本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种载有抗菌肽mdc涂层的气管导管及其制备方法和应用。
背景技术：
气管插管是危重病患者抢救中建立通畅气道的简捷有效的方法，气管插管所建立的人工气道，成为病人身上最重要的一条“生命线”。临床中每天需要进行气管插管机械通气的患者不计其数，其并发症中的植入物相关感染成为临床医生亟待解决的问题。机械通气过程中最常见且最严重的并发症—呼吸机相关性肺炎，发病率、病死率高，一旦发生又得不到有效控制，患者将不得不面临拔除气管导管、重新插管或气管切开，大大增加了患者治疗风险和身心折磨，医疗经济负担也将极大增加。目前采取的抗感染治疗、气道湿化、有效护理等措施并没有很好的减少呼吸机相关性肺炎的发生。研究表明，气管插管导致的呼吸道感染及呼吸机相关性肺炎常见的病原菌是大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌等，而且这些细菌在气管插管患者中可以相继或重叠出现，表现出多重耐药甚至泛耐药，尤其是细菌生物被膜一旦形成，由于生物膜的屏障作用及生物膜内细菌低代谢等特点，其耐药性可提高成百上千倍，使得疗效堪忧，患者常常由于无法有效控制呼吸道感染而死亡。
目前，国内外学者将目光聚焦在气管插管导管的表面抗菌改性上，不改变原有的导管外形使其获得抗菌性能，减少细菌生长，以此防治呼吸机相关性肺炎。公开号为cn103948973a的中国专利申请“一种具有安全高效抗菌性能的医用气管导管”以正硅酸乙酯为硅源，以γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷为有机相前驱体，以无机纳米银为抗菌剂，经溶胶凝胶方法，制成有机硅载银抗菌溶胶，再以气管插管导管为基材，进行表面抗菌涂层，制备而成有机硅载银抗菌涂层气管插管导管，该气管导管不仅具有高效的抗菌性，而且涂层银离子几乎不析出，表面光滑不粘附痰液，副反应极低等优势，符合临床气管插管的需要。公开号为cn103933617a的中国专利申请“一种具有抗细菌粘附的气管导管的制备方法”通过制备含碘光催化抗菌溶胶、对pvc气管导管进行表面羟基化改性、在pvc气管导管表面形成光催化抗菌膜改性等步骤，使表面改性后的气管导管具有良好的抗细菌粘附性能和可见光诱导灭菌性能，抗菌效果持久，化学稳定性高。
然而，上述已公开的气管导管表面抗菌改性的制备方法比较复杂，且均采用无机化学类抗菌剂，存在一定的安全隐患，难以避免残余毒性的问题。
近年来抗菌肽(antimicrobialpeptides,amp)的出现为气管导管表面抗菌涂层的研究带来了新的思路。抗菌肽是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的小分子多肽，广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内，其中昆虫抗菌肽cecropin是人类发现最早的一类抗菌肽。抗菌肽具有一系列引人注目的生物学活性，包括抗菌、抗炎、抗病毒、抗寄生虫、抑制肿瘤细胞及免疫调节活性等。抗菌肽muscadomesticacecropin(mdc)是本课题组从家蝇幼虫脂肪体cdna文库中克隆的一种昆虫抗菌肽，该基因的orf区全长为192bp，可编码63个氨基酸的前体蛋白，1～23位氨基酸是以保守4肽结尾的信号肽，其成熟肽含有40个氨基酸，前期研究发现抗菌肽mdc对许多标准菌株及临床耐药菌株显示了极强的体外抗菌活性，能够破坏细菌细胞膜或穿过细胞膜作用于胞内靶位点，作用机制独特，对正常人体细胞毒、副作用小。
目前，没有关于以抗菌肽mdc作为生物涂层的抗菌成分用于制备气管插管导管的相关报道。
技术实现要素：
为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种载有抗菌肽mdc涂层的气管导管及其制备方法。
本发明的另一个目的在于提供所述的载有抗菌肽mdc涂层的气管导管在人工气管插管及呼吸机中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明提供的抗菌肽mdc，其氨基酸序列如seqidno:1所示，具体地，所述的氨基酸序列为：gwlkkigkkiervgqhtrdatiqtigvaqqaanvaatlkg。
本发明提供的抗菌肽mdc是采用固相化学合成法制得，具体地，通过多肽合成仪合成多肽粗品；然后用固相合成法合成多肽；再将合成的多肽使用反相高效液相色谱进行纯化，并利用电喷射质谱法对合成的多肽进行鉴定，从而完成多肽的制备。
本发明还提供一种所述的载有抗菌肽mdc涂层的气管导管的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将医用几丁糖溶于注射用水，制成质量体积浓度为3～5％的凝胶液，然后加入一定量的抗菌肽溶液，使抗菌肽终浓度为0.2mg/ml，在30℃下以300转/分钟的速度搅拌混匀，制备涂层膜液，在室温下，用超声波振荡20分钟，除去涂层膜液中的气泡，即得抗菌肽几丁糖复合膜液；
