗体的组合或用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理小鼠。

评估每个处理组的肿瘤生长，如图11a所示。具体地，未处理的小鼠很快发生肿瘤。用抗cd47、抗cd40或这两种抗体的组合的处理似乎稍微延迟了肿瘤的发生。相比之下，用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理小鼠显著地预防和/或延迟了肿瘤的发生。重要的是，cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白在再次攻击(这表明癌症复发)时能够有效地杀死肿瘤细胞和/或减少肿瘤生长。因此，cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白似乎产生能够预防复发的记忆应答。

还评估了在肿瘤接种之后的45天内小鼠的总存活百分比。所有未处理的小鼠在肿瘤接种后21天内死亡。大多数用单一抗体处理的小鼠在第30天左右死亡。接受抗cd40抗体和抗cd47抗体的组合的小鼠在第50天表现出仅约30％的存活率。显著地，在肿瘤接种之后50天，用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理的所有小鼠均存活，如图11b所示。

如图11c所示，用抗cd40或抗cd47的单一疗法导致大多数小鼠的肿瘤生长速率适度延长，其中一只动物完全排斥肿瘤(抗cd40组，在处理的12只小鼠中)。当两种抗体组合施用时，存在协同效应，其中长期随访组中6只小鼠中的2只具有完全肿瘤排斥。对于用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l处理的小鼠，与抗体组合相比，在150和300μg剂量水平两者中存在显著优异的活性，其中在150相对于300μg组中具有略微改善的排斥率。与抗体组合处理相比，使用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的处理观察到存在80％的完全排斥率。

还通过在肿瘤接种后第13天分析脾细胞、淋巴结细胞和肿瘤浸润淋巴细胞进行免疫表型分析。如图12a、图12c和图12d所示，与对照组或组合抗体处理组(抗cd40和抗cd47)相比，用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理的小鼠在脾脏、外周淋巴结和肿瘤中表现出更高的总cd4+t细胞百分比。在脾脏内，这种增加主要包括cd4+cd25-t细胞中的增加，这与涉及非调节t细胞的活化的概念一致(图12b)。用mcd172a(sirpα)-fc-cd40l处理的小鼠在外周淋巴结中还存在cd8+t细胞的增加，但在脾脏或肿瘤中未观察到这种增加(图12a、图12c和图12d)。

还分析了mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白刺激cd8+t细胞识别肿瘤抗原的能力。具体地，图12e示出了用于确定识别ct26肿瘤天然表达的ah1肿瘤抗原的cd8+t细胞的分数的四聚体染色分析。在脾脏和肿瘤浸润淋巴细胞(til)中，与未处理的小鼠相比，用嵌合蛋白处理的小鼠中发现更高比例的识别ah1肿瘤抗原的cd8+t细胞。

cd40活化的指标之一是上调il-15受体α的细胞的比例。在处理组中，在用150μg剂量的mcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理的小鼠中存在显著增加，但在抗cd40/cd47处理组中没有增加(图12f)。

总之，这些数据表明mcd172a(sirpα)-fc-cd40l在消除已建立的肿瘤以及产生能够在再次攻击时防止肿瘤生长的记忆免疫应答方面是有效的。此外，当以最佳剂量施用时，mcd172a(sirpα)-fc-cd40l优于基准抗体组合(抗cd47+抗cd40)。值得注意的是，150μg剂量的mcd172a(sirpα)-fc-cd40l似乎比300μg剂量更有效并且具有更好的限定免疫特征。

上述数据尤其清楚地表明了mcd172a(sirpα)-fc-cd40l在体内的功能活性，至少在治疗癌症方面的功能活性。

实施例7：体内人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白的表征

然后测试人cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白不与红细胞结合并由此引起溶血的能力。在此，使hcd172a(sirpα)-fc-cd40l与食蟹猴红细胞(rbc；图13左上图)接触。在两只猴中未检测到rbc计数的显著变化；因此，嵌合蛋白在体内不会引起食蟹猴rbc的显著裂解。hcd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白同样似乎不会显著影响指标溶血(参见图13，其余图)。用hcd172a(sirpα)-fc-cd40l处理之后，未观察到rbc裂解或血小板消耗的证据。每天多次进行总安全性评估，并且未观察到另外的安全信号。这些数据指示hcd172a(sirpα)-fc-cd40l不会引起rbc的溶血作为不希望的副作用。

实施例8：使用多种嵌合蛋白的组合处理的表征

在本实施例中，确定包括嵌合蛋白组合的处理的抗肿瘤效力和/或协同效应。具体地，使用结肠直肠癌(mc38或ct26)或黑色素瘤(b16.f10)的鼠模型来评估这些处理对肿瘤生长和总体存活率的影响。

