一种脱细胞异体真皮基质及在口腔疾病中的应用的制作方法

本发明属于生物医用材料的组织工程技术领域，具体是一种脱细胞异体真皮基质在唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、牙龈退缩修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防方面的应用。

背景技术：

口腔黏膜缺损修复主要采用局部邻近转移黏膜瓣、颊脂垫瓣、游离皮肤移植等，等自体组织修复，虽然易于成活，但也存在一些缺陷：对自体的供区和受区的功能与外形的影响，愈合后会导致术后明显瘢痕畸形；二期修复，手术创伤大，需在机体其他部位切取移植组织，且常引起供区不同程度的功能障碍及并发症，引起患者痛苦和病程等负面影响。

拔牙术，是一种常见的口腔外科手术，适用于多生牙、智齿阻生等牙齿疾病。拔牙后局部牙槽骨发生改建和吸收，骨量减少，导致后期临床修复效果不佳，如何减少和预防拔牙后牙槽骨的吸收以及拔牙后并发症一直是口腔颌面外科医生关注的热点。

脱细胞异体真皮基质补片，取自人类异体的片状或膜状组织，是通过脱细胞技术，对生物真皮进行生物和化学处理，完全脱除各种可被宿主识别的、能够引起免疫排斥反应的细胞成分，如果移植用的皮肤是含有细胞的，那么移植后内皮细胞的免疫反应可能导致血管收缩、组织缺血和组织变性坏死，一旦经过脱细胞处理，将人体组织变成没有细胞的基质与支架，这种材料就会产生免疫惰性，因此不会发生免疫排斥反应，同时完整地保留了细胞外基质成分及其三维空间框架结构。

中国发明专利CN1562388A将人的异体或哺乳类物的膜状或片状组织经脱细胞处理成具有三维空间结构的细胞外基质，具体方法为：从人或哺乳类动物体上取所需膜状组织或片状组织；将获得的组织用戊二醛和/或甲醛固定；用碱性溶液对组织进行脱细胞处理；用缓冲液对组织进行洗涤，获得细胞外基质；将细胞外基质在氨基酸溶液中进行孵育。然而，用戊二醛和/或甲醛固定，因戊二醛或甲醛具有胞毒性，导致了使用它们进行交联的生物组织在植入人体后，在一定程度上影响了受体正常组织的生长，进而影响伤口的愈合和功能的恢复；采用的碱性溶液对组织进行脱细胞处理，尤其是氢氧化钠或氢氧化钾是强碱，会造成脱细胞异体真皮基质中的胶原蛋白在碱性条件下水解。

基于以上缺陷，研究一种安全无毒、脱细胞异体真皮基质完整的，能够用于唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、牙龈退缩修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防方面的脱细胞异体真皮基质或口腔补片具有实际意义。

技术实现要素：

为了适应唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、牙龈退缩修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防方面手术需要，提供合适的口腔补片材料，本发明经过酶处理、表面活性剂超声处理、DNA降解处理等多步骤协同操作，发明制备了一种新的脱细胞异体真皮基质材料，并将其制作成口腔补片，用于上述疾病的预防或治疗。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种脱细胞异体真皮基质的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将异体皮原料投入酶溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；所述酶为磷脂酶，或者所述酶为磷脂酶和蛋白酶；

步骤二，将半成品A取出，用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品B；

步骤三，将半成品B投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品C；

步骤四，将半成品C用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品D；

步骤五，将半成品D投入盛有DNA水解酶溶液的容器中，振荡处理，得半成品E；

步骤六，将半成品E用生理盐水浸泡，振荡处理，得半成品F；

步骤七，将半成品F用注射用水清洗浸泡，得成品G；即为脱细胞异体真皮基质；可以直接作为口腔补片使用或用作制备口腔补片的材料。

一般地，可将上述方法制得的脱细胞异体真皮基质保存于生理盐水中；为延长其保存期，也可进行灭菌处理(例如辐照灭菌)。

为便于上述脱细胞异体真皮基质的储存及运输，延长其有效期，进一步地，上述方法还包括以下步骤：

步骤八，将成品G取出，包装，灭菌，得成品H；或者将成品G取出，置于含有冻干保护剂的溶液中进行冷冻干燥；包装，灭菌，得成品H。

进一步地，步骤一中所述蛋白酶包括胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶(中性蛋白酶，分散酶)等中的一种或多种。