(2)将步骤(1)制得的抗菌肽几丁糖复合膜液浸涂或流延于气管导管基材中，自然烘干或50℃固化干燥，即得气管导管。
上述的制备方法中，以几丁糖凝胶作为固定和缓释基质，抗菌肽mdc作为抗菌有效成分，制成涂层膜液，所述的几丁糖是由蟹壳提纯的高分子化合物几丁质(chitin)，经脱n—乙酰基再深加工后制成的一种聚氨基葡萄糖，是一种具有良好生物相容性、生物可降解性及生物学活性的医用高分子多糖类物质。进一步制得的医用几丁糖凝胶无毒、无刺激性、无热原性、无免疫抗原性，不溶血且具有热稳定性，无致突变、致死等不良反应，还有轻微抑菌作用，在本发明中作为抗菌肽mdc固定和缓释基质，使其发挥长期抗菌效果。
本发明选取抗菌肽mdc作为生物涂层，使气管插管导管的表面获得抗菌性能，有效预防细菌定植和生长，将减少或延缓气管插管呼吸机相关性肺炎的发生，延长导管留置时间，为患者抢救争取宝贵时间，提高救治成功率，也可减少医疗经济负担、减轻患者的身心痛苦。此外，本发明研发设计的载有抗菌肽mdc涂层的气管导管，无生物不良反应，符合临床气管插管的需要，具有广泛的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的载有抗菌肽mdc涂层的气管导管具有显著的抗菌性，杀菌率达98％以上，所述的抗菌肽mdc作用机制独特，不易产生耐药性，突破传统抗菌药物对细菌生物膜作用的局限，为临床提供具有安全高效抗菌性能的气管导管。
(2)本发明提供的载有抗菌肽mdc涂层的气管导管的制备步骤简单，安全性高、无不良反应，应用前景广阔。
附图说明
图1为抗菌肽mdc的高效液相色谱图。
图2为抗菌肽mdc的质谱图。
图3为扫描电镜观察空白对照气管导管表面鲍曼不动杆菌生物膜形态结构。
图4为扫描电镜观察几丁糖凝胶对照组气管导管表面鲍曼不动杆菌生物膜形态结构。
图5为扫描电镜观察抗菌肽mdc几丁糖凝胶复合涂层气管导管表面鲍曼不动杆菌生物膜形态结构。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1固相化学合成法合成抗菌肽mdc
抗菌肽mdc的氨基酸序列为：ac-gwlkkigkkiervgqhtrdatiqtigvaqqaanvaatlkg-nh2，如seqidno:1所示，含有40个氨基酸，理论等电点为10.56，理论分子量为4299.04。抗菌肽mdc的制备从c端到n端逐一进行，通过多肽合成仪来完成，具体步骤为：
(1)首先将fmoc-x(x是抗菌肽mdcc端的第一个氨基酸)接入到wang树脂，然后脱去fmoc基团后得到x-wang树脂；再将fmoc-y-trt-oh(9-芴甲氧羧基-三甲基-y，y为抗菌肽mdcc端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从c端合成到n端，直至合成完毕，得到脱去fmoc基团的侧链保护的树脂；
(2)在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀用tfa(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由tfa、水和tis(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成；
(3)使用0.2mol/l硫酸钠(磷酸调节至ph7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，c18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1ml/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；
(4)再利用反相c18柱进一步纯化，洗脱液a为0.1％tfa/水溶液；洗脱液b为0.1％tfa/乙腈溶液，洗脱浓度为25％b～40％b，洗脱时间为12min，流速为1ml/min，再同上收集主峰，冻干，即得精制的抗菌肽mdc；
(5)将上述得到精制抗菌肽mdc经过反相高效液相色谱和电喷雾质谱法分析，反相高效液相色谱图如图1所示，质谱图如图2所示，结果显示，抗菌肽mdc的纯度大于95％，分子量为4299.36，与理论分子量基本一致。
实施例2载有抗菌肽mdc涂层的气管导管制备
(1)将医用几丁糖溶于注射用水，制成质量体积浓度为4％的凝胶液，然后加入一定量的抗菌肽溶液，使抗菌肽终浓度为0.2mg/ml，在30℃下以300转/分钟的速度搅拌混匀，制备涂层膜液，在室温下，用超声波振荡20分钟，除去涂层膜液中的气泡，即得抗菌肽几丁糖复合膜液；