将图14中描述的balb/c小鼠(n＝6、8或9)用2.5×10⁵个mc38-ova肿瘤细胞接种在后胁腹中。在第5天和第8天，用ox86(抗ox40)抗体；rmp1-14或29f.1.a12(抗pd-1)抗体；rmt3-32(抗tim3)抗体；抗tim3和抗ox40抗体；抗tim3、抗ox40和抗pd-1(rmp1-14)抗体；抗ox40、抗tim3和29f.1.a12/抗pd-1抗体；或tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理小鼠。当提供时，通过腹膜内注射施用100μg的每种抗体。当提供时，在第5天通过腹膜内注射施用300μg的tim3-fc-ox40l嵌合蛋白，并且在第7天再次施用。通过使用电子卡尺进行垂直肿瘤直径测量，在接种后第19天计算肿瘤面积。与对照处理相比，无论用单一抗体处理的小鼠还是用抗tim3和抗ox40抗体处理的小鼠都没有统计学上显著的肿瘤大小减小。然而，当与对照处理相比时，在用三种抗体的组合处理的小鼠和用两个连续剂量的tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理的小鼠中观察到了统计学上显著(p<0.05)的肿瘤大小减小。

将图15a和图15b中描述的balb/c小鼠(n＝8或9)用ct26肿瘤细胞接种在后胁腹中。在第5天和第7天，将第一处理组中的小鼠用150μg的tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理。在第5天和第7天，将第二处理组中的小鼠用150μg的tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理，然后在第7天和第9天，用150μg的cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理。在第5天和第7天，将第三处理组中的小鼠用150μg的tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理，然后在第7天和第9天，用150μg的csf1r-fc-cd40l嵌合蛋白处理。在第5天和第7天，将第四处理组中的小鼠用150μg的cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理，然后在第7天和第9天，用150μg的tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理。在第5天和第7天，将第五处理组中的小鼠用150μg的csf1r-fc-cd40l嵌合蛋白处理，然后在第7天和第9天，用150μg的tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理。定期计算肿瘤面积。在第一、第二、第三和第五处理组中的小鼠中，每个处理组中只有一只小鼠排斥肿瘤接种，并且第四组中的两只小鼠排斥肿瘤接种。

如图15a所示，在测试过程期间，每个处理组中的小鼠表现出肿瘤大小的减小(相对于对照处理)，其中第四处理组的小鼠观察到最大的减小，所述第四处理组首先用cd172a(sirpα)-fc-cd40l嵌合蛋白处理，然后用tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理。下一个最大的肿瘤减小是相同的cd172a(sirpα)-fc-cd40l配对tim3-fc-ox40l，但是顺序相反。因此，对于这种配对，在第二次用tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理提供了更大的肿瘤大小的减小。令人惊讶的是，对于嵌合蛋白的其他配对观察到相反的模式。实际上，当与首先用csf1r-fc-cd40l嵌合蛋白处理相比时，在csf1r-fc-cd40l之前用tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理时，产生更大的肿瘤大小的减小。因此，对于这种配对，首先用tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理提供了更大的肿瘤大小的减小。最后，对于其中首先用tim3-fc-ox40l处理的处理组，相对于接受tim3-fc-ox40l作为第一次处理和第二次处理的小鼠，当第二次提供不同的嵌合蛋白时，观察到更大的肿瘤大小的减小。因此，对于某些嵌合蛋白，施用不同的第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白可能是存在优点的。

类似地，如图15b所示，相对于对照处理的小鼠，每个处理组中的小鼠具有改善的存活率；其中约30天的存活率在约50％与75％之间。同样，对于其中首先用tim3-fc-ox40l处理的处理组，相对于接受tim3-fc-ox40l作为第一次处理和第二次处理的小鼠，当第二次提供不同的嵌合蛋白时，观察到改善的存活率。同样，对于某些嵌合蛋白，施用不同的第一嵌合蛋白和第二嵌合蛋白可能是存在优点的。

这些数据表明，包括连续处理两种嵌合蛋白(相同或不同的嵌合蛋白)的处理提供增强的抗肿瘤功效和改善的存活率。此外，对于某些嵌合蛋白，功效和存活率可能受到施用两种不同嵌合蛋白的顺序的影响。此外，对于某些嵌合蛋白，当施用的第二嵌合蛋白与第一次施用的嵌合蛋白不同时，功效和存活率可能受到影响。这些数据支持以下理解，涉及在施用一种或多种诱导适应性免疫应答的嵌合蛋白之前、同时或之后施用一种或多种诱导先天免疫应答的嵌合蛋白的组合方案可以提供协同效应(例如，协同抗肿瘤效应)。

实施例9：接头中fc结构域对嵌合蛋白功能性的贡献的表征

在本实施例中，测定了接头中的fc结构域对本发明的嵌合蛋白功能性的贡献。在此，pd-1-fc-ox40l用作含fc的嵌合蛋白的模型。因此，下文呈现的数据与本发明的嵌合蛋白有关。

在其天然状态下，pd-1作为单体存在，而ox40l由于ox40l结构域之间的静电相互作用而倾向于二聚化；fc结构域通过二硫键(例如通过它们的一个或多个半胱氨酸残基)彼此缔合。总之，若干种分子间相互作用可能有助于pd-1-fc-ox40l的四级结构。存在至少四种pd-1-fc-ox40l的潜在构型，其中嵌合蛋白作为单体、二聚体、三聚体或六聚体存在。参见图16。