在某些实施方式中，前述步骤一中的酶为磷脂酶、或磷脂酶与胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶中的一种或多种。进一步地，所述酶溶液pH值为7.0-8.0。优选地，磷脂酶浓度为0.1g/L-0.4g/L，和/或所述蛋白酶(或其中胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶任一种)的浓度为0.1g/L-0.3g/L。更进一步地，所述磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D的一种或多种，优选磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D的质量比为1:1:1:1。

在某些实施方式中，前述步骤一振荡处理条件为振荡0.5-4小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。

在某些实施方式中，前述步骤三所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的SDS(十二烷基硫酸钠)，或所述表面活性剂溶液中含有0.1-0.3g/L的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)。进一步地，超声浸泡条件为：40-80KHz，100-400W，温度为1-20℃，超声3-8分钟，浸泡2-4小时，重复2-4次。

在某些实施方式中，前述步骤五中所述DNA水解酶溶液的浓度为4-8g/L，pH7.0-8.0；优选浓度为4-6g/L。

在某些实施方式中，前述步骤五中振荡处理条件为振荡2-8小时，振荡转速为10-200rpm，温度为10-40℃。

在某些实施方式中，所述步骤二、步骤四、步骤六振荡处理条件为振荡1-2小时，振荡转速为80-150rpm，更换生理盐水，继续振荡处理，重复该操作4-6次，温度为1-5℃。

在某些实施方式中，所述步骤七注射用水清洗浸泡条件为振荡2小时，振荡转速为80-150rpm，温度为1-5℃，更换注射用水，继续振荡处理，重复该操作4-6次。

在某些实施方式中，步骤八所述冻干保护剂溶液包括磷酸盐缓冲液、透明质酸和糖，其中透明质酸的浓度为0.4-0.8mg/100mL，糖的浓度为10-20mg/100mL，所述糖为海藻糖、乳糖、蔗糖、甘油、甘露醇、山梨醇、甘露糖、葡萄糖等中的一种或几种。所述磷酸盐缓冲溶液(PBS)可按本领域常规方法配制，优选为10mmol/LpH 7.0磷酸盐缓冲液。

所述冷冻干燥步骤具体为：将成品G于5℃进箱，保持1小时，降温到-40℃并保持1小时，升温到-18℃并保持1小时，再次降温至-35℃保持1小时，启动真空泵，将干燥箱真空度抽到5-10Pa；用2小时将隔板升温到-30℃，干燥箱真空度抽到1-5Pa，维持15h；用1小时将隔板升温到0℃，并维持10h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；用1小时将隔板升温到10℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；用0.5小时将隔板升温到25℃，并维持8h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30Pa。

在某些实施方式中，前述步骤八的包装为将成品G装入包装袋中，封口包装完毕；所述灭菌为钴-60照射，照射剂量为20-30kGy。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实例。

本发明还包括上述方法制备的脱细胞异体真皮基质(也可称做口腔补片)。

本发明制备的脱细胞异体真皮基质的缝合强度为16N-18N。

所述脱细胞异体真皮基质(口腔补片)在使用前需先进行如下操作：20℃-35℃生理盐水中完全浸泡(复水)15分钟。

可以根据实际需要将上述脱细胞异体真皮基质制成适当的尺寸。

本发明还包括上述脱细胞异体真皮基质在制备治疗口腔损伤的修复材料中的应用。

所述口腔损伤包括：唇裂、牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、牙龈退缩修复、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症。

本发明异体皮原料来源于自愿捐献者(例如非活体)的皮肤。

本发明脱细胞异体真皮基质的保存条件为阴凉干燥处，相对湿度小于等于45％。

本发明另一方面提供一种用于口腔修补的试剂盒，含有前述的脱细胞异体真皮基质(口腔补片)。所述试剂盒，还可以进一步包含手术刀、手术剪、止血钳、镊子、缝合针、可吸收手术线、含注射用水的安瓿瓶、注射器等。