(2)将步骤(1)制得的抗菌肽几丁糖复合膜液浸涂或流延于pvc气管导管基材中，自然烘干或50℃固化干燥，即得载有抗菌肽mdc涂层的气管导管。
试验例一、安全性评价
(1)细胞毒性试验
按照gb/t16886.5-2003规定的细胞毒性试验方法，对载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品进行细胞毒性试验。用10％的小牛血清mem培养基配制载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品浸提液培养nctccolone929细胞(小鼠成纤维细胞)，并以空白pvc气管插管导管样品浸提液作阴性对照，5g/l苯酚溶液作阳性对照。
试验结果：阴性对照的细胞形态正常，贴壁生长良好，胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解；阳性对照的细胞生长不佳，90％以上细胞呈圆形或细胞溶解；载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品浸提液中细胞形态正常，贴壁生长良好，胞浆内有离散颗粒，无细胞溶解。载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品和空白pvc气管插管导管样品浸提液都评为无毒，判定分级为0级(细胞毒性反应为0级或1级为合格)。培养48小时监测细胞od570和相对增值度，载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品和空白pvc气管插管导管样品浸提液都判定分级为0级，载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品细胞毒性试验结果为合格。
(2)急性全身毒性试验
按照gb/t16886.11-2011标准，观察载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品对小鼠急性全身毒性反应。空白pvc气管插管导管样品和载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品的0.9％氯化钠注射液浸提液以尾静脉注射方式单次给予，并以相应浸提介质作为空白对照。注射后4、24、48和72h，观察小鼠毒性反应情况。结果发现：空白对照液组、空白pvc气管插管导管样品和载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品浸提液组均未见异常反应。结果表明：载有抗菌肽mdc涂层的气管导管样品浸提液的急性全身毒性试验结果为符合无毒性要求，和空白pvc气管插管导管样品的急性全身毒性试验无差别。
试验例二、抗菌性评价
以鲍曼不动杆菌为代表，模拟临床icu呼吸机相关性鲍曼不动杆菌生物膜感染，建立鲍曼不动杆菌生物膜体外模型。以不做任何处理的空白气管导管样品为空白对照组，同时设几丁糖凝胶对照组，模拟呼吸机导管中液体流动状态，将各组气管导管浸渍于1.0×105鲍曼不动杆菌菌液中，培养24h，取10ul浸渍液在lb培养基上涂布接种，35℃过夜培养后，计数菌落数，观察细菌的相对生长情况，以显示其抗菌性能。
对比实验的结果证实：空白气管导管样品细菌正常生长，几丁糖凝胶对照组气管导管样品细菌生长减少不明显，杀菌率在5％左右，而抗菌肽mdc几丁糖凝胶复合涂层气管导管样品细菌生长明显减少甚至消失，杀菌率达98％以上。
其中，扫描电镜观察气管导管表面生物膜形态结构如图3-图5所示，结果显示：空白对照气管导管(图3)可见大量细菌黏附成团，形成大块状生物膜；几丁糖凝胶对照组气管导管(图4)生物膜厚度及面积均有所减少；抗菌肽mdc几丁糖凝胶复合涂层气管导管(图5)仅见散在细菌且菌细胞发生变形、断裂、外膜脱离，内容物泄漏；
此外，琼脂平板菌落计数法结果亦显示：抗菌肽mdc几丁糖凝胶复合涂层气管导管表面活菌数较空白对照组和几丁糖凝胶对照组均显著减少。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>广东药科大学
<120>一种载有抗菌肽mdc涂层的气管导管及其制备方法和应用
<130>1122
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>40
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
glythrleuleuleuileglyleuleuileglyalavalglyglyhis
151015
thralaalaalathrileglythrileglyvalalaglyglyalaala
202530
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3540