通过将嵌合蛋白暴露于还原条件和非还原条件，然后在sds-page上分离蛋白质，来测试嵌合蛋白的单体和二聚体构型的存在。在非还原条件下(还原的：“-”)，嵌合蛋白在sds-page中迁移到约200kda处。在此，分别用针对pd-1、fc或ox40l的抗体探测蛋白质印迹，如图17中所示的左、中和右印迹。由于嵌合蛋白的预测单体分子量为57.6kda，预计200kda的物质是至少二聚体。但是，在还原条件下(还原的：“+”)，其还原二硫键(例如，位于fc结构域之间)，嵌合蛋白在sds-page中迁移到约100kda处。由于100kda的物质比预期重，因此预测额外质量是由于糖基化。最后，用肽-n-糖苷酶f(pngasef“+”)处理嵌合蛋白，并在还原条件下在sds-page上分离。在这些条件下，嵌合蛋白迁移到约57.6kda处。这些数据表明嵌合蛋白是糖基化的并且至少作为二聚体天然存在；其中二聚化可能是由于fc结构域之间的二硫键，例如通过它们的一个或多个半胱氨酸残基。

sds-page凝胶方法不能准确预测高电荷和/或大分子量的蛋白质的分子量。因此，接下来使用尺寸排阻色谱法(sec)表征嵌合蛋白。与其中带负电荷的sds降低肽之间基于电荷的相互作用的sds-page不同，sec不使用去污剂或还原剂。当pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白在sec上分离时，在约200kda处没有峰。这表明，嵌合蛋白不作为二聚体天然存在。相反，检测到大小大于670kda的峰。参见图18。此数据和先前数据表明pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白作为六聚体以其天然状态存在。

如上所示，当在非还原条件下或在还原条件下在sds-page上分离时，样品和/或运行缓冲液中的sds分别在不存在和存在还原剂的情况下将六聚体pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白转化为主要的二聚体或单体。参见图19(左侧凝胶)。当在缺乏sds的天然page上分离，并且在不存在还原剂的情况下，嵌合蛋白作为六聚体存在。然而，当在天然page上分离，并且在还原剂(其还原二硫键)的存在下，嵌合蛋白迁移比预期的更重；如图19所示(右侧凝胶，泳道2)，其中嵌合蛋白质基本上不能从加样孔中迁移出来。此数据表明嵌合蛋白寡聚化成更高级的蛋白质。因此，在嵌合蛋白中，二硫键似乎对于控制高级寡聚化是很重要的。

为了进一步证实这一点，构建了缺乏fc结构域的嵌合蛋白，例如“pd-1-nofc-ox40l”。此类嵌合蛋白不会具有在前述嵌合蛋白中的fc结构域之间出现的二硫键。如图20所示，当缺乏fc结构域的嵌合蛋白在天然page上分离时，基本上没有一种蛋白质从其加样孔中迁移出来；再次表明“无fc”嵌合蛋白已经形成了包含许多蛋白质的多联体样复合物。因此，在嵌合蛋白中省略fc结构域导致蛋白质聚集体的形成。这些数据指示，例如，在不同嵌合蛋白上的fc结构域之间的二硫键使嵌合蛋白稳定并确保它们各自作为六聚体存在而不是作为更高级的蛋白质/多联体存在。换句话说，fc结构域令人惊讶地将次序置于嵌合蛋白复合物上。泳道1至4分别包括2.5μg的pd-1-nofc-ox40l、5μg的pd-1-nofc-ox40l、2.5μg的pd-1-nofc-ox40l和5μg的pd-1-nofc-ox40l

图21中示出的是总结上述数据的模型，并且示出了如何由本发明的嵌合蛋白形成六聚体和多联体。例示性嵌合蛋白(pd-1-fc-ox40l)天然形成六聚体(由于ox40l结构域之间的静电相互作用和fc结构域的二聚化)。然而，在不存在对fc结构域之间的二硫键的控制作用的情况下，在pd-1-fc-ox40l蛋白的还原条件下并且由于pd-1-nofc-ox40l中不存在fc结构域，这些后者的嵌合蛋白形成多联体。

另外，构建嵌合蛋白，其中fc结构域(如本文所述)被纤维胶凝蛋白(ficolin)(其缺乏嵌合蛋白之间的二硫键必需的半胱氨酸残基)替换。与无fc嵌合蛋白和包含fc的嵌合蛋白一样，并且在天然page上分离且在还原剂的存在下(其两者都形成不迁移到凝胶中的聚集体)，包含ficolin的嵌合蛋白似乎也形成更高级的晶格，其不会迁移到凝胶中。这些数据强化了以下结论，即二硫键对于本发明的嵌合蛋白的正确折叠和功能是很重要的。

最后，使用卷曲的fc结构域(ccdfc)制备嵌合蛋白。在功能性评估下递送非常少的纯化蛋白。

因此，在嵌合蛋白的接头中包含fc结构域(其能够在嵌合蛋白之间形成二硫键)，有助于避免形成不可溶的并且可能是非功能性的蛋白质多联体和/或聚集体。

实施例10：嵌合蛋白的不同连接接头序列的表征

鉴定了具有不同特征(长度、溶解度、电荷和柔性)的不同的独特连接接头序列(17个接头)。然后将这17个连接接头序列中的每一个并入“接头2”位置来合成构建体，其中嵌合蛋白的构型：

ecd1–连接接头1–fc–连接接头2–ecd2。

在cho细胞中测试了这17种构建体的产生水平。下表提供了不同连接接头序列、这些连接接头的特征、产生水平(通过a280)以及基于对pd-l1或ox40的facs分析的结合值(ec50)的总结。确定了某些连接接头序列之间的产生水平和活性的一些变化。

