本发明涉及巴曲酶的新用途，具体是巴曲酶在促进缺血超长随意皮瓣存活的作用。
背景技术：
近年来，随着科技的进步，工业、交通、能源等呈现高速发展，人们的工作和生活的节奏大为加快，导致与职业、交通行为等相关的大面积创伤、组织缺损病例也在逐年增减。这类创伤在修复后多遗留不同程度的畸形和功能障碍，尤其是手部和颜面部的创伤畸形。此外，在手外显微重建、整形外科、创伤骨科等领域，常常需要做皮瓣转移手术来锁盖创面、重建功能和改善外形。整形外科一直在“美”跟“血供”之间进行较量。在这持久的战役中，整形外科医生的使命就是避免皮瓣“部分”或者“完全”坏死。临床上，随意皮瓣因其使用的灵活和方便，已经成为修复组织缺损的常规手术之一，然而由于随意皮瓣内无知名的血管供血，血供仅靠皮下的毛细血管网，所以其长宽比例受到一定限制，除面部等血供丰富的区域可达3:1，其他部分一旦超出1.5-2：1 的长宽比，皮瓣远端会出现缺血坏死，这在很大程度上限制了其在临床上的应用，因此，为了使皮瓣在转移过程中能成功生存，通常在设计时将皮瓣的长宽比例进行一定的限制，如何改善超长随意皮瓣的血运、提高皮瓣的缺血耐受能力、增加缺血随意皮瓣的存活，改善皮瓣微循环、提高组织对缺血和炎症的耐受性，减轻组织水肿等成为了提高随意皮瓣手术成功率的关键因素，对指导皮瓣临床用药、移植范围和防治手段都有重要的临床意义。
巴曲酶又名凝血酶样酶、去纤维蛋白酶，是从矛头蛇的蛇毒中提取的一种生物制剂。其主要作用是降低血液粘度，促进血液中纤维蛋白原的分解和抑制血栓的形成。巴曲酶适用于急性缺血性脑血管疾病、突发性耳聋等症的治疗。据文献报道，巴曲酶作为神经保护药物，具有降低神经细胞的凋亡和急性期的炎症反应的作用。此外，巴曲酶还具有治疗高粘血症，降低血管阻力及改善血液循环，拮抗缺血再灌注损伤，促进血管新生和抑制凋亡的作用。国内外目前尚无巴曲酶对随意皮瓣的作用的研究报道。
技术实现要素：
本发明涉及巴曲酶在促进缺血超长随意皮瓣存活的作用。在促进缺血超长随意皮瓣存活的过程中采用静脉注射的方式，以1ml纯巴曲酶粉末含巴曲酶10BU，按1ml巴曲酶（10BU）溶于49ml生理盐水比例，配成0.2BU/ml的巴曲酶注射溶液，按照5BU/Kg，即每公斤大鼠注射5BU的纯巴曲酶的剂量进行注射，（其中Brabender Units (BU)是专有单位，指布拉班德粘度仪测得的粘度单位），使用方法为每日一次，用量为每千克注射5BU的纯巴曲酶，采用尾静脉注射，5～7天为一疗程。
通过大量的动物实验得出结论，使用巴曲酶可以使得皮瓣的成活面积比明显提高，能很好地促进缺血超长随意皮瓣存活。
附图说明
图1本发明缺血随意皮瓣模型示意图；
图2巴曲酶实验组与生理盐水对照组术后7天的大体对比图；
图3术后7天皮瓣成活面积比柱状对比图；
图4 巴曲酶实验组与生理盐水对照组术后7天的皮瓣苏木精—伊红染色法（HE染色）对比图；
图5术后7天皮瓣中段平均微血管密度MVD计数柱状对比图；
图6术后7天皮瓣超氧化物歧化酶（SOD）表达柱状对比图；
图7术后7天皮瓣丙二醛（MDA）表达柱状对比图；
图8术后7天皮瓣VEGF表达情况对比图；
图9术后7天皮瓣VEGF表达及IA值柱状对比图；
图10.1术后7天巴曲酶组与生理盐水组皮瓣血液灌流量激光多普勒血流仪结果对比图；
图10.2术后7天巴曲酶组与生理盐水组皮瓣X线摄影结果对比图；
图11术后7天皮瓣血液灌流量柱状对比图；
具体实施方式
巴曲酶可以促进缺血超长随意皮瓣存活性明显提高。在促进缺血超长随意皮瓣存活的过程中采用静脉注射的方式，以1ml纯巴曲酶粉末含巴曲酶10BU，按1ml巴曲酶（10BU）溶于49ml生理盐水比例，配成0.2BU/ml的巴曲酶注射溶液，按照5BU/Kg，即每公斤体重注射5BU的纯巴曲酶的剂量进行注射，（Brabender Units (BU)是专有单位，指布拉班德粘度仪测得的粘度单位），使用方法为每日一次，用量为每千克注射5BU的纯巴曲酶，采用尾静脉注射，5～7天为一疗程。以下为巴曲酶在促进缺血超长随意皮瓣存活的作用评价：
1、建立SD大鼠随意皮瓣模型
30只清洁级雄性SD大鼠，由温州医科大学实验动物中心提供，SCXK（浙）2005-0019，体重200-250g，2—3个月龄。按照随机数字表法，将大鼠分为巴曲酶实验组和生理盐水对照组，每组15只。采用改良的McFarlane皮瓣制作方法[2]，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，将动物俯卧位固定，脱毛，碘伏消毒，铺巾，以大鼠脊柱为中线，尾部两髂嵴连线为蒂，在背部正中设计一宽3cm、长9cm矩形随意型皮瓣，设计线切开皮肤，皮下组织，达深筋膜浅层，保留真皮下毛细血管网，于深筋膜浅层表面分离皮下组织，遇到知名血管即以4-0号丝线结扎。皮瓣完全掀起后，彻底止血，立即用4-0医用慕丝缝线间断缝合。切口周围碘伏消毒后涂抹金霉素软膏，腹腔注射生理盐水(50ml／kg)抗休克。