本发明根据唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、牙龈缺损、牙龈退缩修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防等手术的需要，改进和优化了脱细胞异体真皮基质的制备工艺。该产品是将人体捐献体的皮肤，经过特殊的生物技术处理，将组织中可引起宿主免疫排斥反应的所有细胞清除掉，同时完整地保留与原有组织结构相同的细胞外基质；并根据需要，通过冷冻干燥处理，使其更便于储存和运输。通过对该产品不断地深入研究发现，由于在去除免疫排异反应成分的同时，完整地保留了原有组织的立体支架结构，作为细胞支架，它具有诱导组织生成的作用，在植入人体后能被人体组织细胞识别为自体组织，很快有新生血管和成纤维细胞长入，引导细胞沿其胶原框架有序生长，达到补充、特别是快速修复的目的，它具有良好的组织相容性和力学性能，能够长期存在，成为人体组织的一部分，从而完成了对组织缺损的修复和重建。

本领域使用脱细胞异体真皮基质进行手术时，例如需要进行牙龈缺损修复手术时，需要在局部麻醉下进行牙龈翻瓣术，手术创面彻底止血，取略大于缺损面的脱细胞异体真皮基质，生理盐水浸泡冲洗，中央剪1-2个小切口以利引流，以粗糙面贴附于创面，补片边缘与创缘间间断缝合，留长线；缝合完毕后，利用所留长线将碘仿油纱布反包扎加压，使补片与创面紧贴。这需要提高缝合密度，以满足手术的需要，因此需要脱细胞异体真皮基质口腔补片具有较高的缝合强度；且为了满足病人术后舒适度，同时需要脱细胞异体真皮基质口腔补片具有一定的柔软度，以使脱细胞异体真皮基质口腔补片在补入人体后无异物感。

本发明脱细胞异体真皮基质或口腔补片能够唇裂和/牙槽突裂、腭裂、口腔黏膜缺损修复、鼻腔黏膜修复、牙种植手术、牙龈缺损或退缩修复、根分叉病变修复、阻生牙拔除后干槽症等并发症的预防等手术需求。本发明通过酶处理、表面活性剂溶液超声处理联合进行脱细胞，能够达到很好地脱细胞效果，且对真皮基质的损伤较小，有利于提高组织产品机械性能，获得较好的弹性和韧性，提高组织的撕裂、缝合强度，且有助于DNA水解酶处理步骤中除去真皮基质中残留的DNA，降低了细胞毒性和排斥反应。

综上，本发明的脱细胞异体真皮基质或口腔补片作为口腔修复材料具有以下优点：(1)就产品性能来说，本发明的脱细胞异体真皮基质或口腔补片是经过工艺改进的产品，产品的机械性能适用于手术，缝合强度16N-18N。(2)就产品效果来说，本发明的脱细胞异体真皮基质或口腔补片具有无免疫排斥反应、快速诱导组织再生、植入后质地柔软、无轮廓感、体内相容性好、稳定的支架或模版作用。

附图说明

图1为病例1患者手术前图片；

图2为病例1患者手术中选取脱细胞异体真皮基质规格图片；

图3为病例1患者手术后3个月随访图片；

图4为病例2患者手术过程图片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1脱细胞异体真皮基质的制备方法

将异体真皮原料投入浓度为0.3g/L磷脂酶和0.1g/L胰蛋白酶溶液中，酶溶液pH值为7.0，温度为37℃，100rpm振荡2小时，更换一次酶溶液，重复此过程一次，得半成品A；磷脂酶为磷脂酶A1：磷脂酶A2：磷脂酶C：磷脂酶D按照质量比为1:1:1:1的混合物。

将半成品A取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，振荡转速为80rpm，温度为2℃，得半成品B。

将半成品B投入到含有0.2g/LTritonX-100溶液中，50KHz，220W，超声5分钟，浸泡3小时，重复此过程3次，得半成品C。

将半成品C取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得半成品D。

将半成品D投入到盛有浓度为5g/L，pH为7.0的DNA水解酶溶液中，温度为37℃，振荡处理4小时，振荡转速为20rpm，得半成品E。

将半成品E投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得半成品F。

将半成品F投入盛有注射用水的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得成品G。

将成品G取出，装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy，取出，终得成品H。缝合强度为17.7N。