表2：任选的连接接头序列的总结

通过蛋白质印迹分析表征具有不同连接接头序列(17个接头)的pd-1-igg4-ox40l嵌合蛋白，在图22a至图22q中示出。具体地，使用抗pd-1、抗fc或抗ox40l抗体探测融合构建体的每个个体结构域。结果示出，每种嵌合蛋白的相似性能表明所有候选连接接头序列都是功能性的。

另外，具有不同接头序列的每种纯化蛋白还通过在elisa测定中结合pd-l1或ox40(图23)以及基于细胞的流式细胞术测定(图24a至图24p)来表征。

实施例11：鼠pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的表征

肿瘤细胞可以在其细胞表面表达pd-l1，其可以结合由t细胞表达的pd-1(图25a和图25b)。这种相互作用抑制了t细胞的活化。包含与ox40l的细胞外结构域连接的pd-1的细胞外结构域的嵌合蛋白(即，pd-1-fc-ox40l)可以与肿瘤细胞表面上的pd-l1结合，从而防止与t细胞表面上的pd-1结合(图25c)。然后嵌合蛋白可以“悬挂”在肿瘤细胞表面，并且然后嵌合蛋白的ox40l部分可以与t细胞表面上表达的ox40结合。这将导致用共刺激ox40l信号替换抑制性pd-l1信号，以增强t细胞的抗肿瘤活性。

使用bioradproteonxpr360系统通过表面等离子体共振(spr)测量鼠pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的不同结构域的结合亲和力。具体地，确定嵌合蛋白对于pd-l1、pd-l2、ox40和fcrn的亲和力，并与重组对照蛋白进行比较，并且结果在下表中示出：

使用spr将mpd-1-fc-ox40l与芯片结合的mpd-l1-his(9.8nm)、pd-l2-his(10.6nm)、ox40-his(9.62nm)和fcrn-his(55.6nm)结合。还示出了对照蛋白(pd-1-fc、ox40l-fc和igg2a)的结合。未检测到mpd-1-fc-ox40l与fcγr1的结合。

进行另外的分析以确定mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白是否可以结合其在活细胞表面上的靶标。为了评估mpd-1-fc-ox40l与鼠pd-l1、pd-l2和ox40的结合，转染中国仓鼠卵巢细胞系chok1以稳定表达鼠pd-l1、pd-l2和ox40(图26a)。将mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与每种亲本和过表达细胞系一起温育2小时。将细胞收集，洗涤并用抗体染色，用于通过流式细胞术检测嵌合蛋白结合。如图26b所示，所有工程化的细胞系(chok1/hpd-l1、chok1/hpd-l2和chok1/hox40)以低nm以浓度依赖性方式结合mpd-1-fc-ox40l。mpd-1-fc-ox40l不与亲本chok1细胞结合，因为它们不表达可检测水平的人pd-l1、ox40或pd-l2。然而，几乎所有cho-k1-pd-l1、chok1-pd-l2和jurkat/hox40细胞群均显著移位，这指示嵌合蛋白的不同组分能够与其各自在活细胞上的受体/配体结合(图26a和图26b)。

使用超抗原细胞因子释放测定评估mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的功能活性。在此测定中，增加浓度的葡萄球菌肠毒素b(seb)用于在各种测试剂的存在下活化人外周血白细胞。监测分泌到培养上清液中的tnfα或il-2的量作为测试剂阻断抑制性信号传导事件或共刺激免疫活化信号的能力的功能性读数。如图26c所示，与其他测试剂(即，pd-1-fc、ox40l-fc和pd-1-fc/ox40l-fc)相比，mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白诱导更高水平的il2分泌(上部曲线)。然而，如图26d所示，与其他测试剂pd-1-fc和ox40l-fc相比，mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白和pd-1-fc/ox40l-fc诱导最高水平的分泌的tnfα(上两条曲线)。使用培养基和igg对照。总之，这些结果表明mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白在体外功能性地活化原代白细胞以释放tnfα和il2。

图27a至图27f示出了体内肿瘤研究的结果，其表明mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白在ct26肿瘤再次攻击模型中具有显著的抗肿瘤活性。接种ct26肿瘤的小鼠交替用以下处理：抗pd-1、抗pd-l1、抗ox40、抗pd-l1和ox40抗体的组合、抗pd-1和ox40抗体的组合、对照抗体、或三个剂量的mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白中的一个(即，100μg、150μg和300μg)并进行两次(参见底图)。具体地，在第0天进行肿瘤接种，第5天第一次处理，并且第7天第二次处理；在第30天，在排斥原发性肿瘤的任何小鼠中进行肿瘤再次攻击(在相对胁腹上植入第二肿瘤而不用药物再处理)。用ct26肿瘤细胞再次攻击小鼠。图27a示出了在肿瘤接种之后65天内每组的肿瘤大小的演变。重要的是，pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白在再次攻击(这表明癌症复发)时能够有效地杀死肿瘤细胞和/或减少肿瘤生长。因此，pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白似乎产生能够预防复发的记忆应答。