巴曲酶实验组尾静脉注射巴曲酶注射液5BU·kg-1·d-1，对照组注射等体积的灭菌生理盐水0.5ml·kg-1·d-1，连续注射7 d，均单笼饲养。因大鼠有自残现象，为避免其术后回头撕咬伤口影响皮瓣存活，造成实验失败，均为其带上“颈套”（见图1），并单笼喂养。为减少手术操作带来的误差，所有手术由1人完成。
2、观察指标：
2.1 皮瓣存活面积比的检测
对皮瓣成活进行肉眼大体观察，具体包括皮瓣颜色、组织弹性、质地。术后第7天，各组大鼠在麻醉状态下用透明纸准确描记皮瓣成活及坏死面积，用SONY数码相机拍摄带有尺度标记的照片，然后导入计算机，以 Image-Pro Plus v6.0软件测量皮瓣存活长度，取一个最大长度，一个最小长度，得到平均存活长度，得出皮瓣存活后有效长宽比；同时对皮瓣存活面积和总面积进行测量，计算两组皮瓣存活面积比（皮瓣存活面积比=皮瓣存活表面积／皮瓣总表面积×100%）。皮瓣坏死标准：皮瓣颜色发黑，无新毛发生长，组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血；病理表现为组织崩解、细胞核消失、炎症细胞广泛浸润、有局灶出血。
7天后实验组皮瓣的成活面积比为（76.26 ± 3.43）%，对照组皮瓣成活面积比为（48.27 ± 6.69）% ，比较两组皮瓣的成活面积比，差异有统计学意义（P<0.01）（图2，3）。
2.2组织学检测
术后7天，在皮瓣中点处取样。样本经10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，术后7d光镜下(×100，×200)观察肉芽组织层厚度、毛细血管的结构变化、组织水肿、坏死、炎性细胞浸润等情况。（图4）在10×10倍光镜下随意选取5个视野计数微血管密度（MVD）取平均值。MVD计数，巴曲酶组皮瓣中区(30.83 ± 2.86)个/mm2。生理盐水组在皮瓣中区 (14.44 ± 3.56)个/mm2，两组中区MVD比较，差异有统计学意义（P＜0.01）（图5）。
2.3 SOD、MDA表达的检测
术后7 d，于皮瓣中区正中部位切取0.5 cm×0.5 cm全层组织，去除肉膜层，称质量，稀释，冰水浴中制成体积分数10％组织匀浆液。比色法及硫代巴比妥法分别测量超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量。
巴曲酶组皮瓣组织每毫克蛋白中超氧化物歧化酶（SOD）含量为62.09 ± 4.03 U，明显高于生理盐水组 23.37 ± 2.59 U，差异有统计学意义（P< 0.01）（图6）；每毫克蛋白中丙二醛（MDA）含量实验组为22.75 ± 3.94 nmol、对照组为59.21 ± 5.90 nmol，差异有统计学意义(P<0.01)（图7）。
2.4 免疫组化观察
石蜡切片进行脱蜡，高温抗原修复，用3% 过氧化氢消除过氧化物酶活性，血清封闭后，滴加目的一抗（VEGF，1：200）孵育过夜，滴加生物素标记的二抗IgG，再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染后封，采用Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析系统分析各组切片免疫组织化学染色结果。检测血管内皮生长因子（VEGF）在实验组和对照组的表达及分布情况。选择染色均匀的区域，在 40×10倍光镜下进行观察，每张片子取五个视野拍摄保存，在拍摄过程中，设置白平衡、快门时间等参数一致。将保存的图片导入Image-Pro Plus v6.0软件，选择需要分析的指标“累积吸光度 IA 值”，读取IA数值进行测量，作为评价VEGF表达的指标。
两组VEGF免疫组化表达。通过计算累计吸光度A 值（IA），得到巴曲酶组 VEGF 表达量为3975.00 ± 474.42，生理盐水组VEGF表达量为1854.50 ± 251.45，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）（图8,9）。
2.5激光多普勒血流仪测定新生血管
激光多普勒血流仪是利用激光多普勒原理，监测动物或人体组织微循环血流灌注量的一种设备。术后7天，分别测定大鼠皮瓣处血流，报告通用报告、百分比报告、PORH报告及频率报告等形式，观察新生血管处有效血流信号。巴曲酶组血液灌流量中端123.74±36.61 PU,显著低于生理盐水组血液灌流量中端92.50±75.30 PU，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）（图10.1,11）。
2.6 明胶-氧化铅血管造影
术后第7天，麻醉后先通过向大鼠一侧颈动脉注入0.9%生理盐水，同侧颈静脉放血排净大鼠体内血液，然后将预置的明胶+氧化铅灌注液（100ML/kg）缓慢注射入颈动脉，当观察到大鼠巩膜及四肢末端色泽变成造影剂颜色后停止注射。灌注成功后将大鼠冷藏12-24小时，使明胶凝集，最后将大鼠背部皮瓣及周围皮肤解剖，平铺行X线摄影(图10.2)。
通过上述实验对比数据可知，巴曲酶可以促进皮瓣处的血流微循环，增加血供，促进新生血管的增生，从而提高缺血随意皮瓣的存活率。