实施例2脱细胞异体真皮基质的制备方法

将异体真皮原料投入浓度为0.2g/L磷脂酶和0.2g/L胰蛋白酶溶液中，酶溶液pH值为7.0，温度为37℃，100rpm振荡2小时，更换一次酶溶液，重复此过程一次，得半成品A；磷脂酶为磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C和磷脂酶D按照质量比1:1:1:1的混合物。

将半成品A取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，振荡转速为80rpm，温度为2℃，得半成品B。

将半成品B投入到含有0.2g/LSDS溶液中，10mMEDTA，50KHz，220W，超声7分钟，浸泡2小时，重复此过程3次，得半成品C。

将半成品C取出，投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡1小时，振荡转速为100rpm，温度为4℃，得半成品D。

将半成品D投入到盛有浓度为7g/L，pH为7.0的DNA水解酶溶液中，温度为30℃，振荡处理3小时，振荡转速为30rpm，得半成品E。

将半成品E投入盛有生理盐水溶液的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡1小时，振荡转速为100rpm，温度为4℃，得半成品F。

将半成品F投入盛有注射用水的容器中用生理盐水浸泡，振荡3次，每次振荡2小时，温度为2℃，振荡转速为80rpm，得成品G。

将成品G取出，置于冻干保护剂溶液中；于5℃进箱，保持1小时，降温到-40℃并保持1小时，升温到-18℃并保持1小时，再次降温至-35℃保持1小时，启动真空泵，将干燥箱真空度抽到5-10Pa；用2小时将隔板升温到-30℃，干燥箱真空度抽到1-5Pa，维持15h；用1小时将隔板升温到0℃，并维持10h后，测定压力升，直至压力升小于1pa；用1小时将隔板升温到10℃，并维持10h，测定压力升，直至压力升小于1pa；用0.5小时将隔板升温到25℃，并维持8h，测定压力升，直至压力升小于1pa；整个干燥过程中前箱真空度不应高于30Pa；得半成品G1。

所述冻干保护剂溶液由10mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液、透明质酸和海藻糖组成，其中透明质酸的浓度为0.6mg/100mL，海藻糖的浓度为10mg/100mL。

将半成品G1取出，装入包装袋中，铺平，封口，进行钴-60照射，照射剂量为20-30kGy,取出，终得成品H。缝合强度为16.8N。

实验例1脱细胞异体真皮基质(口腔补片)用于牙龈缺损手术

病例1

李某，男，59岁，左上切牙和右上切牙牙龈缺损，缺损面积最大1.0cm×0.8cm，最小为0.2cm×0.1cm，于局部麻醉下进行牙龈翻瓣术，手术创面彻底止血，取略大于缺损面的实施例1制备的脱细胞异体真皮基质，生理盐水浸泡冲洗，中央剪2个小切口以利引流，以粗糙面贴附于创面，补片边缘与创缘间间断缝合，留长线。缝合完毕后，利用所留长线将碘仿油纱布反包扎加压，使补片与创面紧贴。术后10天打开碘仿包，拆除缝线，见补片基底面点状红润区，颜色不均匀，边缘轻度水肿，术后15天水肿消退。术后随访3个月创面无炎症，颜色均匀与对侧牙龈相近，补片外翻边缘平整，患者无异物感。实验结果见图1-3。

病例2

刘某，女，47岁，左3、4尖牙牙龈缺损，缺损面积约0.1cm×0.1cm，于局部麻醉下进行牙龈翻瓣术，手术创面彻底止血，取略大于缺损面的实施例2制备的脱细胞异体真皮基质，生理盐水浸泡冲洗，中央剪1个小切口以利引流，以粗糙面贴附于创面，补片边缘与创缘间间断缝合，留长线。缝合完毕后，利用所留长线将碘仿油纱布反包扎加压，使补片与创面紧贴。术后10天打开碘仿包，拆除缝线，见补片基底面点状红润区，颜色不均匀，边缘轻度水肿，术后15天水肿消退。术后随访3个月创面无炎症，颜色均匀与对侧牙龈相近，补片外翻边缘平整，患者无异物感。实验结果见图4。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。