图27b和图27c示出了肿瘤接种之后40天的小鼠和肿瘤排斥的总存活百分比和统计值。图27d示出了用嵌合蛋白和其他基准抗体处理的小鼠的肿瘤中cd4+t细胞、cd4+cd25-效应t细胞或cd4+cd25+调节t细胞的变化。图27e示出了用嵌合蛋白和其他基准抗体处理的小鼠的脾脏中cd4+t细胞、cd4+cd25-效应t细胞或cd4+cd25+调节t细胞的变化。图27f总结了每组的处理结果。对于图27d和图27e，在初始肿瘤接种之后13天对处理小鼠的群组实施安乐死。将肿瘤和脾脏分离，解离，并通过流式细胞术分析效应子和非效应子/treg群体的比例。

总之，mpd-1-fc-ox40l的施用显著降低了ct26结肠直肠癌模型中的肿瘤大小。具体地，使用mpd-1-fc-ox40l比ox40激动剂和pd-l1阻断抗体产生更大的肿瘤消退(图27g)。mpd-1-fc-ox40l在低剂量(100μg，图27g)和更高剂量(300μg，图27h)下优于抗ox40、抗pd-1或抗pd-l1抗体和抗体组合。细胞因子特征表明100μg是次优剂量。在更高剂量(300μg嵌合蛋白相对于2700μgmab)下，mpd-1-fc-ox40l显著优于抗pd-1/l1+抗ox40mab组合。在图27g和图27h中，鉴定为“arc融合蛋白”的数据是指mpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白。

上述数据尤其清楚地表明了mpd-1-fc-ox40l在体内的功能活性，至少在治疗癌症方面的功能活性。

实施例12：人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的表征

开发elisa(酶联免疫吸附测定)测定以表明人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白(也称为sl-279252)的不同结构域与其各自的结合配偶体的结合亲和力。图28a示出了人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与人igg(fc的结合配偶体)的结合和检测(方形符号)。人ig(hig)用作标准物(圆形符号)。一般来讲，观察到在elisa测定中，使用中心fc区检测嵌合蛋白倾向于低估样品中的实际蛋白质含量。因此，与此测定中的标准物相比，检测到低水平的hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白。图28示出了人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与受体ox40(即，ox40l的结合配偶体)的结合和检测(方形符号)。使用重组ox40l-fc产生标准曲线(圆形符号)。图28c示出了双重结合elisa测定，其表明pd-1-fc-ox40l同时结合并接合两个靶标(pd-l1和ox40-his)的能力。将增加浓度的hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与固定量的平板结合的重组人pd-l1蛋白一起温育。此后，将重组ox40-his蛋白或对照his-标记蛋白(hvem-his)与复合物一起温育，并通过hrp-缀合的抗his抗体检测结合。结果清楚地示出，hpd-1-fc-ox40l同时并且以高特异性与pd-l1和ox40结合。

进行另外的分析以确定hpd-1-fc-ox40l融合蛋白是否可以在体外结合其在活细胞表面上的靶标。为了评估hpd-1-fc-ox40l与人ox40受体的结合，将人amlt细胞系jurkat工程化以过表达ox40，从而产生jurkat/hox40细胞(通过流式细胞术验证；图29，右图)。为了评估与pd-l1的结合，转染不表达人pd-l1的中国仓鼠卵巢细胞系chok1以稳定表达人pd-l1(图29a，左图)。为了评估与人pd-l2的结合，转染chok1细胞以稳定表达人pd-l2(图29a，中图)。将人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与每种亲本细胞系和每种过表达细胞系一起温育两小时。将细胞收集，洗涤并用抗体染色，用于通过流式细胞术检测嵌合蛋白结合。对于左侧和中间的直方图，分别使用hpd-l1抗体或hpd-l2抗体通过流式细胞术评估亲本chok1细胞(右侧细胞群)和chok1/hpd-l1细胞(左侧细胞群)。在右侧直方图中，使用hox40抗体通过流式细胞术评估亲本jurkat细胞(右侧细胞群)和jurkat/hox40(左侧细胞群)。所有工程化的细胞系(chok1/hpd-l1、chok1/hpd-l2和jurkat/hox40)均以低nm以浓度依赖性方式结合hpd-1-fc-ox40l。

如图29b至图29d所示，hpd-1-fc-ox40l不与亲本cho-k1细胞结合，因为它们不表达可检测水平的人pd-l1或pd-l2。类似地，hpd-1-fc-ox40l不与亲本jurkat细胞结合，因为它们不表达可检测水平的ox40。然而，几乎所有cho-k1-pd-l1、chok1-pd-l2和jurkat/hox40细胞群均显著移位，这指示嵌合蛋白的不同组分各自能够与其各自在活细胞上的受体/配体结合。sl-279252-chok1/hpd-l1的体外细胞结合亲和力为26.11nm，sl-279252-chok1/hpd-l2的体外细胞结合亲和力为7.60nm，并且sl-279252-jurkat/hox40的体外细胞结合亲和力为6.28nm。

接下来，进行表面等离子体共振(spr)分析以确定sl-279252与hpd-l1、hpd-l2和hox40结合的亲和力。具体地，重组人pd-l1、pd-l2或ox40的多组氨酸标记型式与proteonhtgtris-nta芯片(biorad)结合。然后在一段时间内使sl-279252流过结合的配体，并产生‘结合速率’(ka)和‘解离速率’(kd)的相对指数以计算sl-279252与每个配偶体的结合亲和力(kd)。使用重组人pd-1-fc和ox40l-fc作为结合的阳性对照。这些对照具有相对快速的‘结合速率’和同样快速的‘解离速率’，从而导致低纳摩尔的结合亲和力。spr结合亲和力的结果证明了融合蛋白的每个部分的高亲和力结合(除了针对具有效应子功能的fc受体之外)。重要的是，hpd-1-fc-ox40l的解离速率比基准对照蛋白的解离速度慢得多：hpd-1-fc-ox40l与pd-l1的解离是pd-1-fc的18倍长，与pd-l2的解离是pd-1-fc的13.4倍长，并且与ox40的解离是ox40l-fc的36.32倍长。总之，这些结果指示hpd-1-fc-ox40l融合蛋白在与pd-l1或pd-l2结合时具有长的停留时间。

上述数据清楚地表明，人pd-1-fc-ox40l融合蛋白(sl-279252)的不同结构域与其在哺乳动物细胞膜的表面上的天然结合配偶体(例如，受体或配体；pd-l1、pd-l2和ox40)结合。

为了证实人pd-1-fc-ox40l(sl-279252)的所有三个结构域都是完整的并且可通过蛋白质检测测定识别，对纯化的融合蛋白进行蛋白质印迹分析，所述融合蛋白用人抗-pd-1、抗-fc和抗-ox40l探测(图30)。sl-279252通过所有三种抗体均检测到，并且当蛋白质在还原条件下分离时，迁移至大约75kda处。鉴于与ox40l信号传导和功能相关联的体内寡聚化，大约50％的非还原蛋白作为二聚体分离，这是潜在的优势。sl-279252的预测分子量为60.3kda。检测到较高分子量的sl-279252的还原部分，不希望受理论束缚，这可能是由于糖基化。通过用蛋白质去糖基化酶pngasef处理sl-279252证实了这一点。在去糖基化之后，sl-279252的还原部分精确地迁移到预测的分子量60.3kda处。这提供了sl-279252通过糖基化进行共翻译修饰/翻译后修饰的证据，所述修饰在蛋白质的正确折叠和稳定性以及细胞与细胞粘附中起重要作用(dalzielm,dwekra.science2014；maverakise,lebrillacb.jautoimmun.2015)。

由于人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白保留了糖基化酶修饰，因此进行进一步分析以确定其糖基化状态是否影响其功能。用去糖基酶pngasef处理hpd-1-fc-ox40l，然后在常规功能性elisa(图31a)和与表达hox40的jurkat细胞的细胞结合测定(图31b)中评估hpd-1-fc-ox40l与hox40的结合。使用不表达hox40的jurkat细胞系作为对照。结果指示糖基化在hpd-1-fc-ox40l与其相互作用配偶体的结合中不起重要作用。

接下来，进行基于elisa的阻断/竞争测定以证明hpd-1-fc-ox40l可以胜过人pd-1-生物素以与平板结合的重组人pd-l1结合。在此测定中，将重组人pd-l1涂覆在高结合elisa板上。使用重组人pd-1-生物素，接着使用抗生物素蛋白-hrp抗生物素蛋白检测，产生辣根过氧化物酶(hrp)信号。如图32a所示，在阴性对照(确实含有pd-l1结合结构域的嵌合蛋白)的情况下，pd-1-生物素的信号未被破坏(图32a，上部曲线/方形符号)。值得注意的是，hpd-1-fc-ox40l以浓度依赖性方式阻断pd-1-生物素与pd-l1的结合(由此减少hrp信号)(图32a，下部曲线/圆形符号)。此测定的结果证明hpd-1-fc-ox40l与pd-1-生物素强烈竞争与重组人pd-l1的结合，其中计算的ic50为6.68nm。

进行细胞因子释放(即肿瘤共培养)测定以证明hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白能够诱导il-2在t细胞中的表达。如图32b所示，在存在或不存在hpd-1-fc-ox40l的情况下，将原代人cd3+t细胞与pd-l1低或pd-l1高人肿瘤细胞一起温育；因此，允许使用il2分泌和基于流式细胞术的免疫评估来评估t细胞的效应子功能和增殖。具体地，通过密度梯度离心分离人外周血白细胞，接着对cd3+细胞进行阴性富集，并且随后用cd3/cd28珠活化。然后，在存在或不存在hpd-1-fc-ox40l(500ng和5μg浓度)的情况下，将活化的细胞与pd-l1低前列腺癌细胞(人pc3)或pd-l1高肺腺癌细胞(人hcc827)共培养。然后，通过elisa测量产生并分泌到细胞培养上清液中的il-2的量(图32c)。hpd-1-fc-ox40l在pc3细胞(图32c，左束)中诱导的分泌il2水平比在hcc827细胞(图32c，右束)中诱导的分泌il2水平更高。由于人t细胞在与pc3细胞系共培养时产生的il-2比与hcc827细胞系共培养时显著更多，这表明pd-l1的量抑制il-2的产生(图32c)。然而，当将hpd-1-fc-ox40l添加到共培养物中时，在两种共培养系统中都观察到il-2产生增加。除了测量分泌的il-2的量之外，收集来自共培养测定的活化t细胞并通过细胞内流式细胞术分析。这些数据指示hpd-1-fc-ox40l增加了cd4+和cd8+t细胞两者中的ki67、ifnγ和tnfα染色(图32d)。

表征hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白的功能活性的另一种功能性测定是超抗原细胞因子释放测定。在此测定中，增加浓度的葡萄球菌肠毒素b(seb)用于在各种测试剂的存在下活化人外周血白细胞；步骤的流程图在图32e中示出。监测分泌到培养上清液中的tnfα(图32f)或il-2(图32g)的量作为测试剂阻断抑制性信号传导事件或共刺激免疫活化信号的能力的功能性读数。如图32f和图32g所示，与其他测试剂(即，pd-1-fc、ox40l-fc和pd-1-fc/ox40l-fc)相比，hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白诱导更高水平的tnfα分泌和il2分泌(上部曲线)。使用培养基和igg对照。总之，这些结果表明hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白在体外功能性地活化原代人白细胞。

最后，进行elisa测定以证明人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与来自恒河猴的ox40和来自食蟹猴的pd-l1和pd-l2的结合亲和力和交叉反应性。如图33a所示，人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白特异性地与平板结合的重组cmpd-l1结合，并通过hrp缀合的抗hfc抗体检测所述结合。使用两种不同来源的人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白(方形符号和三角形符号)。使用人cd120b-fc-tgfb嵌合蛋白(倒三角形符号)作为对照，而使用重组cmpd-1-hfc产生标准曲线(圆形符号)。这些结果指示hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与cmpd-l1交叉反应。

hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白特异性地与平板结合的重组cmpd-l2结合，并且通过与山羊抗hox40l抗体结合的hrp缀合的抗山羊igg检测所述结合。使用两种不同来源的人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白(图33b，方形符号和圆形符号)。使用人cd120b-fc-tgfb嵌合蛋白(图33b，三角形符号)作为对照。如图33c所示，证明了来自两种不同来源的人pd-1-fc-ox40l嵌合蛋白(方形符号和圆形符号)和hcd120b-fc-tgfb嵌合蛋白(三角形符号)与平板结合的rmox40的结合。通过与山羊抗hox40l抗体结合的hrp缀合的抗山羊igg检测结合。因此，上述数据证明hpd-1-fc-ox40l嵌合蛋白与cmpd-l1、cmpd-l2和rmox40交叉反应。

实施例12：鼠tim3-fc-ox40l嵌合蛋白的表征

产生具有548个氨基酸残基的单体tim3-fc-ox40l嵌合蛋白(sl-366252)的计算机模拟结构预测，其p值为5.1x10^-17。预测单体蛋白质的分子量为61.6kda。嵌合蛋白的结构在图34中提供。

具体地，结构预测显示六个位置(1％)可能是无序的。嵌合蛋白的整个序列的二级结构预测显示所述蛋白质具有3％α-螺旋(h)、43％β-折叠(e)和51％卷曲(c)的组成。还计算了嵌合蛋白的绝对全局质量的gdt(全局距离测试)和ugdt(未标准化的gdt)，以得到481(87)的总ugdt(gdt)。蛋白质残基的溶剂可及性的三态预测是35％暴露(e)、49％中间(m)和14％埋入(b)。

构建鼠tim3-fc-ox40l嵌合蛋白。通过针对嵌合蛋白的每个个体结构域(即通过抗tim3、抗fc和抗ox40l抗体)进行蛋白质印迹分析，来表征嵌合蛋白。蛋白质印迹指示在非还原泳道中存在占优势的三聚体条带(图35，每个印迹中的泳道2)，其在还原剂β-巯基乙醇的存在下被还原为糖基化的单体条带(图35，每个印迹中的泳道3)。如图35每个印迹中的泳道4所示，在还原剂(β-巯基乙醇)和内切糖苷酶(pngase)两者的存在下，嵌合蛋白作为预测分子量为61.6kda的单体分离。

进行细胞结合测定以证明mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白的不同结构域对其各自在哺乳动物细胞膜表面上的结合配偶体的结合亲和力。对于细胞结合测定，将永生化细胞系工程化以稳定表达鼠受体ox40(chok1-mox40)。将增加浓度的mtim3-fc-ox40l与每种亲本(对照)和过表达细胞系一起温育2小时。将细胞收集，洗涤并用抗体染色，用于通过流式细胞术检测嵌合蛋白结合。如图36所示，mtim3-fc-ox40l以浓度依赖性方式以低nm亲和力与工程化的细胞系(chok1-mox40)结合。具体地，chok1亲本细胞系(下部曲线)对增加浓度的mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白没有应答，因为它不过表达mox40。相比之下，过表达mox40的chok1-mox40细胞系以浓度依赖性方式与mtim3-fc-ox40l结合。细胞结合测定还指示mtim3-fc-ox40l以15.2nm的亲和力与mox40结合。

进行体内功能性测定以证明mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白的功能活性。在第0天用ct26肿瘤接种小鼠。一旦肿瘤可感知且直径为至少4-6mm，用两个剂量的150μg的mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理小鼠。在植入后第13天对从小鼠收集的各种组织进行免疫表型分析。

对用鼠tim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理的荷瘤小鼠进行免疫分析。如图37a所示，与对照处理组(图37a中的左束)相比，用mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理的小鼠在脾脏、外周淋巴结和肿瘤中表现出更高百分比的总cd4+t细胞(图37a中的右束)。在脾脏和肿瘤内，cd4+t细胞群的这种增加主要是由于cd4+cd25-效应t细胞的增加，这与涉及非调节t细胞活化的概念一致(图37b)。处理的小鼠还表现出较低百分比的cd4+cd25+调节t细胞，这表明调节t细胞可以被嵌合蛋白抑制(图37b)。

还分析了嵌合蛋白刺激cd8+t细胞识别肿瘤抗原的能力。具体地，图37c示出了用于确定识别ct26肿瘤天然表达的ah1肿瘤抗原的cd8+t细胞的分数的四聚体染色分析。在脾脏中，与未处理的小鼠(图37c中的左束)相比，用mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理的小鼠(图37c中的右束)中发现更高比例的识别ah1肿瘤抗原的cd8+t细胞。值得注意的是，与未处理的小鼠(图37c中的左束)相比，用嵌合蛋白处理的小鼠(图37c中的右束)在肿瘤浸润淋巴细胞(til)中观察到更高比例的ah1四聚体阳性cd8+t细胞。

使用mc38和ct26小鼠结肠直肠肿瘤模型分析mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白的体内抗肿瘤活性。在一组实验中，使balb/c小鼠在第0天接种ct26肿瘤细胞，并且/或者在第30天第二次接种ct26肿瘤细胞进行再次攻击。肿瘤生长4天之后，当肿瘤直径达到4-5mm时，用对照抗体或150μg的mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理小鼠。在第7天重复处理。对肿瘤接种之后45天内肿瘤大小的演变进行分析。

如图38a所示，未处理的小鼠发生显著的肿瘤，而用mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理的小鼠中没有一个发生可检测大小的肿瘤。重要的是，mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白在再次攻击(这表明癌症复发)时能够有效地杀死肿瘤细胞和/或减少肿瘤生长。因此，mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白似乎产生能够预防复发的记忆应答。肿瘤接种之后50天内小鼠的总存活百分比(图38b)显示所有未处理的小鼠在肿瘤接种之后21天内死亡，而mtim3-fc-ox40l嵌合蛋白处理的小鼠在肿瘤接种之后50天显示100％的存活率。图38c总结了每组的处理结果。

上述数据尤其清楚地表明了mtim3-fc-ox40l在体内的功能活性，至少在治疗癌症方面的功能活性。

等效方案

尽管本发明结合其具体的实施方案进行描述，但应当了解可对它进行进一步的修改并且本申请旨在涵盖任何基本根据本发明的原理而对本发明进行的变动、使用或适应性调整，并且包括虽然不属于本公开内容但属于本发明所属领域的已知或习用实施手段的和属于上文所述的实质特征的以及符合所附权利要求书范围之内的变更。

仅使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文确切描述的具体实施方案的许多等效方案。这些等效方案旨在涵盖在以下权利要求书的范围中。

以引用的方式并入

本文引用的所有专利和出版物特此以引用的方式整体并入。

本文中讨论的公布仅仅提供它们在本申请的提交日期之前的公开内容。本文中没有任何内容应被认为是承认本发明因为在先发明而无权居先于这类出版物。

如本文所用的，所有标题仅用于组织，并不旨在以任何方式限制本公开。任何单个部分的内容可同样适用于所有部分。

序列表

<110>夏塔克实验室公司

<120>制备和使用基于细胞外结构域的嵌合蛋白的方法

<130>shk-001pc2

<150>62/464,002

<151>2017-02-27

<160>100

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>202

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>合成多肽

<400>1

metpheserhisleupropheaspcysvalleuleuleuleuleuleu

151015

leuleuthrargsersergluvalglutyrargalagluvalglygln

202530

asnalatyrleuprocysphetyrthrproalaalaproglyasnleu

354045

valprovalcystrpglylysglyalacysprovalpheglucysgly

505560

asnvalvalleuargthraspgluargaspvalasntyrtrpthrser

65707580

argtyrtrpleuasnglyaspphearglysglyaspvalserleuthr

859095

ilegluasnvalthrleualaaspserglyiletyrcyscysargile

100105110

glnileproglyilemetasnaspglulyspheasnleulysleuval

115120125

ilelysproalalysvalthrproalaprothrargglnargaspphe

130135140

thralaalapheproargmetleuthrthrargglyhisglyproala

145150155160

gluthrglnthrleuglyserleuproaspileasnleuthrglnile

165170175

serthrleualaasngluleuargaspserargleualaasnaspleu

180185190

argaspserglyalathrileargilegly

195200

<210>2

<211>181

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>合成多肽

<400>2

sergluvalglutyrargalagluvalglyglnasnalatyrleupro

151015

cysphetyrthrproalaalaproglyasnleuvalprovalcystrp

202530

glylysglyalacysprovalpheglucysglyasnvalvalleuarg

354045

thraspgluargaspvalasntyrtrpthrserargtyrtrpleuasn

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glualaalaalaargglualaalaalaargglualaalaalaargglu

151015

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ser

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